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F- s_p e c i f i c R NA c o l i p ha _ge s a r e _p r ev a l e n t i n s e w a _ge a nd o t h e r f e c a l w a s t e s o f hu ma ns an d a n i ma l s . T he r e a r e f o u r a n _{t i g} en i c a _{l l y} d i s t i n c t s e r o _gr o u_p s o f F " RNA c o l

i

_{p h} a _ge s a n d t h o s e _p r e dom i n a t i n _g i n hu man s

(

_gr o u _p s I I a n d I I I

)

d i f f e r f r om t ho s e _pr e dom i n a t i n_g i n an i ma l s

₍

_gr o u_p s I a n d I V

)

. H en c e , i t ma y b e po s s i b l e t o d i s t i n gu i s h b e t w e e n huma n a nd a n i ma l w a s t e s b y s e r o _{t y p i} n _g F^ R NA c o _{l i p h} a _ge i s o l a t e s . Be c a u s e s e r o _{t y p}

i

n _g r e _qui r e s s c a r c e an t i s e r um r e a _g en t s , w e i n v e s _{t i g}a t e d _g en o _{t y p i} n _g o f F^ R NA c o l i p h a _ge s u s i n _g s _yn t he t i c o l i go n u c l e o t i d e _pr o b e s a s an a l t e r n a t i ve a_{p p} r o a c h t o d i s t i n _gu i s h i n _g t he s e f o u r _gr o u _p s . O l i go p r ob e s I , I I , I I I , I V, A , a n d B, w e r e s e l e c t e d t o de t e c t gr o u p I , I I , I I I , I V , I + I I , a n d I I I + I V p h a ge s , r e sp e c t i v e l y . Me t h od s f o r p l a _qu e t r a n s f e r on t o c an

d

i da t e memb r a n e f i l t e r s a n

d

f i x a t

i

o n o f _ge n o m i c n u c l e i c a c i d o n t he memb r a n e s we r e o _{p t i m i} z e d . T he o l i go_p r ob e s w e r e e n d l ab e l l e d u s i n_{g d i g}o x _{i g} en i n , f o l l o w ed b y DN A - _{RN A} h y b r i d i z a t i o n a nd c o l o r i me t r i c , i mmu n o en z _{y m}a t i c d e t e c t i o n . Of 2 0 3 c o n f i r me d i s o l a t e s o f F " R NA c o l i p h a _ge s i n en v i r o n men t a l s a m_{p l} e s o f w a t e r , w a s t e s , sh e l l f

i

s h a n_d an _{i m}a l f e c e s , 9 9 . 5 a nd 9 6 . 6 % c o u l d b e i d e nt i f i e d i n t o e a c h _gr o u _{p b y} s e r o _{t y p i} n _g an

d

_g en o _{t y p i} n _g .

r e s _p e c t i v e l y . Pr o b e s A & B c o r r e c t l y i d en t i f i e d 1 0 0 % o f i s o l a t e s . Fo r e a c h gr o up

(

I , I I , I I I , I V

)

, s e r o t y p i n g i d e n t i f i e

d

3 7 , 1 1 6, 3, a n d 4 6 i s o l a t e s a n d ge n o t y p i n g i d e nt i f i e d 3 7 , 1 0 9, 4, a n d 4 6 i s o l a t e s , r e sp e c t i v e l y . Ba s e d o n t h e s e r e s u l t s _, t h i s me t ho d f o r _ge no t y_p i n _g F^ R NA c o l i p h a _ge s a_{p p} e a r s t o b e _pr a c _{t i} c a l a nd r e l i ab l e f o r i d e n_{t i f y i} n _g i s o l a t e s i n f i e l d s a_{m p l} e s .

ACK N O WLE DG E M E NT S I wo u l d l i k e t o t ha n k D r . Ma r k D . So b s e y f o r h i s gu i d an c e a n d su _{p p}o r t t hr o u _{g h}o u t _{m y} s t u_{d y} a t t h e D e_p a r t me n t o f En v

i

r o n me n t a l Sc i e nc e s an

d

En _{g i} n e e r i n _g . I am a l s o gr a t e f u l t o D r . P f a en de r f o r h i s t i me a nd p o s i t i v e c r i t i c i sm d ur i n g t h e pr ep a r a t i o n o f t h i s r e_po r t . A s _p e c i a l t ha n ks i s d e s e r v e d b y Dr . Y . S . Ca r o l S h i e h f o r h e r i n v a l u ab l e a s s i s t a n c e a n d t e c hn i c a l su _{p p}o r t . An d a l s o t ha n ks Dr . J . v a n Du i n f o r h i s k i n dn e s s t o g i v e o l i go n uc l e o t i d e s . I am i nde b t e d t o Do u g Wa i t a n d _{m y} c o l l e a _gu e s f o r t he i r u s e f u l he l p a nd f r i en dsh i p _, e s_{p i} c a l l y f o r Da v i d A . B a t t i ge l l i f o r h i s a i d i n d i s cu s s i n_g a n d _p r o o f r e a d i n _g t h i s r e_p o r t . F i n a l

_l

_{y ,} I a _{p p}r e c i a _t e m_y f am i l y a n

d

w i f e , C ho

i

-I o k Wo n _g , w i t ho ut wh o s e s u p p o r t a nd e n c o u r a gem en t t h i s s t u d y w o u l d b e d i f f i c u l t t o r e a c h .

TAB LE O F C ON T EN T S AB S T RAC T i i AC K N O W L E D G E M E N T S i i i TAB L E O F CONT E N T S i v L I ST OF F I G URE S v i i L I ST OF TAB L ES v i i i I . I N T R ODU C T I ON 1 I I . OB JE CT I V E S 4 I I I . L I T E RAT U R E REV I E W 1 . Ou t b r e a k s o f F o o d b o r n e an d Wa t e r b o r n e V

i

r a l D _i s e a s e s 5 A . He p a t i t i s V i r us e s 6 B . N o r wa l k V i r u s a n d No r w a l k -l

i

ke V i r u s e s 7 C . O t he r E nt e r i c V i r u s e s 8 2 . Fe c a l I nd i c a t o r s 9 2 . 1 Ba c t e r i a l I n d i c a t o r s 9 A . Co

n

f o r ms 9 B . C l o s t r

i

d

i

um p e r f r

i

n g e ns 1 1 C. E n t e r o c o c c i 1 1 D. B i f i d ob a c t er i um sp p . a n d B a c t e r oi de s sp p 1 2 2 . 2 Ba c t e r i o p h a ge I n d i c a t o r s 1 3 A . Co l i p ha ge s 1 3

C. F " R N A c o l i p h a _ge s 1 4 3 . S e r o t y p i n g a n d Ge n o t y p i n g 1 5 3 . 1 Se r o t y p i n g o f F ^ R NA c o l i p h a _ge s 1 5 3 . 2 Ge no t y p i n g 1 9 A . Se qu e n c e An a l ys i s 1 9 B . Re s t r i c t i o n Fr a g me n t Len g t h Po l y mo r p h i sm A s s a _y 2 0 C. H y b r i d i z a t i o n 2 1 I V . M A T E R I A L S A N D M E T H O D S 2 4 4 . 1 F ^ R NA Co l i p h a _ge s an d t h e H o s t 2 4 4 . 2 Pr ep a r a t i o n o f En v i r on me n t a l Sa mp l e s 2 4 4 . 3 I s o l a t i o n o f F ^ R N A c o l i p ha _ge s f r o m En v i r o n men t a l S am_{p l} e s 2 5 4 . 4 Se r o t y p i n g o f F " R NA Co l i p ha _ge s 2 6 4 . 5 P l a que - _{t r a n s f e r a n d F i x a t i o n f o r H} y b r i d i z a t i o n . 2 7 4 . 5 No n r a d i o a c t i v e Ol i go n u c l e o t i d e L a b e l i n g 2 8 4 . 6 Hy b r

i

d i z a t i o n Con d i t

i

o n an d De t e c t i o n 2 9 4 . 7 D a t a Ana l ys i s 3 0 V . Re su l t s 3 1 5 . 1 E f f i c i e n c y o f P l a qu e Tr a n s f e r

/

Fi x a t i o n b y T h r e e De n a _t u r i n g So _l u t i o n 3 1 5 . 2 E f f i c i e n c y o f P l a qu e Tr a n s f e r Us i n g F i v e F i l t e r s _{3 2}

5 . 3 H y b r i d i z a t i o n Co n d i t i o ns 3 3 5 . 4 S p e c i f i c i t y o f Pr o b e s 3 4 5 . 5 P h a ge I s o l a t e Pur i f i c a t i o n an d M i x e d Pha g e P l a _qu e s 3 5 5 . 6 Se r o t y p i ng 2 0 3 Fi e l d I s o l a t e s 3 7 5 . 7 Ge n o t y p i ng 2 0 3 Fi e l d I s o l a t e s 3 8 5 . 8 Com p a r i s o n o f Ge n o t y p i ng a nd Se r o t y p i n g f o r 2 0 3 F i e l d I s o l a t e s 3 8 V I . D I S C U S S I O N 5 3 V I I . C O N C L U S I O N S 6 1 V I I I . R E F E R E N C E S 6 3

L I ST OF F I GUR ES F i gu r e 1 . P l a qu e h y b r i d i z a t i o n o f F " RN

A

c o l i p h a _g e s

(

M S 2 an d GA

)

f i xe d _{b y} 3 d en a t u r i n _g me t ho ds 4 1 F_{i g}u r e 2 . P l a que h y b r i d i z at i o n o f F " R NA c o l i p h a _ge s

(

Q

(

3

, F I a nd SP

)

f i x e d b y 3 d e n a t u r i n g me t h o d s 4 2 F i gu r e 3 . P l a que h y b r i d i z a t i o n o f F " R NA c o l i p h a _ge s i n 5 f i l t e r s t e s t e d w i t h _p r o b e s I a nd I I 4 3 F i gu r e 4 . P l a que h y b r i d i z a t i o n o f F " RN A c o _{l i p h} a _ge s i n 5 f i l t e r s t e s t e d w i t h p r o _b e s I I I a n d I V . . . 4 4 F i gu r e 5 . P l a que h y b r i d i z at i o n o f 5 F ^ R NA c o l i p h a _g e s t e s t e d w i t h _pr o b e I V a t d i f f e r e n t t em p e r a t u r e s 4 5 F_{i g}u r e 6 . P l a que h y b r i d i z a t i o n f o r de t e em i n i n g t h e s _p e c i f i c _{i t y} o f 6 _p r ob e s , a n d f o r c l a s s i f y i n g 5 i s o l a t e s f r om e n v i r o nmen t a l s am_{p l} e s 4 6 F i gu r e 7 . P l a que h y b r i d i z a t i o n o f t h e i d e n t i f i c a t i o n o f 2 5 F^ RN A c o l i p ha _ge i s o l a t e s f r om ch i c ke n f e c e s 4 7 F i gu r e 8 . P l a qu e h y

b

r i d i zat

i

o n o f 1 2 F " R N A c o l

i

_{p h} a _g e i s o l a t e s f r o m c _{h i} c ken f e c e s 4 8

L i s t o f T ab l e s T a b l e 1 . F " R NA c o _{l i p h} a _ge _gr o u_p s a nd Se r o t y p e s 1 6 T a b l e 2 . D i s t r i bu t i o n p a t t e r n o f F " R NA c o _{l i p h} a _ge s i n an i ma l an d hu man s o u r c e s 1 7 T a b l e 3 . D i s t r i bu t i o n p a t t e r n o f F " R NA c o _{l i p h} a _ge s i n w a s t e w a t e r a n d o _ys t e r s 1 8 Ta b l e 4 . Nu c l e o t i de s e qu e nc e s of o l

i

go me r s u s e d f o r p r ob i n _g F ^ R NA c o l i p h a _ge s 4 9 T a b l e 5 . T h e r e su l t s o f p l a qu e h y b r i d i z a t i o n t e s t e d w i t h 4 o l

i

_go _p r ob e s a t d i f f e r en t t e_{m p} e r a t ur e s 5 0 T a b l e 6 . C l a s s i f i c a t i o n o f 2 0 3 F * RNA c o l i p h a _ge s f r om e n v i r o nmen t a l s a_{m p l} e s _{b y} s e r o t y p i n _g a nd g en o _{t y p i} n _g 5 1 Tab l e 7 . Su mma r y o f c l a ss i f i c a t i o n o f 2 0 3 F " RNA c o l i p ha _g i s o l a t e s b y s e r o t y p i n _g a n

d

_g en o _{t y p i} n _g 5 2

Wa t e r a n d f o o d c o n t ami na t e d _{b y} f e c e s ma _y c o n t a i n a gr e a t va r i e _{t y} o f _g a s t r o - i n t e s t i n a l

(

e nt e r i c

)

v i r u s e s , w h i c h a r e ma

j

o r a _gen t s o f f o o d- and w a t e r - b o r n e o u t b r e a k s o f ga s t r o e n t e r i t i s

₍

6 9

)

a n d o t h e r d i s e a s e s s u c h a s i n f e c t i o u s h e_p a t i t i s

₍

4 1

₎

. I n f a c t , t h e a p pa r en t i n c r e a s e i n o u t b r e a ks o f v i r a l _ga s t r o e nt e r i t i s h a s b e e n a t t r _{i bu t} e d t o c o n t am i n a t i o n o f w a t e r a n d f o o d

(

2 3

)

, pa r t i c u l a r l y i n o ut b r e a ks o f i n f e c t i o us h e_p a t i t i s v i r u s e s

₍

4 2 , 5 4 , 6 2

)

an d N o r w a l k v i r u s _ga s t r o e nt i t i s

₍

9, 5 0

)

. Mo n i t o r i n g t h e v i r o l o _{g i} c a l _qu a l i t _y o f w a t e r a nd f o o d wo u l d b e u s e f u l ; h o we v e r , mo n i t o r i n g f o r e n t e r i c v i r u s e s i n w a t e r a nd f o o d i s d i f f i c u l t a l o w a nd ex_p e n s i v e a nd s o me e _{p i d}em i o l o _{g i} c a l l y i m p o r t a n t e nt e r i c v i r u s e s a r e u n c u l t u r a b l e o r i ne f f i c i e n _{t l y} c u l t u r e d . Fo r t h i s r e a s o n _, t h e r e i s a n e e d t o f i n d r e l i a b l e i n d i c a t o r s f o r de t e c t i n _g f e c a l c o n t a m i n a t i o n c o nt a i n i n _g e n t e r i c v i r _us e s a n d o t h e r _pa t ho _ge n s i n w a t e r _, s he l l f i sh an d o t h e r f o o d s . Be c a u s e no c on s i s t en t a n d r e l i ab l e r e l a t i o n s _{h i p} s b e t w e en f e c a l i n d i c a t o r b a c t e r

i

a

₍

f e c al c o l

i

f o r ms

)

a nd e n t e r i c v i r _us e s ha ve b e e n demo n s t r a t e d

(

3 1

)

, e n t e r i c b a c t e r i o_{p h}a _ge s h a v e b e en r e c omme nde d f o r t h e r o l e o f e n t e r i c

v i r u s i n d i c a t o r s

(

1 7

)

. F -s_p e c i f i c

(

F "

)

RNA c o l i p ha _ge s ma _y b e _go o d i n d i c a t o r s f o r mon i t o r i n _g t he v i r o l o _{g i} c a l qu a l i t y o f w a t e r a n d f o o d b e c a u s e t h e _y s u_p e r f i c i a l l y r e s e mb l e e n t e r o v i r u s e s , c a l i c i v i r u s e s , and h e pa t i t i s A v i r u s . T he y a l s o a r e c o n s i s t e n _{t l y p} r e s en t i n a v a r i e t y o f w a s t ew a t e r s , s u f f i c i en _{t l y p} e r s i s t e n t i n t he en v i r o n me n t

(

2 1 a n d 2 2

₎

, a n d r e s i s t a n t t o t r e a t me n t _p r o c e s s e s t o b e a c c e_{p t} a b l e i n d i c a t o r s . I n f a c t , o n e pr o t o t y p e F * RN A c o l i p ha _ge , MS2 , ha s b e en sh ow n t o b e v e r _{y p}e r s i s t e nt i n wa t e r an d s he l l f i sh a n d mo r e r e s i s t an t t o d i s i n f e c t i o n _{b y} u l t r av i o l e t i r r a d i a t i o n , c h l o r i n e d i o x i d e a n d mo no c h l o r am

i

n e t r e a t me n t t ha n o t h e r a _ge n t s , i nc l u d i n g h ep a t i t i s A v i r u s , e n t e r o v i r u s Co x s a c k

i

e v i r u s B 5 , E c o l l , a n d K l eb s

i

e l l a p n e umo n

i

a e

(

5 a nd 8

)

. F' R N A c o l i p h a _ge s a r e c om pr i s e d o f s e r o _gr o u_p s I t hr o u _{g h} IV . S t r a i n s

i

s o l a t e d f r om hu man f e c e s a r e u s ua l l y gr o u _p s I I an d I I I , wh i l e gr o u p s I a n d I V a r e u su a l l y f o u nd i n a n i ma l f e c e s

₍

4 3

₎

. Th e r i s k o f v i r a l ga s t r o e n t e r i t i s a n d h e_p a t i t

i

s i n h uma n s f r om i n _ge s t i o n o f f e c a l l y c o n t a m

i

n a t e

_d

w a t e r a n d f o o d i s c o ns i d e r ed h i g h e r f r o m human f e c e s t h an f r o m a n i ma l f e c e s , s i n c e e n t e r i c v i r u s e s f r o m an i ma l s o u r c e s do n o t c a u s e h uma n i l l n e s s

₍

2 7

₎

. H e nc e _, de t e r m i n i n g t h e s ou r c e s o f f e c a l c o n t am i n a _{t i} o n i s i m_p o r t an t . Se r o t y p i n g F ^ R NA c o l i p h a _ge s ma _y h e l p d i s_{t i} n _gui sh h uma n f e c a l c o n t a m i n a t i o n f r om an i ma l f e c a l c o n t am i n a t i o n . Ho w e v e r , a n t i s e r a f o r t h e F^ RN A c o l i p h a _ge s a r e n o t r e a d i l y a v a i l a b l e

a n d s o me i s o l a t e s a r e d i f f i cu l t t o s e r o t y p e . So me i s o l a t e s ha v e b e e n f o u nd t o b e n e u t r a l i z e d b y t w o h e t e r o l o _go u s a n t i s e r a

(

1 0 a n d 1 4- 1 6

)

. He n c e , i n t h i s s t u d y , we de v e l o p e d a mo r e s_p e c i f i c a n d a c c e s s i b l e me t ho d o f _gr o _{up i} n _g F^ R NA c o _{l i p h} a _g e s _{b y} n u c l e i c a c i d h_{y b} r i di z a t i on u s _{i n g} o l i go n u c l e o t

i

de s _p r o be s an d c o m_p a r e d t h i s me t ho d w i t h s e r o t y p i n _g .

OBJECT I VES 1 . D ev e l o p a mo l e c u l a r t e c hn i que

(

gen o t y p i ng

)

f o r t y p i n g F " R NA c o l i p h a _ge s - _S e l e c t o l i go n u c l e o t i d e s o n t h e b a s i s o f h omo l o _{g y} w i t h e a c h gr o u _{p p h} a _ge a n d t e s t f o r t h e i r s_p e c i f i c i t y a nd s e n s

i

t i v _{i t y} . - _{Op t i m i z e} p l a _qu e h y b r i d i z a t i o n c o n d i t i o n s a n d _p r o c e du r e s , i n v o l v i n _g de n a t u r i n _g s o l ut i o n s _, t y p e s o f me mb r a n e s _, h y b r i d i z a t i o n s o l ut i o n s , a nd h y b r i d i z a t i on t em p e r a t u r e s t o a c h i ev e a d e _qu a t e d e t e c t i o n l i m i t s . 2 . Se r o t y p e an d gen o t y p e o r i g i na l f i e l d i s o l a t e s

(

u np ur i f i e d

i

s o l at e s

)

o f F^ R N A c o l i p ha _g e s -Te s t i s o l a t e s f r om a _g a r _{p l} a t e s w i t ho u t _pu r i f i c a t i o n

b

e f o r e s e r o t y p i n g a nd gen o t y p i n _g t o s_p e e d u _p an d s i m p l i f y d e t e c t i o n _pr o c e du r e s . - _Ev a l u a t e _gen o t y p i n _g a nd c om_p a r e w i t h s e r o t y p

i

n _g . 3 . D

i

s t

i

n gu

i

sh b e t w ee n a n i ma l f e c e s a n

d

huma n f e c e s f r o m e n v i r o n me n t a l s am_{p l} e s b y _gr o u _{p i} n _g F ^ RN A c o l i p h a _ge s .

1 . O u t b r e a k s o f f o o d - _b o r n e an d wa t e r b o r n e v i r a l d i s e a s e s T h e o v e r a l l s i gn i f i c a n c e o f v i r a l a _ge n t s t o t h e r i s k o f f o o d- b o r ne an d w a t e r b o r n e v i r a l _ga s t r o en t e r i t i s i s _p o o r l y qu a nt i f i ed du e t o t h e l a c k o f s u r v e i l l a nc e , a n d t h e u n d e r e s t i ma t i on o f ou t b r e a ks o f v i r a l _g a s t r o en t e r i t i s c au s e d i n _p a r t b y t h e l a c k o f s i m p l e r o ut i n e t e chn _{i q}u e s t o d e t e c t a n d c on f i r m t h e v i r a l e t i o l o _{g y} . Fe c a l c o n t am i n a t i o n o f d r i n k i n _g , b a t h i n g an d i r r i ga t i o n w a t e r s , r aw sh e l l f i sh a n d o t h e r f o o d s _, i n c l u d i n _g t ho s e c o n t am i n a t e d b y i l l f o o d ha n d l e r s i s r e s _p o n s i b l e f o r i n c r e a s i n _g o u t b r e a k s o f v i r a l g a s t r o e n t e r i t i s

₍

2 3

₎

. T he hu ma n e n t e r i c v i r u s e s , w h

i

ch c o m p r i s e mo r e t h a n 1 0 0 d i f f e r en t v i r u s e s , a r e c o n s i de r e d a s ma

j

o r c a u s e s o f f o o d- bo r n e a n d w a t e r bo r n e v i r a l ga s t r o e n t e r i t i s . Th e y t y p i c a l l y i n f e c t t h e c e l l l i n i n g o f t h e a l i me n t a r _y t r a c t a n

d

a r e e x c r e t e d i n l a r _ge amo u n t s f r om t he f e c e s o f i n f e c t e d _pe r s on s

(

4 8

)

. The v i r u s e s mo s t l y o f t en _{i m p l i} c a t e d i n w a t e r b o r n e a nd f o o d b o r n e d i s e a s e a r e h ep a t i t i s A v i r u s , e n t e r i c N o n A - _N on B h e_p a t i t i s v

i

r u s , sma l l , r o u n d , st r u c t u r e d ga s t r o en t e r i t i s v i r u s e s , No r w a l k a gen t a nd Sn ow Mo u n t a i n a ge n t , r o t a v i r u s es .

c a l i c i v i r u s e s , a s t r o v i r us e s an d pa r v o v i r u s e s t h a t a r e r e s _po n s i b l e f o r r e c o _gn i z e d w a t e r - bo r n e a n d s he l l f i s h -a s s o c i a t ed v i r a l i l l n e s s e s

₍

6 5

₎

. A . H ep a t i t i s v i r u s e s Wa t e r b o r n e an d sh e l l f i s h bo r n e o u t b r e a ks o f he _p a t i t i s A h a v e b e en do c u me n t e e d a nd t h e _y c o n t i n u e t o o c c u r i n t he USA an d t he r e s t o f t h e w o r l d . I n No v emb e r 1 9 8 2, u s e o f u n t r e a t e d w a t e r f r om a s i n _{g l} e s _p r i n _g c au s e d 7 3 c a s e s o f h e p a t i t i s A i n Me a de Co u n _{t y} , Ke n t u c k y

(

7

)

. I n t h e U S A , f r o m 1 9 8 3 t o 1 9 8 7 , h e p a t i t i s A r a t e s i n c r e a s e d f r om 9 . 2 c a s e s

/

1 0 0 , 0 0 0 p o pu l a t i o n t o 1 4 . 4 c a s e s

/

1 0 0 , 0 0 0 . He p a t i t i s A r a t e s o c cu r r e d i n ma l e s t h r o u_{g h} w a t e r b o r n e w e r e c on s i s t e n _{t l y} 2 0 % h i g h e r t h an i n f ema l e s . 4 2 % o f o ut b r e a ks o f h e p a t i t i s A h a d u n kn o w n r i s k f a c t o r , an d o n l y 3 % w a s c o n f i r me d t o a s s o c i a t e w i t h f o o d o r wa t e r

(

5 4

)

, I n C h i n a _, h e p a t i t i s A v i r u s c a u s e d a h u_g e o u t b r e a k i n Sh an _{g h} a i b e t we e n J a n u a r _y an d Fe b r u a r _y , 1 9 8 8

(

1 8, 5 7 a n d 6 8

)

. A t l e a s t 3 0 0_, 0 0 0 c a s e s o f a c u t e h ep a t i t i s w e r e r ep o r t e d i n t wo mo nt h s , a n d t h e y w e r e c o n f i r me d a s be i n _g a s s o c i a t e d w i t h c o n s um p t i o n o f r aw c l ams . He _p a t i t i s A v i r u s w a s i s o l a t e d f r om c l ams c o l l e c t e d f r o m t h e ma r ke t an d s e a b e d , w h i ch w a s a p p a r e nt l y s e r i o u s l y c o n t am i n a t e d b y s ew a _ge . N on - A , n o n - _{B he} p a t i t i s

(

H e_p a t i t i s E

)

i s r e s_p o n s i b l e f o r o u t b r e a k s o f he _pa t i t i s t h r ou _{g h} f e c a l c o n t am i na t i o n o f

d r i n k i n_g w a t e r , a n d i s w i d e sp r e a d i n t he I nd i a -a s i a n r e g i o n s , A f r i c a , a nd La t i n A me r i c a

(

4 7

)

. I n Ch i n a , 9 h e_p a t i t i s E o u t b r e a ks ha v e b e e n do cu me n t e d s i n c e 1 9 8 2 , o f wh i c h f i v e w e r e a s s o c i a t e d w i t h w a t e r an d f o u r w e r e a s s o c i a t e d w i t h f o o d . Th e y o c c u r r e d i n 6 d i f f e r e n t p r o v i n c e s a nd t he _y i n f e c t e d l a r _g e n u mb e r s o f _p e o _{p l} e

(

7 1

₎

. A l s o , i n no r t h e r n E t h i o p i a , a n o u t b r e a k o f a cu t e h e p a t i t i s E i n f e c t i o n f r o m w a t e r c a u s ed 4 2 3 i l l n e s s e s amo n _g m i l i t a r _y me n . Th e o u t b r e a k w a s s e r o l o g i c a l l y co n f i r me d a s H E V . Pr o t e c t i o n o f w a t e r s u_{p p l i} e s f r o m f e c a l c o nt am i n a t i o n _{b y} ch l o r i na t i o n , b o i l i n g , a n d h y g i e ne e duc a t i o n w e r e r e c o mme n d e d t o c o n t r o l he _p a t i t i s E _t r a n sm i s s

i

o n

(

6 2

)

. T h e l a r _g e s t r e_p o r t e d e _{p i d}em i c o f h e _p a t i t i s E v i r u s , wh i c h i n f e c t e d ab o u t 7 9, 0 9 1 p e r s o n s i n Ka n p ur , I nd i a , o c c u r r e d f r om De c e m

b

e r 1 9 9 0 t o A p r i l 1 9 9 1 . Fe c a l c o n t am i n a t i o n o f r i v e r w a t e r a nd i n a d e _qu a t e ch l o r i n a t i o n o f w a t e r i n a r e s e r v o i r w er e c o n s i d e r e d t o c au s e t h i s o u t b r e a k

₍

4 2

)

. B . N o r w a l k vi r u s a nd No r w a l k - _{l i k e v i r u s e s} N o r w a l k v i r u s an d No r w a l k- l i k e v i r u s e s a r e ma

_j

o r c a u s a t i v e a _ge nt s f o r huma n vi r a l _ga s t r o e n t e r i t i s , a n d ma n y o u t b r e a k s h av e b e en r e _po r t e d

(

2 3

)

. Th e N o r w a l k -l i k e SRSVs a r e n o w kn o w n t o b e c a l

i

c i v i r us e s . Be t w e e n Ma y 1_, 1 9 8 2 a nd De c e mb e r 3 1, 1 9 8 2 , t h e r e w e r e 1 0 3 w e l l - do c umen t e d o u t b r e a ks a s s o c i a t e d w i t h e a t i n _g r a w sh e l l f i s h i n New Yo r k S t a t e . N o r wa l k v i r u s w a s t h e _p r e dom i n an t e t i o l o _{g i} c a _g e n t o n t h e

b a s i s o f s _{y m p t} oms o f t he i l l n e s s , s e r o c o n ve r s i o n , a n d t h e p r e s en c e o f I _{g M} a n t i b o d y t o N o r w a l k v i r u s i n s e r a o f a f f e c t e d _p e r s o n s . C l am an d o y s t e r s am p l e s f r om 2 o f t h e s e o u t b r e a k s w e r e c o n f i r m ed t o be c o n t am i n a t e d _{b y} N o r w a l k v i r u s t h r o u _{g h} r a d i o i mmu no a s s a _y

(

3 4

)

. Se c o nd a r y t r a n sm i s s i o n o f N o r w a l k v i r u s a l s o o c c ur e d . A f o o d h an d l e r r e c o v e r i ng f r o m i l l n e s s t r an sm i t t e d No r w a l k v i r u s t o _p o t a t o a n d f r u i t s a l a ds , c o l e s l a w , a n d t o s s e d s a l a d t h a t c a u s e d v i r a l ga s t r o en t e r i t i s i n 2 2 0 _p e r s o n s i n 1 9 8 2

(

6 7

)

. O t he r w a t e r bo r ne a n d sh e l l f i sh b o r ne o u t b r e a ks a r e do c ume n t e

d

. Se w a _ge - c o n t am i n a t e d r i v e r w a t e r c au s e d a l a r _ge o u t b r e a k o f ga s t r o en t e r i t i s a t a c a r av a n pa r k i n s ou t h e r n New So ut h Wa l e s i n 1 9 8 9 . A 2 7 - _{2 8 n m sma l l r o u nd s t r u c t u r e d v i r u s}

(

N o r w a l k- l i ke v i r u s

)

wa s i de n t i f i e d a s a c a u s a t i v e a _ge n t

(

3 2

₎

. Co n su m p t i o n o f r a w o ys t e r s h a s c a u s e d a n um b e r o f o u t b r e a k s o f _ga s t r o e nt e r i t i s a r o u n d t h e w o r l d t h a t w e r e l i n ke d t o N o r w a l k- l i ke v i r u s e s

(

2 9, 6 0 a n d 5 0

)

. I n

Q

u e b e c _, Ca na d a _, mo r e t h a n 2 0 0 _pe o _{p l} e w e r e i n f e c t e d w i t h a N o r wa l k -t y p e v i r u s a f t e r e a t i n _g r aw o _ys t e r s i n 1 9 9 1 . Lo w l ev e l s o f f e c a l c o l i f o r ms w e r e de t e c t e d i n t h e o _ys t e r s , a n d a N o r w a l k -l i ke v i r u s w a s i de n t i f i e d b y d i r e c t e l e c t r o n m i c r o s c o _{p y} o f f e c a l s am p l e s f r om a cu t e l y i l l _p e r s o n s . C . O t h e r en t e r i c vi r u s e s I n a d d i t i o n t o t h e h e_p a t i t i s v i r u s e s a n d t h e No r w a l k -t y p e S R S Vs , e n t e r o v i r u s e s , a de no v i r u s e s , r o t a v i r us e s .

r e o v i r u s e s , a n d a s t r o v

i

r u s e s a r e a l s o en t e r i c v i r u s e s . O u t b r e a k s o f v i r a l _ga s t r o e n t e r i t i s b y t h e s e v i r u s e s ma _y n o t b e a s f r e _qu en t a s t h o s e b y N o r wa l k v i r u s , No r w a l k - _{l i ke} v i r u s e s , a nd h e p a t i t i s v i r u s e s , bu t t h e y a r e s t i l l a t h r e a t t o _pub l i c h e a l t h t h r o u _{g h} f e c a l o r a l t r an sm i s s i o n . Se v e r a l o u t b r e a k s o f r o t av i r u s _ga s t r o e n t e r i t i s h a ve b e e n r e _p o r t e d . I n s o u t h e r n I s r a e l , a t t a c k r a t e s o f 7 2 % a nd 5 6 % w e r e r e _po r t e d i n t w o s e qu e n t i a l o u t b r e a ks o f ga s _t r o en t e r i t i s a s s o c i a t e d w i t h r o t a v i r u s a nd c on f i r me d b y r o t av i r u s -s_p e c i f i c s e r um I _gG , T h e a ge - _s p e c i f i c mo r b i d i t y r a t e i n c r e a s e d w i t h d e c r e a s i n _g a _ge i n b o t h ou t b r e a k s

₍

1 3

₎

. I n s o me o u t b r e a k s t w o o r mo r e vi r u s e s ma _y b e i n v o l v e d . R o t a v i r u s e s an d a s t r o v i r u s e s w e r e de t e c t e d f r om a n o ut b r e a k o f v i r a l _ga s t r o e n t e r i t i s i n a _p s _ych i a t r i c ho s_{p i t} a l . T h e du r a t i o n a nd s _{y m p t} oms o f i l l n e s s b y a s t r o v i r u s i n f e c t i o n w e r e s ho r t e r an d m i l de r t h an _{b y} r o t a v i r u s , bu t t h e i n f e c t i o n r a t e o f a s t r o v i r u s w a s h i g h e r t ha n t h a t o f r o t a v

i

r u s

(

3 6

)

. A l t ho u _{g h} mo s t ep i de mi c s o f r o t a v i r u s _ga s t r o e n t e r i t i s a r e du e t o _gr o u_p A , a f i v e - me mb e r f a m i l y f e l l i l l w i t h v i r a l g a s t r o e nt e r i t i s c a u s ed b y _gr o u p C r o t a vi r u s i n F i n l a n d

(

3 8

)

. 2 . F e c a l i n d i c a t o r s 2 . 1 B a c t e r i a l i n d

i

c a t o r s A . Co l i f o r ms Co

n

f o r ms u su a l l y r e f e r t o a _gr o u _p o f b a c t e r i a

10 b e l o n _{g i} n _g t o t h e E n t er ob a c t er i a c e a e wh i c h f e r men t l a c t o s e a n d a l s o s ha r e o t he r _p r o _pe r t i e s . Th e y c o m p r i s e s ev e r a l ge n e r a , i n c l u d i n g Es ch e r

i

ch

i

a ^ K l eb s

i

e l l a ^ En t e r ob a c t e r , Se r r a t i a _, a n d Ci t r ob a c t er . T o t a l c o l i f o r ms ma y n o t b e go o d f e c a l i n d i c a t o r s , s i n c e K l eb s i e l l a , Ci t r ob a c t e r , a n d Se r r a t

i

a a r e no t e x c l u s i v e l y i n t e s t i n a l f l o r a an d t he _y e x i st w i de l y i n t he n a t u r a l en v i r o n me n t . Ci t r ob a c t e r n o r ma l l y c a n be f o u n

d

i

n f r e sh v e _get a

b l

e s . Fe c a l c o l i f o r ms ar e mo r e a s s o c i a t e d w i t h f e c a l c o n t am i n a t

i

o n du e t o t h e e x c l u s

i

o n o f no n f e c a l c o l i f o r ms b y i n c r e a s i n _g t he i n c u b a t i o n t e m p e r a t u r e . I n _ge n e r a l , wh e n c o n t am i n a t i o n i s o f f e c a l o r i g i n , E . c ol i s t r a i n s a r e _pr e dom i n an t a nd ma _y c om p r i s e 9 0 % o f t h e t o t a l c o l i f o r ms

(

2 6

)

. F o r t h e s e i n d i c a t o r s _, t h e r e l a t i v e n um b e r s i n s a m p l e s a r e c o n s

i d

e r e

d

i

m po r t a n t

b

e c a u s e t h e _p r e s e n c e o

f

t he s e m i c r o o r _ga n i sms i n w a t e r _, a i r _, s o i l an d o n v e _ge t a b l e s a n d ha n d s c an s o me t i me s b e de t e c t e d a s a ba c k gr o u nd t h a t i s n o t s t r i c t l y r e l a t e d t o f e c a l c o n t am i n a t

i

o n . Ho w e v e r _, mo n i t o r i n _g f e c a l c o l i f o r ms i n w a t e r s _pr o b ab l y i s i n s u f f i c i e nt t o i nd i c a t e t h e _p r e s e n c e o f v i r u s e s . Fo r e x a_{m p l} e _, o ut br e a k s o f vi r a l _ga s t r o e n t e r i t

i

s i n F l o r i d a i n N ov . 1 9 9 3 w e r e a s s o c i a t e d w i t h c o n sum p t i o n o f r a w o y _s t _{e r s} w h i c h a_{p p} a r e n _{t l y m}e t t h e f e c a l c o l i f o r m s t an d a r d f o r s h e l l f i s h

₍

3 3

₎

. E . c o l i i s c o n s i de r e d a mo r e r e l i a b l e f e ca l i nd i _{c a} t _{o r}

du e t o i t s _p r i ma r _y h ab i t a t i n t h e i n _t e s t i n a l t r a c t o f ma n _y w a r m- b l o o d e d a n i ma l s . H ow e v e r , t he r e a r e s e ve r a l d i s a dv a n t a _ge s f o r E . c o l

l

t o b e a f e c a l i nd i c a t o r i n w a t e r . F i r s t _, i t i s l e s s r e s i s t a nt t h a n s o me b a c t e r i a l _p a t ho _ge n s , e n t e r i c v i r u s e s a n d _p r o t o z o an c _y s t s i n w a t e r . S e c o n d , i t ma _y b e a n a t u r a l i nh ab i t a n t o f _{p h y l l} o s _{p h} e r e i n t h e t r o _{p i} c s . Th i r _{d , i t} c a n n o t d i s t i n _gu i sh b e t w e en hu man a nd a n i ma l f e c a l c o n t am i n a t i o n . Th i s l a st c r i t e r i o n i s i m p o r t a n t b e c a us e hu man f e c a l c on t a m i n a t i o n i s a _g r e a _t e r r i s k t o hu ma n he a l t h f r o m v i r u s e s an d s ome o t h e r _p a t ho _gen s . B . C l o s t r

i

d

i

um p er f r

i

ng en s A l t ho u _{g h} C l o s t r i d i um _p er f r i n_g en s i s b e l i e v e d t o b e o n _{l y} f r o m f e c e s , i t ma y be n o t a go o d f e c a l i n d i c a t o r o f r e c e n t c o n t a mi n a t i o n b e c a u s e i t i s e x t r eme l y _p e r s i s t en t i n t h e en v i r o nmen t du e t o i t s s_p o r e - f o r mi n _g a_{b i l i t y} . Ho w e ve r , t h e s i z e o f t h e s _po r e s a n d t h e i r _gr e a t r e s i s t an c e s u _{g g}e s t t h a t t h e _y ma _y b e _go o d i nd i c a t o r s o f _p r o t o z o a n c _y s t s . Cl o s t r i d i um _p e r f r i n _ge ns _pr o b a_{b l y} do n o t d i s t i n _gu i sh b e t w e en h u ma n a n d a n i ma l f e c a l c o nt am i n a t i o n . C. E n t e r o c o c c i E n t e r o c o c c i o c cu r i n t h e huma n a n d a n i ma l i n t e st i ne ; t h e _y u s u a l l y c a n _gr ow a t e x t r eme c on d i t i on s

₍

1 0° C an d 4 5° C , i n 6 . 5 % N a Cl , an d pH 9 . 6

)

. Th e y w e r e c o n f i r me d t o b e b e t t e r

i n d i c a t o r s t h a n f e c a l c o l i f o r ms f o r sw i mm i n _g a s s o c i a t e d ga s t r o e n t e r i t i s an d f o r w a t e r bo r n e d i a r r he a l d i s e a s e f r o m dr i n _g w a t e r

(

4 a n d 4 0

)

. En t e r o c o c c u s f a e c a l

i

s w a s f o u n d t o p r e dom i n a t e i n hu ma n a n d _p o u l t r _{y f} e c e s , but E n t e r o c o c c u s d ur a n S f E n t e r o c o c c u s h i r a e , a nd En t e r o c o c c u s f a e c i um w e r e n o t a s s o c i a t e d w i t h a n _y f e c a l s o u r c e

(

4 5

)

. He n c e _, t he i r s_p e c i f i c i t y t o d e t e c t f e c a l c o n t am i n a t i o n ex c l u s i ve _{l y} i s u n c e r t a i n . D. B

i

f

i

d ob a c t er

i

um sp p . an d Ba c t e r o

i

de s s p p . Bi f i d ob a c t er

i

um s_{p p} . a r e t he c ommo n f l o r a o f t h e ga s t r o i n t e s t i na l t r a c t i n h uma n , p i gs , o r o c c a s i o na l l y i n c a t t l e a nd s he e _p . B . b r e v e a nd B . a do l e s c e n t i s a r e e x c l u s i v e l y a s s o c i a t e d w i t h human f e c e s . Ho w e v e r , B i f i do b a c t e r i um s_{p p} . do no t s ur v i v e w e l l i n w a t e r _, c om p a r e d w i t h f e c a l c o l i f o r ms , a n d t h e de t e c t i o n o f B . b r e ve a nd B . ad o l e s c e n t

i

s i s n o t s

i

m_{p l} e b e c a u s e t he _y a r e a n a e r o be s a n d r e _qu i r e s_p e c i a l i z e d me d i a f o r _gr o w t h . T h e y a r e n o t a s w i de _{l y} u s e d f o r f e c a l i n d i c a t o r s a s f e c a l c o l i f o r ms an d E . c o l

i

. Ba c t e r o

i

d e s s_{p p} . a r e t he s e c on d l a r ge s t gr ou p o f o r _ga n i sms i n t h e huma n i nt e s t i n a l t r a c t , bu t t h e y a l s o c a n b e f o u n d i n t h e r u me n o f c a t t l e a n_{d i} n t he mo u t h a nd i nt e s t i n a l t r a c t s o f hu man s a n d o t he r an i ma l s . B e c a u s e t he y a r e s t r _i c t an d f a s t i d

i

o u s an a e r o b e s , t h e y a r e v e r y d i f f i cu l t

t o de t e c t i n en v i r o n men t a l s a_{m p l} e s . H e nc e , t h e y ma y n o t b e h i g h l y s _pe c i f i c f o r d e t e c _{t i} o n o f hu man c o n t am i n a t i o n . 2 . 2 B a c t e r i o p ha ge i n d i c a t o r s A . Co l i p ha ge s Co _{l i p h} a _ge s a r e c o n s i de r e d _go o _d f e c a l i n d i c a t o r s f o r s e v e r a l r e a s o n s :

₍

1

)

t h e _y c an b e d e t e c t ed f r o m t h e f e c e s o f hu ma n s a nd o t h e r w a r m- b l o o d ed an i ma l s _;

₍

2

)

t he _y a r e w i de _{l y}

d

i s t r i b u t e d i n s ew a _ge an d sew a _ge - _po l l u t e d w a t e r s ;

(

3

₎

t h e _y a r e mo r e r e s i s t a nt i n t h e e n v i r o nmen t a nd t o t r e a t me n t p r o c e s s e s t ha n b a c t e r i a l i n d i c a t o r s _;

₍

4

)

an d d e t e c t i o n a n d e n ume r a t i o n o f c o l i p h a _ge s i s s

i

_{m p l} e _, r a _{p i d} a nd i n e x p e _{n s} i v e b y a _{p l} a _qu e a s s a _y

₍

1 7

)

. Un f o r t u n a t e l y , t h e r e l i a b i l i t y o f c o l i p h a _ge s a s i n d i c a t o r s f e c a l c o n t am i n a t i o n ma _y b e qu e s t i o n a b l e du e t o t h e i r h e t e r o _ge n i e _{t y} , v a r i a b l e d e t e c t i o n u s i n _g d i f f e r e nt h o s t c e l l s , a nd l a c k o f c o r r e l a t i o n w i t h h uma n en t e r i c v i r u s l e v e l s

(

6 3

)

. B . B . f r a g

i

l i s p h a ge s B . f r a g i l i s p h a ge s ha ve b e e n r ep o r t e d a s p o t en t i a l f e c a l i n d i c a t o r s . A bo u t 1 0 % o f hu man f e c e s t e s t e d w a s f o u n d c o nt a i n i n _g B . f r a g

i

l i s p ha ge s _, w h i ch we r e n o t f o u n d i n f e c e s o f t h e o t he r a n i ma l s a nd i n u n_po l l u t e d w a t e r

(

5 8 a n d 5 9

₎

. A l s o , t he y w e r e p e r s i s t e nt i n t h e en v i r o n me nt a n d r e s i s t a n t t o d i s i n f e ct i o n t r e a _{t m}e n t

(

4 4

)

. B . f r a g

i

l

i

s p h a g e s su r v i v e d l o n _ge r _{t h}a n F* R N A c o l i p ha _g e s , p o l i o v i r u s , H A V, a nd

r o t a v i r u s e s i n w a t e r . H ow e ve r , i n o t h e r st u d i e s o n l y l o w t i t e r s o f B . f r a g i l

i

s p h a ge s we r e de t e c t e d i n e s t ua r i n e w a t e r a n d o _ys t e r s am_{p l} e s w he n c o m p a r ed w i t h F^ c o l i p h a _ge s

(

1 0

)

. H e n c e _, i t ma y b e d i f f i cu l t t o d e t e r m i ne r e c en t h uman f e c a l c o nt am i na t i o n a n d l ow l ev e l f e c a l c o n t am i n a t i o n u s i n _g B . f r a g

i

l i s p ha ge s a s i n d i c a t o r s . I t s e e ms t h a t B . f r a g i l

i

s p h a _ge s a r e h uma n - s _pe c i f i c f e c a l i n d i c a t o r s , b u t mo r e e x t e n s i v e r e s e a r c h o n t he d i s t r i b u t i o n o f B . f r a g

i

l

i

s p ha ge s i s ne e de d t o r e a c h a c o nc l u s i on . C. F ^ RNA c o l i p h a ge s F^ R N A c o l i p h a _ge s a r e a _g r o u_p o f c o l i p h a _g e s t h a t o n _{l y} a t t a c k ho s t c e l l s w i t h F- _{p i l i} . Th ey c a n b e d i v i d ed i n t o 4 s e r o gr o u _p s

₍

_g r o u_p I , I I , I I I , I V

)

b y n e ut r al i z a t i o n w i t h a n t i s e r a t h a t a r e s u mma r

i

z e d i n Ta b l e 1 . Gr o u p I an d gr o up I I b e l o n _g t o ma

j

o r _gr o u_p A du e t o a bo u t 5 0 % homo l o _{g y} i n t h e i r s e _qu en c e s ; gr o u_p s I I I a nd I V a r e c l a s s i f i e d a s ma

j

o r gr o u p B, a nd t h e i r s e qu en c e s sh ow a bo u t 4 0 % ho mo l o g y . A mo n _g sub gr o up s w i t h i n a _gr o u p , t he y sh o w mo r e t ha n 9 0 % h omo l o _{g y} i n s e _qu en ce s e x c e_{p t} su _{b g}r o u_p s i n _g r o u_p I V

₍

ab o u t 7 0 % h omo l o _{g y}

)

. Se ve r a l F * R N A co l i p ha _g e s

h

a v e b ee n r e _po r t e

d

a s i n t e r me d i a t e s , w h i c h w i l l b e n eu t r a l i z e d b y t w o o r mo r e a n t i s e r a , l i ke p r o t o t y p e s J P 3 4 , M X l , a nd I D 2 . T h e d i s t r i bu t i o n o f F + R NA c o l i p h a _ge s i n en v i r o nme nt a l w a t e r s ha s b e e n s t u d i e d si nc e 1 9 7 3 . Ta b l e s 2 an d 3 sh o w t h e

s e r o _g r o u_p s o f F* R NA c o l i p h a _ge s i n hu ma n a n d a n i ma l f e c e s a n d w a s t e w a t e r s . C l e a r l y , o n l y gr o u p s I I a n d I I I w e r e f o u nd i n h u ma n f e c e s an d gr o u_p s I a n d I V w e r e d e t e c t e d i n a n i ma l s o u r c e s w i t h t h e e x c e_{p t i} o n o f _{p i g}s i n wh i ch gr o u p I I a l s o w a s d e t e c t e d . Wi t h t h i s e x c e p t i o n , i t s ho u l d b e p o s s i b l e t o d i s t i n _gu

i

sh be t w e e n hu ma n a nd a n i ma l f e c a l c o n t am i n a t i o n . F u r t h e r mo r e , t h e w i d e d i s t r i bu t i o n an d h i g h l e v e l s o f F ^ R NA c o l i p h a ge s i n w a s t e w a t e r s and a t l e a s t s o me e n v i r o n me n t a l s am p l e s ma k e t h em _po s s i b l e f e c a l i nd i c a t o r s . A s_p e c i f i c h o s t c e l l . Sa l mo ne l l a t y p h

i

m ur i um

(

WG 4 9

)

, h a s

b

e e n c o n st r u c t e d b y i n s e r t i n _g a n E . c o l l F -p l a sm i d i n t o a Sa l mo n e l l a t y p h i mur i um s t r a i n

(

WG 4 5

)

, b y Ha v e l a a r a n d co l l e a _gu e s i n 1 9 8 4 . Us i n g t h

i

s ho s t c e l l _, mo r e t ha n 9 0 % o f t h e _{p h} a ge s de t e c t e d i n s e wa ge w e r e F^ R NA c o l i p h a g e s . Mo r e o v e r , s oma t i c Sal mo n e l l a p h a ge s w e r e d e t e c t e d a t l e s s t h an 1 0 _{p f} u

/

m l _{b y h}o s t WG 4 9 ho s _t c e l l an d c o n s i t u t e d < _{5 % o f} t h e t o t a l _{p h} a _ge s de t e c t e d . 3 . Se r o t y p i n g a nd Ge no t y p i n g 3 . 1 Se r o t y p i n g F ^ RN A c o l i p ha _g e s S e r o l o _{g i} c a l n eu t r a l i z a t i o n w i t h a nt i b o d i e s i s a c o n v en t i o n a l me t ho d t o s e r o l o _{g i} c a l l y _gr o u_p a n d i d en _{t i f y} o r ga n i sms . Fo r s er o t y p i ng F ' R N A c ol

i

_{p h} a_ge s , i s o l at e s w e r e n e ut r a l i z e d w i t h e a ch _gr o u _p o f a n t

i

s e r um _{b y} s _p o t t e s t s o n

T a b l e 1 . F " R N

A

Co l

i

_{p h} a _g e Gr o u _p s a n

d

Se r o _{t y p} e s Ma

_j

o r _g r o u_p Gr o u _p Pr o t o t y p e S t r a

i

n s

A

I M S

2

_, f

2

_, R

1 2

_, J P

5 0 1

A

I I G

A

, S D, T H

l

, B Z

1 3

, K U

l

, J P

3

4 B I I I

Q

₃

, V K , S T , T W

1 8

B I V S P, F I , T W

1 9

, T W

2 8

, M X l , I D 2 So u r c e : P h a _g e Ec o l o_{g y}

T ab l e 2. D i s t r i bu t i on Pat t e rns o f F * R NA Co l i p ha _ges i n Ani ma l a n d H uman So u r c e s So u r c e s R NA c o l _{i p h}a_ge _po s i t i ve Ma t e ri a l # o f s am p l e # o f s t r a i ns Se r o _gr o u_p I I I I I I V Re f B i rd s Fowl s Mamma l s H o r s e s Co ws Co w s Ca t t l e Ca l v e s P_{i g} s Ch i c ke n s Br o i l e r ch i c ken s She e _p H uma n s Fe c e s Fe c e s Fe c e s Fe c e s G I c o n t e n t Fe c e s Fe c e s Fe c e s Fe c e s Fe c e s G I c o n t e n t Fe c e s Fe c e s Fe c e s Fe c e s Fe c e s 1 4 0 0 5 1 4 0 5 1 8 0 10 3 3 8 9 2 2 2 0 1 8 6 0 0 3 1 4 0 5 0 0 48 1 56 1 3 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 0 0 0 9 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 7 0 0 0 2 0 0 0 0 1 8 0 54 1 3 3 9 10 2 6 1 1 1 1 1 1 3 2 1 2, 3 1 3 2 2 1 2 1 . F ur us e _, 1 9 8 7 2 . Ha ve l a a r , 1 9 8 6 3 . Ha ve l a a r , 1 9 90

T ab l i i i f A l i p h g i W y Co u n t r _y Ci t _y De ns i t _y N o . o f No . o f o f t o t a l _pha _ge s R NA c o l _{i p}ha _ge s t e s t e d _pha _ge s Se r o gr o u_p 1 I I I I I I V Re f Ra w Se w a_ge Me xi c o Sa ud i A r a b i a Aus t r a l i a U . S . B r a zi l P_{h i l i p p i} ne s F R G Ja_p a n Wa s t ew a t e r s D ome s t i c H o s_{p i t} a l P_{i g}- _{s l a u} g h t e C a l f - _{s l a u} gh t Po u t r _{y p} r o c e O_ys t e r s Ca _{m p}e c he Kah fu

_j

i S_{y d}n e _y Oa k l a n d (C_{A )} Ri c h mo n_{d (}C_{A )} Ne w Yo r k San El i

_j

o No r t h Ca r o l i n a Re c i fe Ma ni l a Wur zbur _g Sa _{p p}o r o , To k yo , F uku o ka Na ha r e r s s i n _g 5x 1 0^ 1 x 10^ 2 x 10' 10^- ₁₀ 5x 10' 2x 10^ 5x 1 0^ 3x 1 0=' 1 x 10= 5x 10= 1 0- _{1 0}* 3x 1 0= 8 4 3 7 0 198 5 2 4 8 2 8 1 2 1 2 2 33 5 8 32 4 3 7 0 2 2 9 0 0 1 0 1 5 4 51 4 5 7 1 08 4 3 1 7 1 832 5 6 2 9 2 6 4 9 1 7 3 9 2 1 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 4 0 1 7 2 2 1 0 1 5 5 3 8 4 2 2 0 0 10 52 0 4 5 1 83 0 0 0 4 8 7 0 1 0 1 1 0 0 1 1 9 6 0 0 0 10 2 5 1 0 6 1 1 2 5 6 2 2 3 0 2 5 2 0 1 3 1 4 0 1 1 2 2 2 2 2 3 1. F u ru s e , 1 9 8 7 2 . Ha ve l a a r , 1 9 9 0 3 . Chu ng , 1 9 9 3

ma l e ho s t s . An i s o l a t e w a s t y p ab l e i f i t w a s n e u t r a l i z e d o n _{l y b y} a h omo l o _go u s an t i s e r u m

(

n o _{p l} a _qu e o r z o n e o f _{l y}s i s a _{p p} e a r e d o n ho s t ce l l l a w ns

)

. A f t e r t h e sp o t t e s t s f o r pr e l i mi na r _y c l a s s i f i c a t i o n , e a ch c o n f i r me d i s o l a t e w a s s u_{b g}r o up e d b y _{p l} a t i n _g w i t h o r w i t ho u t a n t i s e r a

(

W at a n a be , 1 9 6 7

)

. D e s p i t e t he g en e r a l su c c e s s

i

n s e r o l o g i c a l l y g r o u _{p i} n _g F " RN A c o l i p h a ge s , t h i s me t h o d s o me t i me s g i v e s am b i gu o u s r e s u l t s b e c au s e t he r e a r e i n t e r me d i a t e _{p h} a _g e s t h a t do n o t f i t c l e a r l y i n t o t he f o u r w e l l kn o w n s e r o _gr o u _p s . Fo r e x am p l e , J P3 4 p h a ge w a s ne ut r a l i z e d b y b o t h a n t i - _{M S 2} s e r um a nd a n t i - _{G A s e r u m} ; M X l w a s n e u t r a l i z e d b y a n t i - _{SP an d a n t i}

-Q

(

3

s e r a ; an d I D 2 w a s n e u t r a l i z e d p a r t i a l l y b y e a c h a n t i s e r um

(

1 4 , 1 5 a nd 1 6

)

. 3 . 2 Ge n ot y p

i

ng R e c en _{t l y} , ge n o t y p i ng h a s b e e n s t ud i ed t o c l a s s i f y o r _g an i sms . N u c l e o t i de s e qu en c i ng _, t h e r e s t r i c t i o n f r a g men t l e n g t h p o l y mo r p h i sm a s s a _y

(

RFLPA

)

, a n d h y b r i d i z a t i o n t e c hn _{i q}u e s a r e t he on e mo s t l y c ommo n _{l y} u s e d f o r _ge no t y p i n _g o r _ga n i sms . A . Se qu e n c e a n a l ys i s Th e _p r _i n c i p l e o f s e _qu e nc e an a l ys i s f o r _ge no t y p i n _g i s t h a t t h e s i gn i f i c a nc e o f s e _qu e n c e va r i a t i o n amo n _g 5 ' -u n t r a ns l a t e d r e _{g i} o n s o r o t h e r r e _{g i} o n s c o u l d _p o s s i b l y b e u s e d

t o c l a s s i f y o r _ge n o t y p e o r ga n i sms . H ep a t i t i s C v i r u s i s o l a t e s f r om 6 2 _pa t i e n t s w e r e d i r e c t l y s e _qu e n c e d i n t h e i r 5 ' - _{u n t} r a n s l a t e d r e _{g i} o n s . T he s e i s o l a t e s t h e n w e r e c l a s s i f i e d i n t o t y p e 1

₍

5 5 %

₎

, t y pe 2

(

1 8 %

)

, t y p e 3

(

1 9 %

)

, a n d _{t y p} e 4

(

6 %

)

t hr o u _{g h} s e _que n c e a na l ys i s

(

3 0

)

. A r e c e n t m i n i r e o v i r u s c l i n i c a l i s o l a t e w a s s_{u g g}e s t e d t o b e a No r w a l k -l i k e v i r u s a n d s ho u l d b e i n c l u de d i n t he c a l i c i vi r i da e f am i l y b e c a us e i t h a s 5 2 % n u c l e o t i d e s e qu en c e i de n _{t i t y} w i t h No r w a l k v i r us s e _qu en c e

₍

3 5

₎

. Mo r e o v e r , t h i s ge no t y p i n g me t ho d i s a l s o v e r _y u s e f u l f o r i de nt i f i c a t i o n o f o r _ga n i sms f o r wh i c h s e_qu e n c e da t a i s no t a va i l ab l e . B . R e s t r i c t i o n f r a g me n t l en g t h po l y mo r p h i sm a s s a y

(

R FLPA

)

A r e s t r i c t i o n e ndo n u c l e a se c u t s a _p u r e D N A i nt o a c o n s i s t e n _{t l y} r e_p r o du c i b l e s e t o f f r a _{g m}e nt s t ha t c a n b e s e_p a r a t e d b y _g e l e l e c t r o_{p h}o r e s i s . D i f f e r e n t s o u r c e s o f D N A w i l l f o r m a u n _{i q}u e f r a _gme nt _pa t t e r n

(

RF LPA

)

a f t e r t r e a t me nt w i t h a r e s t r i c t i o n e nd on u c l e a s e du e t o i t s s i t e - s_p e c i f i c c l e a v a _ge . The r e f o r e , i t ma y b e p o s s i b l e t o d i s t i n gu i s h s e r o l o _{g i} c a l l y a n d he nc e _ge ne _{t i} c a l l y d i f f e r e n t o r _ga n i sms b y t h i s me t h o d . Fo r e x am p l e _, a f t e r c l e a v a ge o f t o t a l D NA o f S t a_{p h y l} o c o c c u s a u r e u s b y an Ec o R I r e s t r _i c t i o n e n z _{y m}e , ge l e l e c t r o _{p h} o r e s i s _{. S}o u t he r n t r an s f e r , a n d h y b r i d i z a t i o n w i t h a r a d i o l a be l e d 1 6S r R NA _p r o b e w e r e _pe r f o r me d t o c ha r a c t e r i z e S t a_{p h y l} c o c c u s a u r e u s i s o l a t e s f r om o u t b r e a k s

₍

3 9

₎

. A

r e s t r i c t i o n f r a g me nt l e n _{g t h p} o l y mo r _{p h i} sm a s s a _y w a s c a r r i e d t o a n a l yz e r e ve r s e - t r a n s c r i b e d an d P C R - am p l i f i e d r o t a v i r u s ge n e s e _{g m}e n t 9 f o r d i f f e r e n t i a t i on o f h uma n s e r o t y p e 3 r o t a v i r u s e s f r o m a ni ma l s e r o t y p e 3 r o t av i r u s e s . T h e r e s u l t s s ho w t h a t t h e r e s t r i c t i on f r a _{g m}en t l en _{g t h p}o l y mo r _{p h i} sm a s s a _y i s a u s e f u l me t ho d t o d i s t i ngu i sh amo n g i n t e r s _p e c i e s o f r o t a v i r u s e s

₍

6 4

₎

. I n an o t he r ap p l i c a t i o n , r R NA ge n e r e s t r i c t i o n _p a t t e r n s

(

r i b o t y p i n g

)

w a s u se d f o r d i f f e r e n t i a t i o n o f Sh i ge l l a f l e x n er i s t r a i n s

₍

1 1

₎

. I n t h i s s t u d y, H i n d i ! I w a s t h e b e st en do nu c l e a s e t o p r o du c e a n o _{p t i m}um d

i

ge s t i on _p a t t e r n f o r d i f f e r en t i a t i n _g S h

i

_ge l l a s t r a i n s . R F L PA ma y be u s e f ul i n ep i de m i o l o g i c a l s t u d i e s w he n c o m p a r e d w i t h s e r o t y p i n _g b e c a us e o f i t s _p o t en t i a l l y h i g h d e _gr e e o f s_p e c i f i c i t y i n ch a r a c t e r i z i n _{g g} en t i c a l l y r e l a t e d o r _gan

i

sms . He n c e _, i t i s a p o t en t i a l l y p ow e r f u l t o o l f o r "mo l e c u l a r e _{p i d}em i o l o _{g y} " . C. H y b r i d

i

z a t i o n Pr o b e s f o r ge n o t y p i n _{g b y h y b} r i d i z a t i o n c o u l d b e o l i g o n uc l e o t i de s , o r a f r ag me nt o f D N A r ep r e s e nt i n g a s_p e c i f i c _ge n e ob t a i n e d b y c l o n i n_g o r PC R . I n ge n e r a l _, t a r _g e t n u c l e i c a c i d s f i x e d o n f i l t e r s a r e h y

b

r i d i z e d w i t h p r o b e s a n d t he n v i s u a l i z e d b y c o l o r i me t r i c , f l u o r e s c e n c e o r r ad i o a c t i v e d e t e c t i o n me t h o d s . Th i s t e c hn i qu e h a s b e e n e x t e n s i v e l y s t ud i e d i n r e c e n t _y e a r s du e t o i t s s i m p l i c i t y .

2 2 qu i c k n e s s , s e n s i t i vi t y , a nd s p e c i f i c i t y . Fo r ex am p l e , h y b r i d i z a t i o n t e s t s w i t h a s e t o f 4 D NA p r o b e s w a s c a _p ab l e o f c l a s s i f i n_g en t e r o t o x i ge n i c E . c ol l s t r a i n s p r o du c i n g h e a t s t ab l e t o x i n , o r he a t l ab i l e t ox i n , o r b o t h

(

4 6

)

. A l i qu i d -h y b r i d i z a t i o n a s s a _y sh ow e d t ha t i t wa s mo r e s en s i t i v e t h a n t h e E L I S A f o r t y p i n g t he V p 4 an d _{V p 7 g}e ne o f bo vi n e r o t a v i r u s e s

(

4 9

)

. O l i go n uc l e o t i de p r ob e s w e r e us e d t o t y p e hu ma n _gr o u _p A r o t a v i r u s , wh i c h w e r e sp e c i f i c f o r e a c h G t y p e o f h u ma n _gr o u _p A r o t a v i r u s . Th e a ut ho r po i n t e d o u t t h a t h y b r i d i z a t i o n c o u l d b e v a l u a b l e i n t y p i n g G t y p e s o f huma n g r o u_p A r o t a v i r u s du r i n _g va c c i n e t r

i

a l s

(

5 3

)

. Pr o b e s s e l e c t e d f r o m 5 ' -u n t r a n s l a t ed r e _{g i} o n s o f h e_p a t i t i s C v i r u s w e r e ab l e t o i de n_{t i f y} t he f o u r HCV _ge no t y p e s an d t h e i r su b t y p e s f r o m 6 1 P C R - _p o s i t i ve B r a z i l i a n HC V s e r a ; 3 3 % w a s i d e n t i f e d a s t y p e 1, 3 8 % a s t y p e l b , 1 . 5 % a s t y p e 2 a , an d 2 4 . 5 % a s t y p e 3

(

5 6

)

. Se _qu e nc e a na l ys i s ma_y b e u s e f u l f o r d i s t i n _gu i s h

i

n _g s e r o l o _{g i} c a l _{d i f f} e r e n c e s i n s om e o r _ga n i sms , bu t

i

t i s i m p r a c t i c a l t o s e r o t _{y p}e e a c h i s o l a t e f r o m f i e l d s am p l e s u s i n g s u ch c om p l i c a t e d , e x p en s

i

v e a n d t i me -c o n s u m i n _g p r o c e du r e s . A l t h ou g h R F L PA i s c o n s i de r e d a go o d _ge n o t y p i n_g me t h o d _, i t ma _y no t b e a b l e t o d i s t i n _gu i sh s o me s e r o _g r o u_p s o f o r _ga n i sms wh

i

ch ha v e a v e r _y h

i

_{g h} s e _qu e nc e h omo l o _{g y} . Mo r e o v e r _, Th i s me t ho d r e _qu i r e s t he t e s t i n _g o f s e ve r a l

r e s t r i c t i o n e n z _{y m}e s t o ob t a i n an o _{p t i m}u m d

i

_ge s t i o n _p a t t e r n . T h i s _p r o c e du r e w i l l t a ke t o o m u c h t i me f o r _p r a c t i c a l a n a l y s e s . H_{y b} r i d i z a t i o n w i t h o l i go _pr o b e s s e ems t o b e _p r a c t i c a l f o r _ge n o t y p i n_g f i e l d i s o l a t e s b e c a u s e o f i t s s i mp l i c i t _y , qu

i

c kn e s s , s e n s i t i v i t y an d sp e c i f i c i t y, c o m p a r e d w i t h s e _qu e n c e a n a l y s i s a nd R F L P A . I n t h i s s t ud y , we s e l e c t e d h y b r i d i z a t i o n t o _ge no _{t y p} e F ^ R NA c o _{l i p h} a _g e s o n t he b a s i s o f t h e s e s e v e r a l a dv a n t a _ge s .

2 M AT ERI

A

L S AN D ME T H O D S F* RN

A

c o _{l i p h}a _ge _{t y p}e s t r ai n s a nd t he h o s t . F

i

v e r e_p r e s en t a t i v e F ^ R N A c o l i p h a _ge s t r a i n s _, M S 2

(

gr o u _p I

)

, GA

(

I I

)

,

Q

p

(

I I I

)

, F I a n d SP

(

I V

)

w e r e k i n d l y g i v e n _{b y} Dr . F u r u s e

(

Jap a n

)

. Th e h o s t w a s a ge ne t i c a l l y c o n s t r uc t e d s t r a i n o f S a l mo n e l l a t_{y p h i} mu r i um, W G4 9 , c o n t a i n i n _g t h e E . c o l i p l a s m i d

(

F ' 4 2 l a c : : Tn 5

)

t h a t en c o de s p i l u s _pr o du ct i o n

(

2 0

)

. T h i s h o s t s t r a i n w a s gr o w n i n T Y G -b r o t h c o n t a i n i n_g 1 . 3 % t r y p t on e _, 0 . 1 % ye a s t e x t r a c t , 0 . 8 % N a C l , 0 . 1 % g l u c o s e , 0 . 0 3 % Ca C l ₂ 2 H 20 , 1 0 0 mg

/

1 n a l i d i x i c a c

i

d an d 2 0 m_g

/

1 kan am y c i n s u l f a t e . Br o t h c u l t u r e s we r e p r e p a r e d i n b a f f l e d sh a ke r f l a s k s o f me d i u m _{b y i} no cu l a _{t i} n_g w i t h ho s t c e l l s f r o m f r o z e n s t o c k a nd i n c u ba t i n _g w i t h s h a k i n _g a t 3 7° C o v e r n i g h t . P r e_p a r a t i o n o f e nv i r o n me n t a l sa _{m p l} es . T h e e n v i r o n men t a l s a_{m p l} e s u s e d i n t h i s s t u d y i n c l u d e d s ew a _ge , h u ma n a n d a n i ma l f e c e s , o y s t e r s a nd s e aw a t e r s a_{m p l} e s . S ew a ge s amp l e s w e r e su sp en de d i n o n e - _{t h i} r d v o l ume o f t r i c h l o r o t r i f l uo r o e t ha n e

(

Fr e o n

₎

, a nd w e r e vo r t e x e d v _{i g}o r o u s l y _f o r 2 m i n . T h e em u l s i o n w a s c e n t r i f u ge d a t 5 , 0 0 0 X _g f o r 2 0 m i n a t 5° C, and t he su p e r na t a n t w a s c o n c e n t r a t e d

3 0- _f o l d b y u l t r a f i l t r a t i o n

(

Me _ga f u _ge Cen t i f u _ge , Ba x t e r S c i e n t i f i c Pr o duc t s , He r a eu Sep a t e c h GmbH , Os t e o d e , Ge r man y

)

u s i n _g YM I OO me mb r a n e s

₍

Ami c o n , Da n v e r s , MA

)

. F e c a l s am p l e s we r e d i l u t e d t en f ol d i n _{p h}o s_{p h} at e bu f f e r ed s a l i n e

(

P BS

)

su_{p p l} eme n t e _d w i t h 0 . 2 % T we en 8 0 a nd 1 5 % g l yc e r o l . S am p l e s w e r e v o r t ex e d r a_{p i d l y} a n d c en t r i f u_ge d a t 5 , 0 0 0 x g f o r 2 0 m i n t o s e d i me n t s o l i d s . F ^ R NA c o l i p h a _ge s w e r e e x t r a c t e d f r o m o _y s t e r s _{b y} h omo _ge n i z

i

n_g i n a n Om n i - _{m i x} e r

(

So r v a l l

₎

w

i

t h a n e _qu a l amo u n t

(

w

/

v

)

o f n u t r i e nt br o t h c o n t a i n i n_g 0 . 5 % T w e e n 8 0 , a n d t h e n c e n t r i f ug i n g a t 5 , 5 0 0 x g f o r 2 0 m i n t o r e c o ve r t h e s u _pe r n a t a n t

(

8

₎

. I nf e c_{t i v i t y} a s s a_y o f F* R N

A

c o_{l i p h} a_ges i n e nv i r o nme n t a l s am p l e s . F ^ RN A c o l i p h a _ge s _pr e s e n t i n t h e e n v i r o n me n t a l s am p l e s o f f e c e s , s ew a ge an d o y s t e r e x t r a c t w e r e de t e c t e d b y i n f e c t

i

v i t y a s s a _y u s i n_g WG 4 9 ho s t l aw n s f o r t h e d ou b l e a _ga r l a _y e r

₍

DAL

)

p l a _que a s s a _y t e chn _{i q}u e

₍

2

₎

. F " R NA c o l i p h a _g e s p r e s en t i n w a t e r s am p l e s w e r e c o n c en t r a t e d a nd _qu an t i f i e d b y a d i r e ct memb r a n e f i l t r a t

i

o n me t ho d

(

5 5

)

. On e hu n

d

r e d m l w a t e r s a m p l e s w e r e su_{p p l} eme n t e d w i t h 0 . 0 5M M gC l ₂, a nd f i l t e r e d t h r o u_{g h} 0 . 4 5 fim c e l l ul o s e n i t r a t e - _{a c e t a t e mem br an e} f i l t e r s

₍

t y p e H

A

, M i l l i p o r e , B e d f o r d , MA

)

a t a f l o w r a t e o f 1 0 0 m l

/

3 - 6 m i n t o a d s o r b co l i p h a _ge s . T he f i l t e r s w e r e a _{p p l i} e d f a c e do w n o n T Y G a _ga r c o nt a i n i n _g l o _{g p h} a s e WG 4 9 a nd

2 6 0 . 3 % T w e e n 8 0 and 0 . 0 3 % t e t r a zo l i um v i o l e t . P l a qu e s w e r e v i s u a l i z e d a f t e r t h e _{p l} a t e s w e r e i nc ub a t e d a t 3 7° C o v e r n _{i g h t} . I s o l a t i o n o f F* R N A c o _{l i p h}a_ge s f r om e nv i r o nme n t a l s a_{m p l} e s . F ^ RN A c o _{l i p h} a _ge s w e r e i s o l a t e d f r om a s s a _{y p l} a t e s w i t h f e w e r t ha n 5 0 _{p l} a _qu e s an d we r e t r a n s f e r r e d b y a s _{p i} r a t i n _g w i t h a m i c r o_{p i p} e t t e an d s us_p e nd i n _g i n 0 . 5 m l P B S c o n t a i ni n g 1 5 % g l yc e r o l . I s o l a t e s w e r e t e s t e d w i t h R Na s e A

(

t y p e I - A ; S i g ma , S t . L o u i s , M O

)

t o d i s t i n gu i s h b e t w e e n RN A a n d DN A p ha _ge s

(

7 0

)

. T h i s w a s don e b y sp o t t i n g 5//1 su sp en s

i

o n s o f i s o l a t e s o n T YG t o_p a _g a r c o nt a i n i n _g W G4 9 ho s t c e l l s a n d 1 0 0 /^_g

/

m l R Na s e . Co n f i r med R NA c o l i p ha ge s w e r e t ho s e w h i c h f a i l e d t o _p r o du c e _{p l} a _qu e s

(

l y s i s z o n e s

)

due t o _{t h} e c l e a v a _ge o f R NA _{b y} R Na s e . The s e F ^ R NA c o l i p h a _ge s w e r e s t o r e d a t -7 0° C f o r s e r o t

y

p

i

n g . Se r o _{t y p i} n _g o f F * RN

A

c o _{l i p h} a _ge s .

A

s _po t t e s t w a s c a r r i e d o u t t o r a_{p i d l y} de t e r m i n e s e r o _{t y p} e s o f t h e i s o l a t e s

(

6 6

)

. T wen t y /^l v o l u me s o f t h e u n d i l ut e _{d , t} en f o l d a nd hu n dr e d f o l d d i l u t i o n s o f a n i s o l a t e w e r e s_p o t t e d o n WG 4 9 l aw n s o n T Y G t o _p a _g a r c o n t a i n i n_g o n e o f t h e f i v e F " RN A c o l

i

_{p h} a _ge n eu t r a l i z i n _g an t i s e r a . Ea c h an t i s e r um wa s d i l u _t e d t o a ch i e v e a b ou _t t h r e e l o _g ^ o r e du c t i o n s o f a _p r o t o t y p e _{p h} a _ge w i t h i n t h e s ame s e r o _g r o u _p b e

f

o r e a

_{d d i}

_{t i} o n t o _t o _p a _ga r . I n e a ch t r

i

al o f s e r o t y p i n g _,

f i v e kn ow n F ^ R NA c o _{l i p h}a _ge s _t r a i n s _, e a c h r e _pr e s e n t i n _g a s e r o _gr o u_p

(

I , I I , I I I , IVa , I v b

)

, w e r e i n c l u d e d a s p o s i t i v e c o n t r o l s i n o r d e r t o ev a l u at e t h e r e l i a_{b i l i t y} o f t h i s me t h o d . A f t e r o v e r n i g h t i nc ub a t i o n a t 3 7 ° C, s e r o t y p e s w e r e de t e r m i n e d _{b y} s c o r i n_g c o _{l i p h}a _g e _p l a t e s e xh i b i t i n _g t h e p r e s e n c e o r a_b s en c e o f c l e a r z o n e s o f l ys

i

s o n t h e l aw n s . T he a b s e n c e o f a c l e a r z o n e o n a l aw n w a s c o n s i de r e d c o _{m p l} e t e n eu t r a l i z a t i o n o f t he _{p h} a _ge i n f e c t i v _{i t y b y} t h e a nt i s e r u m i n t ha t _{p l} a t e an d h e n c e p o s i t i v e i d e n t i f i c a t i on o f p ha _ge s e r o t y p e . P l a _qu e - t r a n sf e r a nd f i x a t i o n f o r h

_y

b r i

d

i z a t i o n . Th e me t ho d f o r _{p l} a _qu e t r an s f e r an d f i x a t i o n o n t o memb r a ne s w a s mo _{d i f i} e d f r o m t ha t o f Be n t o n a n d D av i s

(

6

)

. I n b r i e _{f , 2 j u l} v o l ume s o f en v i r o nme nt a l i s o l a t e s a n d f i ve p r o t o t y p e s t r a i n s w e r e s _po t t e _d o n l aw ns o f ho s t WG 4 9 a n d

i

n c ub a _t e d a t 3 7° C ov e r n i g h t . P l a t e s w e r e i n cu b a t e d a t 4 ° C f o r 3 0 m i n a n d t he n w e r e c o v e r e d w i t h n _{y l} on memb r an e s t o ad s or b _{p l} a _que s f or 2 m

i

n

(

4 mi n f o r t h e s e c o nd t r a n s f e r

₎

. T h e a d s o r _{p t i} o n e f f i c i en c i e s o f f i v e d i f f e r e n t memb r a ne f i l t e r s w e r e c o m_p a r e d : Ge ne Sc r e en

(

NE N Re s e a r c h Pr o _duc t s , Bo s t o n , M A

)

, n y l o n m em b r a ne s

(

Bo e hr i n ge r Ma n nh e i m, I n d i a n a_p o l i s , I N

)

, B i o t r a n s

(

I C N Ra d i o c he mi c a l s , I n c . , I r v i n e _{, C A}

₎

_, B i o _{d y}ne

(

P AL L B i o su_{p p}o r t , Ea s t H i l l s , NY

)

, a nd Z e t a - _p r ob e b l o t t i n _g memb r a n e s

(

B i o - RAD La bo r a t o r i e s ,

R i c h mo n d , C A

)

. Th r e e s o l u t i o n s w e r e c om_p a r ed f o r t h e e f f i c i e n c _y o f d e n a t ur a t i o n o f t h e _{p l} a _qu e s t r a n s f e r r e d t o memb r an e s : 1

)

0 . 0 5 N N a O H

(

1 m i n f i x a t i o n a nd 1 mi n n e u t r a l i z a t i o n b y 0 . 1 M s o d i u m a c e t a t e _p H 6 . 0 ; 2

)

3 7 % f o r ma l d e h y d e f o r 2 m i n ; a nd 3

)

b l o _{t t i} n _g b u f f e r c o n t a i ni n_g 7 . 5 x S SC

(

2 0 x SS C : 3 M N a C l a n d 0 . 3 M s o d

i

um c i t r a t e , p H 7 . 0

)

an d 4 . 6 M f o r ma l d eh y d e

(

he a t a t 6 5 ° C f o r 1 5 m i n

)

. Th e memb r an e s w e r e t h e n t r e a t e d t o c r o s s l

i

n k t h e de n a t u r e d n u c l e i c a c i d _{b y} i r r a d

i

a t i n _g w i t h UV f o r 5 m i n a n d b a k i n _g f o r 1 5 m i n i n a v a c u um o v e n a t 8 0°C p r i o r t o h y b r i d i z a t i o n . No n r ad i o a c t i ve o_{l i g}o n u cl e o t i d e _p r obe s el e ct i o n a nd l a b el i n _g . T h e s i x o l i go n u c l e o t i de s u l t i ma t e l y u s e d a s _p r o _b e s a r e su mma r i z e d i n T a b l e 1 . I n i t i a l l y , s i x o l i go n u c l e o t i d e p r ob e s

(

I , I I , I I I , I V , A , B

)

w e r e o b t a i n e d f r om D r . J . v an D u i n , Le i de n Un i v e r s i t y , T h e Ne t he r l a n d s . De sp i t e s _y s t ema t i c a nd r e _p e a t e d a t t em p t s t o o_{p t i m i} z e h y br i d i z a t i o n c o n d

i

t i o n s f o r a l l _p r ob e s , pr o b e s I an d I I w e r e f o u n d t o g i v e c o n s i de r a b l e c r o s s r e a c t i v _{i t y} w i t h _g r ou _p I V _{p h} a _g e s

₍

F I a n d S P

)

a t 5 0° C . T h e r e f o r e , o l i go n u c l e o t i

d

e s e qu en c e s f o r a l t e r n a t e _p r o b e s I an d I I we r e s e l e c t e d b y p e r f o r m i n_g a mu _{l t i p l} e n u c l e o t i de s e _qu e n c e a _{l i g}n me n t a n a _{l y}s i s us i n _g a n u c l e i c a c i d se _qu e n c e a _{l i g}nme n t a nd an a _{l y} s i s s o f t w a r e p r o _g r am

(

M A C AW, N a t i o n a l C en t e r f o r B i o t e c h no l o g y