Expression of E.coli capsular polysaccharide requires the KfiB protein:A Structural based analysis

(1)

ﻦﯿﺌﺗوﺮﭘﺪﻨﻣزﺎﯿﻧﯽﻠﮐﺎﯿﺷﺮﺷایﺮﺘﮐﺎﺑردلﻮﺴﭙﮐنﺎﯿﺑ

KfiB

ﺖﺳا :

ﯽﻨﺘﺒﻣﻪﻌﻟﺎﻄﻣﮏﯾ

دﺮﮑﻠﻤﻋورﺎﺘﺧﺎﺳﺰﯿﻟﺎﻧآﺮﺑ

هﺪﯿﮑﭼ

فﺪﻫوﻪﻨﯿﻣز

:

ـﮐﺎﺑﯽﯾاﺰﯾرﺎـﻤﯿﺑﻢـﻬﻣﻞـﻣاﻮﻋزاﯽـﮑﯾلﻮﺴﭙﮐنﺎﯿﺑ ـ ﻣیﺎﻬﯾﺮﺘ ـ ـﺟﺎﻬ ـ ﻢ هدﻮـﺑ

نﺎﺴـﻧارد،

ﻫایاراد ـ ﯿﻤ ـ ﺖ ﺖﺳا . ﺷﺮﺷا ــ

ﺷادﺎﺑﯽﻠﮐﺎﯿ ــ ﺘـ ﺷﻦ ـ ـﯾوﻂﯾاﺮ ـ ـﺑهﮋ ﻪ ـﻋ ـ

ﯿﺳﮏـﯾناﻮﻨ ــ

ﻣلﺪـﻣﻢﺘﺴ ـ

ـﺳﺎﻨ ـ

یاﺮـﺑﺐ

ﺳراوﺪﯿﻟﻮﺗیﺎﻬﻤﺴﯿﻧﺎﮑﻣﻪﻌﻟﺎﻄﻣ ـ ﮐلﺎ ـ ﺴﭙ ـ ﭘلﻮ ـ ﺳﯽﻠ ـ ﯾرﺎﮐﺎ ــ

ﺳﻪﺑیﺪ ـ ﻏحﻮﻄ ـ ﺸ ـ ﯾﺎ ـ ﻗﯽ ـ ﺳاﻞﺑﺎ ـ ﻔﺘ ـ ﻣهدﺎ ـ ﺑﯽ ـ ﺪﺷﺎ .

ﭘلﻮﺴﭙﮐﺪﯿﻟﻮﺗ ـﻠ ـ ﺳﯽ ـ ﮐﺎ ـ ـﯾرﺎ ـ

ﺷاردیﺪ ـ ﺷﺮ ـ ـﮐﺎﯿ ـ

ﭼﻪـﺑﯽﻠ ـ ـﻬ ـ ـﻧرﺎ ـ ﭘعﻮ ـ ﺗوﺮ ــ ـﺌ ـ ﻦﯿ KfiA ، KfiB ، KfiC ، KfiD ﻧ ــ ﯿـ ﻣزﺎ ــــ ــﺑﯽــﻣﺪﻨ ـ ــﮐﺪﺷﺎ ـ ﯾاردﻪ ــ ــﺠ ـ ﺳدﺎ ـ ﺧﺎ ــ ﺘـ ــﻫرﺎ ـ ﺗیﺎ ـ ــﮑ ـ یراﺮ 4) GLcA - β(1,4) –

GlcNAc-α(1-

-ﺪﻨﻨﮐﯽﻣﺶﻘﻧیﺎﻔﯾا،لﻮﺴﭙﮐهﺪﻧزﺎﺳ

. ـﻨﮐﺎـﺗ ـ ـﻘﻧنﻮ ـ ـﺳﺶ ـ ﭼزاعﻮـﻧﻪ ـ ـﻬ ـ ﺗوﺮﭘرﺎ ـ ـﯿﺌ ـ ﻦ ﻓـ ـ ﻣقﻮ ـ ﺸ ـ ﺨ ـ ﺶﻘﻧزﻮﻨﻫﺎﻣاﺖﺳاهﺪﺷﺺ KfiB

ﺖﺳاهﺪﻧﺎﻣﻪﺘﺧﺎﻨﺷﺎﻧ

. ﯽﺳرﺮﺑشور : ﻨﻣﻪﺑ ـ

ﻦﯿﺌﺗوﺮـﭘﺶﻘﻧﻦﺘﻓﺎﯾرﻮﻈ KfiB

نﺎـﯿﺑتوﺎـﻔﺘﻣرﺎﺘﺧﺎـﺳﻦﯾﺪـﻨﭼﻪـﻌﻟﺎﻄﻣﻦـﯾارد،

ﯾاﻒﻠﺘﺨﻣیﺎﻬﺸﺨﺑهﺪﻨﻨﮐ ـ ﺌﺗوﺮﭘﻦ ـ ﻦﯿ (pMA2-6) ﯾو ــ ﺧﺎﺳﮏ ـ ﮐرﺎﺘ ـ ـﻣﺎ ـ نآزاﻞ (pMA1) ـﮐ ـ ﻫﻪ ـ ـﻤ ـ ﯽﮕ

ﻄﻗدﻮﺧﻦﯿﻣآیﺎﻬﺘﻧارد ـ یﻪﻌ 6His-tag ﺘﺷاد ـ ﺧﺎﺳﺪﻨ ـ ﺪﺷﻪﺘ .

ﺨﺗﻪـﺑﻪـﻌﻄﻗﻦـﯾارﻮﻀـﺣ ـ ـﻠ ـ ﺺﯿ ـﻨﯿﺌﺗوﺮﭘ ـ یﺎﻬ

ﯽﻓاﺮﮔﻮﺗﺎﻣوﺮﮐنﻮﺘﺳزاهدﺎﻔﺘﺳاﺎﺑهﺪﺷﺪﯿﻟﻮﺗ -NTA

+ Ni2

ﺪﻨﮐﯽﻣﮏﻤﮐ

. ﺎﻫﻪﺘﻓﺎﯾ : ﭻﯿﻫ

ﺳﻼﭘزاماﺪﮐ ـ

ﺘﺧﺎﺳیﺎﻫﺪﯿﻤ ـ

ﺳاﻪﺑهﺪﺷﻪ ـ ﺜﺘ ـ یﺎﻨ pMA1

ـﺒﺟﻪـﺑردﺎﻗ ـ

ﺶـﻘﻧناﺮ KfiB

ــﺟﺪﯿﻤــﺳﻼﭘرد ـ

ﻪــﺘﻓﺎﯾﺶﻬ pPC6::23

هدﻮــﺒﻧ و ﮐﺪــﯿﻟﻮﺗﯽﯾﺎــﻧاﻮﺗﺪﻨﺘﺴــﻧاﻮﺘﻧ ـ

ــﺘﮐﺎﺑﻪــﺑًادﺪــﺠﻣارلﻮﺴــﭙ ـ یﺮ ﺪﻨﻧادﺮﮔزﺎﺑ . ﻓﺮﻃزا ـ ﯾاﯽ ـ ﺗﻦ ــ ﻧاﻮ ـ ﯾﺎ ـ ﯽ ﺑـ ﺎ pMA1 ﻧ ـ ﺸ ـ ﻫدنﺎ ـﻨ ـ ـﯾاهﺪ ـ ـﺑﻦ ـ

ﺣﻪـﮐدﻮ ــ ﻀ ـ ﻗرﻮ ــ ـﻄ ـ ﻪﻌ His-tag ﺘﻣ ـ ﺼ ــ ﺑﻞ ـ ﯾاﻪ ـ ﭘﻦ ـ ﺌﺗوﺮ ـ

ﻧنآدﺮـﮑﻠﻤﻋردﯽـﺘﻤﺣاﺰﻣﻦﯿ ـ ـﺷاﺪ ـ ﻪﺘ ﺿ ـ ـﻤ ـ ـﯾاﻦ ـ ﻪـﮐﻦ ﺣ ـ ـﺘ ـ ﻗﻪـﺑًﺎﻤ ــ ـﻄ ـ ﮐﻪﻌ ـ ـﻣﺎ ـ ﻞ ﭘـ ﺌﺗوﺮ ـ ﻦﯿ KfiB ﺑ ـ ﺗیاﺮ ـ ﻞﯿﻤﮑ (Complementation) ﯽﻣزﺎﯿﻧﺲﮑﻠﭙﻤﮐ

ﺪﺷﺎﺑ . یﺮﯿﮔﻪﺠﯿﺘﻧ :

ﻊﻤﺠﺗﻞﺤﻣﻦﺘﻓﺎﯾﺎﺑﻂﺒﺗﺮﻣتﺎﻌﻟﺎﻄﻣ

)

لﺎﺼﺗا

( ﻦﯿﺌﺗوﺮﭘﻪﮐدادنﺎﺸﻧﻦﯿﺌﺗوﺮﭘﻦﯾا KfiB

ﻪـﺑ

ﯽﻣﻞﺼﺘﻣﯽﻤﺳﻼﭘﻮﺘﯿﺳءﺎﺸﻏ دﻮﺷ

.

یﺪﯿﻠﮐیﺎﻫهژاو

:

،یﺪﯾرﺎﮐﺎﺳﯽﻠﭘلﻮﺴﭙﮐ،ﯽﻠﮐﺎﯿﺷﺮﺷا KfiB ، K5

ﻦﯿﺴﺣرﻮﭘجاﺮﻌﻣ

ﯽﻟﻮﮑﻠﻣیژﻮﻟﻮﯿﺑرﺎﯾدﺎﺘﺳا ،

ﯽﮑﺷﺰﭘهﺪﮑﺸﻧاد

نﺎﻬﻔﺻاﯽﮑﺷﺰﭘمﻮﻠﻋهﺎﮕﺸﻧاد،

ﺲﺗﺮﺑورسانﺎﯾا دﺎﺘﺳا ﯽﻟﻮﮑﻠﻣیژﻮﻟﻮﯿﺑ ، ﺮﺘﺴﭽﻨﻣهﺎﮕﺸﻧاد لﻮﺌﺴﻣهﺪﻨﺴﯾﻮﻧ : ﻦﯿﺴﺣرﻮﭘجاﺮﻌﻣ ﻧ ﻦﻔﻠ : 7922437 0311 ﮏﯿﻧوﺮﺘﮑﻟاﺖﺴﭘ : [email protected] سردآ :

ﯽﮑﺷﺰﭘمﻮﻠﻋهﺎﮕﺸﻧاد،نﺎﻬﻔﺻا

وﮏﯿﺘﻧژهوﺮﮔ،ﯽﮑﺷﺰﭘهﺪﮑﺸﻧاد،نﺎﻬﻔﺻا

ﯽﻟﻮﮑﻠﻣ ﻪﻟﺎﻘﻣلﻮﺻو : 20 / 1 / 87 ﯽﯾﺎﻬﻧحﻼﺻا : 12 / 3 / 87 ﻪﻟﺎﻘﻣشﺮﯾﺬﭘ : 27 / 3 / 87

(2)

Cytoplasm

ATP P

P

Periplasm E

C

S C U

Kfi KfiC KfiD

M M

T T

KfiB E

CM-CM KfiA

Phosphatidyl-Kdo

ﻪﻣﺪﻘﻣ مﻮﺳﺮﻣتﺎﯿﺻﻮﺼﺧزایﺪﯾرﺎﮐﺎﺳﯽﻠﭘلﻮﺴﭙﮐﮏﯾنﺎﯿﺑ

ﺑ ﺪﺷﺎﺑﯽﻣﺎﻬﯾﺮﺘﮐﺎﺑﺮﺘﺸﯿ .

ﯽﻟﻮﻠـﺳحﻮﻄﺳﻪﻃﺎﺣاﺎﺑرﺎﺘﺧﺎﺳﻦﯾا

ﺖﮐرﺎﺸـﻣﯽﺟرﺎﺧﻂﯿﺤﻣویﺮﺘﮐﺎﺑﻦﯿﺑﻒﻠﺘﺨﻣتﻼﻣﺎﻌﺗرد

ﺪﻨﮐﯽﻣ . ﻢـﻬﻣﻞـﻤﻋﻦﯾﺪـﻨﭼیﺪﯾرﺎﮐﺎـﺳﯽـﻠﭘلﻮﺴﭙﮐیاﺮﺑ

زاﺪﻨﺗرﺎﺒﻋﺎﻬﻧآﻦﯾﺮﺘﻤﻬﻣﻪﮐﺖﺳاهﺪﺷﺮﮐذ :

نﺎﺑﺰﯿﻣﯽﻋﺎﻓدﻢﺘﺴﯿﺳﺎﺑﻪﻠﺑﺎﻘﻣردیﺪﯿﻠﮐﺶﻘﻧﮏﯾیﺎﻔﯾا

ﻮﻔﻋتﺪﻣلﻮﻃرد تﺎـﻋﺎﻤﺘﺟاﻞﯿﮑﺸـﺗﺮﺑﺮﯿﺛﺎﺗﻦﯿﻨﭽﻤﻫ،ﺖﻧ

ﯽﻄﯿﺤﻣبﺮﺨﻣﻞﻣاﻮﻋﺮﺑاﺮﺑردﺖﻣوﺎﻘﻣوﯽﯾﺎﯾﺮﺘﮐﺎﺑ )

1،2 (.

ﺎـﻬﯾﺮﺘﮐﺎﺑزایداﺪـﻌﺗردیﺪﯾرﺎﮐﺎﺳﯽﻠﭘیﺎﻬﻟﻮﺴﭙﮐنﺎﯿﺑ

درﻮــﻣردﺎــﻬﻧآﻦﯿــﺑزا،ﺖــﺳاﻪــﺘﻓﺮﮔراﺮــﻗﻪــﻌﻟﺎﻄﻣدرﻮــﻣ

ﺖﺳاهﺪﻣآﺖﺳدﻪﺑتﺎﻋﻼﻃاﻦﯾﺮﺘﻬﺑﯽﻠﮐﺎﯿﺷﺮﺷا )

3 .( ﺎﯿﺷﺮﺷا

اﺶﯿــــﺑﺪــــﻧاﻮﺗﯽــــﻣﯽــــﻠﮐ ز

80 ﯽــــﻠﭘلﻮﺴــــﭙﮐعﻮــــﻧ

یﺪﯾرﺎﮐﺎــﺳ )

یﺎــﻬﻧژﯽﺘﻧآﺎــﯾ

K

( ﺪــﯾﺎﻤﻧﺪــﯿﻟﻮﺗتوﺎــﻔﺘﻣ .

ﻦــﯾا

وﯽـﮑﯿﺘﻧژتﺎﯿﺻﻮﺼـﺧسﺎـﺳاﺮـﺑﯽﻠﮐﺎﯿﺷﺮﺷاردﺎﻫلﻮﺴﭙﮐ

هوﺮﮔرﺎﻬﭼردﯽﯾﺎﯿﻤﯿﺷﻮﯿﺑ )

4 -1 ( ﺪﻧاهﺪﺷیﺪﻨﺑﻢﯿﺴﻘﺗ )

3 . (

یﺎــﻬﻧژﯽــﺘﻧآﺮــﺑﺶــﺨﺑﻦــﯾاردﺎﻀــﻓﺖﯾدوﺪــﺤﻣﻞــﯿﻟدﻪــﺑ

یﺎﻬﻫوﺮﮔ 2

، 1 ﺪﺷﻢﯿﻫاﻮﺧﺰﮐﺮﻤﺘﻣ .

ژﯽﺘﻧآ هوﺮﮔیﺎﻬﻧ 1

ﺷﺮﺷاردﻪﮐ ـ

ﯿﻠﮐﺎﯿ ـ ﻬ ـ هﺪـﺷاﺪـﺟیﺎ

ﻋزا ـ ﻧﻮﻔ ـﺘ ـ ـﻬ ـ ﺑیاهدوریﺎ ـ

ــﯿ ـ ـﻣنﺎ ـ ﺷﯽ ـ ــﻧﻮ ـ ،ﺪ ـﺑ ـ ﺧﺎ ـ ــﺷﻮ ـ ﻪ

ﻧژ ـ ﯽ

(gene cluster) cps

نوﺮﭘاﯽـﮑـﯾدﺰﻧردﻪﮐ

his

راﺮــﻗ

ﺖـﺳاﻪﺘﻓﺮـﮔ ،

یراﺬﮔﺪﮐ

(encoded)

ﺪﻧﻮﺷﯽﻣ .

ﯽـﺘﻧآﻦﯾا

یﺎﻬﺴـﻨﺟﺎـﺑهﺪـﺷنﺎـﯿﺑﯽﻟﻮﺴـﭙﮐیﺎﻫﺪﯾرﺎﮐﺎـﺳﯽـﻠﭘﻪﺑﺎﻬﻧژ

ﺴﺒﻠﮐ ﺪﻧرادﺖﻫﺎﺒﺷﺎﯿﻨﯾوراوﻼﯿ )

4 .(

هوﺮـﮔیﺎﻬﻧژﯽﺘﻧآ

2 زاهﺪـﺷ اﺪـﺟیﺎـﻬﯿﻠﮐﺎﯿـﺷﺮﺷارد

ﯽــﻣنﺎــﯿﺑتﺎــﻧاﻮﯿﺣونﺎﺴــﻧاﻒــﻠﺘﺨﻣیﺎــﻬﺘﻧﻮﻔﻋزایداﺪــﻌﺗ

ﺪﻧﻮﺷ ) 2 ( سﻮـﮐﻮﻟ،ﻂـﺳﻮﺗﺎـﻬﻧژﯽـﺘﻧآﻦﯾا

kps

ﯽـﮑﯾدﺰﻧرد

serA

ﻪــﺑﺖﻫﺎﺒــﺷﯽﻧﺎﻤﺘﺧﺎــﺳظﺎــﺤﻟزا،هﺪــﺷیراﺬــﮔﺪﮐ

ﺎﯿﺑیﺪﯾرﺎﮐﺎﺳﯽﻠﭘیﺎﻬﻟﻮﺴﭙﮐ وﺎﯾﺮﺴـﯾﺎﻧیﺎﻬﺴـﻨﺟﺎـﺑهﺪـﺷن

ﺪــﻧرادسﻮــﻠﯿﻓﻮﻤﻫ )

2،3 . ( هوﺮــﮔیﺎﻬﻟﻮﺴــﭙﮐفﻼــﺧﺮــﺑ 1

هوﺮـﮔیﺪﯾرﺎﮐﺎﺳﯽﻠﭘیﺎﻬﻟﻮﺴﭙﮐ 2

ﯽﻤـﺳﻼﭘﻮﺘﯿﺳفﺮـﻃرد

ﺪـــﺘﻤﻣیﺎﻬﺸـــﻨﮐاوﻪﻄـــﺳاﻮﺑﯽـــﻠﺧادءﺎﺸـــﻏ

(Processive)

ﺪﻧﻮﺷﯽﻣﻪﺘﺧﺎﺳﺎﻫزاﺮﻔﺴﻧاﺮﺗﻞﯾزﻮﮑﯿﻠﮔ ).

6،5،4،3 (

رﺎﺘﺧﺎــﺳﺮﺘﺴــﭽﻨﻣهﺎﮕﺸــﻧادردﺲﺗﺮــﺑورهﺎﮕﺸــﯾﺎﻣزآرد

ا رددﻮــﺟﻮﻣهﺪــﻨﻨﮐلﺎــﺳراوهﺪﻧزﺎــﺳﺲﮑﻠﭙــﻤﮐیﺮﻣﻮــﮕﯿﻟو

یﺎــﻬﻧژﯽــﺘﻧآزاهدﺎﻔﺘــﺳاﺎــﺑﯽــﻠﺧادءﺎﺸــﻏ

K5

ﮏــﯾناﻮــﻨﻌﺑ

لﺪﻣﻢﺘﺴﯿﺳ )

ﻞﮑﺷ 1 ( ﺪﯾدﺮﮔﻢﯿﺳﺮﺗ، ) .

3 ( یﺪـﻌﺑتﺎﻌﻟﺎﻄﻣ

یﺎـﻬﺒﻄﻗردﺲﮑﻠﭙـﻤﮐﻦـﯾاﻪﮐدادنﺎﺸﻧهﺎﮕﺸﯾﺎﻣزآنﺎﻤﻫرد

ﺎﻫﺪﯾرﺎﮐﺎـﺳﯽﻠﭘﻪﮐﺖﺳﺎﻬﻠﺤﻣنﺎﻤﻫردوﻪﺘﺷادراﺮﻗﯽﻟﻮﻠﺳ

حﻮﻄﺳﻪﺑ ﺪﻧﻮﺷﯽﻣﻪﯿﻠﺨﺗﯽﻟﻮﻠﺳ

) . 7 (

ﻞﮑﺷردﻪﮐﻪﻧﻮﮕﻧﺎﻤﻫ 1

,

2 ﺰﺘﻨـﺳﻮﯿﺑ،دﻮﺷﯽﻣهﺪﻫﺎﺸﻣ

ﯽﻟﻮﺴـﭙﮐیﺎﻫﺪﯾرﺎﮐﺎﺳﯽﻠﭘ

K5

ﺲﮑﻠﭙـﻤﮐرﺎﺘﺧﺎـﺳﮏـﯾﺎـﺑ

ﯽـﻠﭘلﺎـﺳراوﺪـﯿﻟﻮﺗردﻪـﮐدﺮﯿﮔﯽﻣترﻮﺻﯽﻨﯿﺌﺗوﺮﭘﺪﻨﭼ

ﺪـﻨﻨﮐﯽﻣﺎﻔﯾاﺶﻘﻧﺎﻫﺪﯾرﺎﮐﺎﺳ .

یﺎـﻬﻨﯿﺌﺗوﺮﭘ

KfiA ،

KfiB ،

KfiC

،

KfiD

رﺎﮐﺎﺳﯽﻠﭘﺰﺘﻨﺳﻮﯿﺑرد ﯽـﻣﺎﻔﯾاﯽﺗﺎﯿﺣﺶﻘﻧﺪﯾ

ﺪــﻨﻨﮐ . ﻪﯾﻮــﺳﺎــﺑهﺪــﺷﺪــﯿﻟﻮﺗﯽﻟﻮﺴــﭙﮐﺪﯾرﺎﮐﺎــﺳﯽــﻠﭘ

K5

درادتﺎﻔﻟﻮﺳﻦﯾرﺎﭙﻫﻪﺑیدﺎﯾزﺖﻫﺎﺒﺷﯽﻠﮐﺎﯿﺷﺮﺷا ) .

8 (

:1ﻞﮑﺷ

هﺪﻧزﺎﺳ ﺲﮑﻠﭙﻤﮐ ﮏﯿﺗﺎﻤﺷ ﻞﮑﺷ

-لﻮﺴﭙﮐ هﺪﻨﻨﮐ لﺎﺳرا

(3)

مود هرود ،ﯽﻫﺎﮕﺸﯾﺎﻣزآ مﻮﻠﻋ ﻪﻠﺠﻣ )

هرﺎﻤﺷ 1 ( نﺎﺘﺴﺑﺎﺗو رﺎﻬﺑ 1387

یﺎـﻬﻨﯿﺌﺗوﺮﭘیورﺮـﺑتﺎﻌﻟﺎﻄﻣ

KfiA

و

KfiC

هﺎﮕﺸـﯾﺎﻣزآرد

ودﻦﯾاﻪﮐدادنﺎﺸﻧﺮﺘﺴﭽﻨﻣهﺎﮕﺸﻧادردﺲﺗﺮﺑور ﻪـﺑﻦﯿﺌﺗوﺮﭘ

ﮏﯾﺐﯿﺗﺮﺗ

α-UDP-N-acetyl-D

ﻞـﯾزﻮﮑﯿﻠﮔﻦﯿﻣآﺰﮐﻮﻠﮔ

زاﺮﻔﺴﻧاﺮﺗ

(α-GlcNAc-T)

ﮏـﯾو

UDP-Glucuronicacid

زاﺮﻔﺴﻧاﺮﺗﻞﯾزﻮﮐﻮﻠﮔ

(β-GlcA-T)

ﺪﻨﺘﺴـﻫ ) 5،6 . (

KfiD

ناﻮﻨﻌﺑ

UDP-Glucuronic acid

ﺪـﻨﮐﯽﻣﻞﻤﻋزﺎﻧژورﺪﯿﻫد .

) 9 ( ﻦﯿﺌﺗوﺮـﭘﺶـﻘﻧنﻮـﻨﮐﺎﺗ

KfiB

ﻦـﮑﻤﻣ،هدﻮـﺑﺺﺨﺸـﻣﺎﻧ

ﺖﺳا ﺎـﻔﯾاﺶـﻘﻧﺪﯾرﺎﮐﺎـﺳﯽـﻠﭘﺰﺘﻨـﺳﻮﯿﺑﻦﯾزﺎـﻏآﻞﺣاﺮﻣرد

ﺪﻨﮑﺑ . نﺎﺸـﻧﻦﯿﺌﺗوﺮﭘﻦﯾانﺎﻤﺘﺧﺎﺳهﺪﻨﻨﮐﯽﯾﻮﮕﺸﯿﭘتﺎﻌﻟﺎﻄﻣ

ﻪﮐداد

KfiB

ﭻﯿﭘرﺎـﻣﯽﺣاﻮـﻧﻦﺘﺷادﺎﺑﺪﻧاﻮﺗﯽﻣ –

ﭻﯿﭘرﺎـﻣ

)

یرﺎﺘﺧﺎـﺳﺶـﻘﻧﮏـﯾیﺎﻔﯾاﺎﺑلﻮﺴﭙﮐﺪﯿﻟﻮﺗزﺎﻏآﻞﯿﻬﺴﺗرد

دﻮﺷﺮﻫﺎﻇ )

6 . (

ﻮـﻟﻮﻨﮑﺗدﺮﺑرﺎـﮐﻖـﯾﺮﻃزاﻦﯿﺌﺗوﺮﭘﮏﯾنﺎﯿﺑ ﯽﻟﺎﺼـﺗایژ

نژ

(gene fusion technology)

نآﺺﯿـﻠﺨﺗﻞﯿﻬﺴـﺗﺚﻋﺎﺑ

دﻮــﺷﯽــﻣﻦﯿﺌﺗوﺮــﭘ .

ﺶــﺷزاهدﺎﻔﺘــﺳاﺎﻬــﺷورﻦــﯾازاﯽــﮑﯾ

ﯽﻟاﻮﺘﻣﻦﯾﺪﯿﺘﺴﯿﻫ

(6XHis)

قﻮﻓﺖﯿﻘﻓﻮﻣﺎﺑًﻼﺒﻗﻪﮐﺪﺷﺎﺑﯽﻣ

یﺎﻫﻦﯿﺌﺗوﺮﭘعاﻮﻧاﺮﮕﯾدیاﺮﺑیاهدﺎﻌﻟا

KpS

هدﺎﻔﺘـﺳادرﻮـﻣ

دﻮــﺑﻪــﺘﻓﺮﮔراﺮــﻗ ) .

10 ( ﺗفﺪــﻫﺎــﺑﻪــﻌﻟﺎﻄﻣﻦــﯾا ﺶــﻘﻧﻦﯿــﯿﻌ

ﯽﻨﯿﯿﺗوﺮﭘ

KfiB

ﺪﺷﺎﺑﯽﻣشورﻦﯾازاهدﺎﻔﺘﺳاﺎﺑ .

ﯽﺳرﺮﺑشور

یﺎﻬﯿﻧﺎﭙﻤﮐزازﺎﯿﻧدرﻮﻣداﻮﻣﺮﮕﯾدوﯽﯾﺎﯿﻤﯿﺷداﻮﻣمﺎﻤﺗ

ﺎﻤﮕﯿﺳ –

ﻪـﺑ،ﺪـﻧﺪﯾدﺮﮔﻪـﯿﻬﺗﺪﯿﺋﻮﺴـﮐواوکﺮـﻣ،ﭻﯾرﺪﻟآ

هﺪـﯾدﺮﮔﺮـﮐذنآﻪـﺑطﻮﺑﺮﻣﯽﻧﺎﭙﻤﮐمﺎﻧﻪﮐیدراﻮﻣیﺎﻨﺜﺘﺳا

ﺖﺳا . ﺑـ ﮐﺎ ـ ﯾﺮﺘ ـ ﻣردﺎﻬ ـ ﯿﺤ ـ

ﮐﻂ

ـ ﺸ ـ ﺖ

(Luria-Bertani)LB

هداد ﺪﻧﺪﺷ . ﻪﺘﺧﺎﺳیﺎﻫﺪﯿﻤﺳﻼﭘوهدﺎﻔﺘﺳادرﻮﻣیﺎﻫﺮﻤﯾاﺮﭘ

لوﺪﺟردﻪﻌﻟﺎﻄﻣﻦﯾاردهﺪﺷ 1

و 2 ﺪﻧاهﺪﺷهدروآ .

DNA

ﺖﯿﮐﻂﺳﻮﺗیﺪﯿﻤﺳﻼﭘ

QIA Prep

ﯽﻧﺎـﭙﻤﮐ

Qiagen

ﺪــﯾدﺮﮔجاﺮﺨﺘــﺳا .

ﺎــﺑﺮــﯿﺜﮑﺗﻞــﺣاﺮﻣ

PCR

زاهدﺎﻔﺘــﺳاﺎــﺑ

ﻢﯾﺰـﻧآوهﺪـﺷﺮـﮐذ یﺎﻫﺮﻤﯾاﺮﭘ

Pfu

زاﺮـﻤﯿﻠﭘ

(Stratagene)

ﺖﻓﺮﮔترﻮﺻ .

تﺎﻌﻄﻗهزاﺪﻧاﻞﯿﻠﺤﺗوﻪﯾﺰﺠﺗ

DNA

زاﺲﭘ

ﮏـﯾﺮﮐرﺎـﻣزاهدﺎﻔﺘـﺳاﺎـﺑزورﺎـﮔآلژیورﺮﺑزرﻮﻓوﺮﺘﮑﻟا

یزﺎﺑﻮﻠﯿﮐ

(Gibco BRL)

ﺖﻓﺮﮔترﻮﺻ

.

ﯽﺑﺎـﯾﯽﻟاﻮﺗیاﺮﺑ

ﺖـﯿﮐزا

(Perkin Elmer) ABI PRISM Ready

هدﺎﻔﺘـﺳا

ﺪﺷ .

ﻦﯿﺌﺗوﺮﭘنﺎﯿﺑیاﺮﺑﺮﻈﻧدرﻮﻣﻪﻌﻄﻗندﺮﮐنﻮﻠﮐرﻮﻈﻨﻣﻪﺑ

، ﺪﯿﻤﺳﻼﭘزا

pPC6

ﺪـﯿﻟﻮﺗیاﺮﺑﻮﮕﻟاناﻮﻨﻋﻪﺑ

DNA

ﻞـﻣﺎﮐ

KfiB

(aa1-563 ,KfiB)

ﻪــﻌﻄﻗود،

KfiB

ﺪــﻗﺎﻓﻪــﮐ ﺶــﺨﺑ

ﺪــﻧدﻮﺑﯽــﻨﯿﻣآﯽﯾﺎــﻬﺘﻧا

KfiB6) KfiB2 and aa452-563;

(aa147-563; ﻪـــﻌﻄﻗودو

KfiB

ﯽﯾﺎـــﻬﺘﻧاﺶـــﺨﺑﺪـــﻗﺎﻓﻪـــﮐ

ﺪـﻧدﻮﺑﯽﻠﯿﺴـﮐﻮﺑﺮﮐ

KfiB5) KfiB3 and aa1-453;

(aa1-153;

ﺪﺷهدﺎﻔﺘﺳا )

ﺟ ـ لوﺪ 2 .(

ﺤﻣشﺮـﺑزاﺲـﭘ ــ

ﺼ ـ تﻻﻮ

PCR

و

ﮐو ﻫرﻮـﺘــ ــــ ــــﺑﺎـ ـ ﻧآﺎ ـ ـﯾﺰـ ـ ـﻤ ـ یﺎــــﻬ

BamHI-SmaI/KpnI

و ﻞــﻨﻓشورﻪــﺑﺎــﻬﻧآجاﺮﺨﺘــﺳا –

لﺎﺼــﺗاﻞــﻤﻋمرﻮــﻓوﺮﻠﮐ

زﺎـﮕﯿﻟﻢﯾﺰـﻧآرﻮﻀﺣردﺎﻬﻧآتﻻﻮﺼﺤﻣ

T4

رد

0C

16 مﺎـﺠﻧا

ﺖــﻓﺮﮔ . یاﺮﯾﺬــﭘیﺎﻬﻟﻮﻠــﺳ

XL1Blue

شورزاهدﺎﻔﺘــﺳاﺎــﺑ

(11)Mandel,Higa

ﭘوﺪــﺷﻪــﯿﻬﺗ لﻮﺼــﺤﻣیوﺎــﺣﺪﯿﻤــﺳﻼ

PCR

ﻪﺑﻦﺸﯾرﻮﭘوﺮﺘﮑﻟاﺎﯾﯽﺗراﺮﺣکﻮﺷشورزاهدﺎﻔﺘﺳاﺎﺑ

ﺷدراوﺎﻬﻧآﻞﺧاد ـ

ﺪ . ﯿﻨﻠﮐزا ـ یﺪﻌﺑتﺎﻌﻟﺎﻄﻣیاﺮﺑﻖﻓﻮﻣیﺎﻬ

ﺪــﺷهدﺎﻔﺘــﺳا .

ﺲــﭘﻪــﮐﺐــﯿﺗﺮﺗﻦﯾﺪــﺑ جاﺮﺨﺘــﺳازا

DNA

شﺮﺑوﺖـﯿﻠﭘﺢـﻄـﺳردهدﻮـﻤـﻧﺪﺷرﯽﻨﻠﮐﺪﻨﭼزاﺪﯿﻤﺳﻼﭘ

ﮑﯾ،هﺪﻨﻨﮐدوﺪﺤﻣیﺎﻬﻤﯾﺰﻧآﺎﺑﺎﻬﻧآ هزاﺪﻧاﻦﺘﺷادﺎﺑﺎﻬﻧآزاﯽ

رﺎﻈﺘﻧادرﻮﻣ kb)

1,7 ( نﺎﻨﯿﻤﻃاوﯽﺑﺎﯾﯽﻟاﻮﺗزاﺲﭘوبﺎﺨﺘﻧا

لﺎﺳرا ﻦﺘﺧﺎﺳ

لﺎﺳرا

1 2

3

Kps F E D U C S T M

Kfi D C B A

ﻞﮑﺷ 2 : ﯽﻧژ ﻪﺷﻮﺧ ﺲﮑﻠﭙﻤﮐ ﮏﯿﺗﺎﻤﺷ ﻞﮑﺷ لﻮﺴﭙﮐ هﺪﻨﻨﮐ لﺎﺳرا و هﺪﻧزﺎﺳ ﯽﻠﮐﺎﯿﺷﺮﺷا

(4)

نژﻪــﮑﻨﯾازا

KfiB

ردوهﺪــﺷﻪﺘﺧﺎــﺳﺢﯿﺤــﺻترﻮــﺻﻪــﺑ

یاراددﻮﺧیﺎﻬﺘﻧا

His-tag

ناﻮﻨﻋﺖﺤﺗ،ﺪﺷﺎﺑﯽﻣ

pMA1

ﺪﯾدﺮﮔیراﺬﮕﻣﺎﻧ .

ﻦﯿﺌﺗوﺮـﭘنﺎـﯿﺑﺪﯿﯾﺄﺗیاﺮﺑ

KfiB

ﻪـﺑﻞﺼـﺘﻣ

His-tag

ﺳویﺎﻫﺰﯿﻟﺎﻧآ، ﺳاﺎﺑتﻼﺑنﺮﺘ

ـ ﺘﻧآزاهدﺎﻔﺘ ـ

ﺑﯽ ـ یدﺎ

ﻪﯿﻠﻋﯽﺻﺎﺼﺘﺧا

His-tag

ﺪﺷاﺮﺟا .

ﯿﺑ ـ ﺗوﺮﭘنﺎ ـ ﯿﺌ ـ ﺳردﻦ ـ ﯾﻮ ـ ﻫﻪ ـ هﺪﻨﻨﮐﺪﯿﻟﻮﺗنژﻞﻣﺎﺣیﺎ

Seq =

ﯽﻟاﻮﺗ

KfiB

ﻞـﻣﺎﮐﺎﻧتﺎـﻌﻄﻗﺮﮕﯾدﻞﻣﺎﺣﻦﯿﻨﭽﻤﻫوﻞﻣﺎﮐ

KfiB

،

لﻮﻠﺤﻣندوﺰﻓاﺎﺑﯽﺻﺎﺧیﺎﻬﻧﺎﻣزرد (isopropyl-1-

thio-β-D-galacto pyranoside) IPTG

ﺪــﯾدﺮﮔﺎــﻘﻟا .

زاﺲــﭘ

ﺖﺷﺬﮔ 3 -5 زاﺲﭘهﺪﺷﻦﯿﺸﻧﻪﺗﯽﯾﺎﯾﺮﺘﮐﺎﺑیﺎﻬﻟﻮﻠﺳﺖﻋﺎﺳ

ﻂـﺳﻮﺗﺰﯿﻟﺎـﻧآیاﺮـﺑزرﻮﻓوﺮﺘﮑﻟاﺮﻓﺎـﺑﺎـﺑنﺪﺷطﻮﻠﺨﻣ

SDS

-PAGE

ﺪﻧﺪﺷهدﺎﻣآتﻼﺑنﺮﺘﺳوو .

ﺮﻤﯾاﺮﭘ (5’→ 3’)ﯽﻟاﻮﺗ ﺖﯿﺻﻮﺼﺧ رﺎﻈﺘﻧادرﻮﻣهزاﺪﻧا

KF1F CGG GAT CCC GAT GAT GAA

TAA ATT AGT GC

Binds forward strand of kfiB starting from the beginning of kfiB

1.7kb

KF1R ACA GCC CTT GAT TTT AGC

TCT CC

Binds reverse strand of kfiB starting from the end of kfiB

KF2F CGG GAT CCC GGC ATA TAA

TAA AAG ATT GC Binds forward strand of coding seq for amino acid 147kfiB starting from

TCT CC Binds reverse strand of the end of kfiB kfiB starting from

1.2kb

TAA ATT AGT GC Binds forward strand of the beginning of kfiB kfiB starting from 0.45kb

KF3R GGG GTA CCC CGC AAT CTT

TTA TTA TAT GC Binds reverse strand of coding seq for amino acid 147kfiB starting from

TAA ATT AGT GC Binds forward strand of the beginning of kfiB kfiB starting from 1.36kb

KF5R GGG GTA CCC CAT ATA GCA

CAG GTG G Binds reverse strand of coding seq for amino acid 453kfiB starting from

KF6F CGG GAT CCA TGG AGC AGC

TGA GCA G Binds forward strand of coding seq for amino acid 452 kfiB starting from

TCT CC Binds reverse strand of the end of kfiB kfiB starting from

0.33kb

لوﺪﺟ 1

: ﻪﻌﻟﺎﻄﻣ ﻦﯾا رد هدﺎﻔﺘﺳا درﻮﻣ یﺎﻫﺮﻤﯾاﺮﭘ

=Ampr

ﻦﯿﻠﯿﺳﯽﭙﻣآﻪﺑموﺎﻘﻣ = aa ﺪﯿﺳاﻮﻨﯿﻣآ

لوﺪﺟ 2 : ﻪﻌﻟﺎﻄﻣ ﻦﯾا رد هﺪﺷ ﻪﺘﺧﺎﺳ یﺎﻫ ﺪﯿﻤﺳﻼﭘ

ﺪﯿﻤﺳﻼﭘ تﺎﯿﺻﻮﺼﺧ

pMA1

Ampr, 6xHis tag fusion of full-length kfiB (encodes aa1-563) in pQE32 vector at BamHI–Sma I sites

pMA2

Ampr, 6xHis tag fusion of truncated kfiB lacking N-terminal domain (encodes aa147-563) in pQE32

vector at BamHI – Kpn I sites pMA3

Ampr_{, 6xHis tag fusion of truncated}_kfiB_{lacking C-terminal domain ( encodes aa}

1-153) in pQE32

vector at BamHI – Kpn I sites pMA5

Ampr_{, 6xHis tag fusion of truncated}_kfiB_{lacking C-terminal domain ( encodes aa}

1-453) in pQE32

vector at BamHI – Kpn I sites

pMA6

Ampr, 6xHis tag fusion of truncated kfiB lacking N-terminal domain (encodes aa452-563) in pQE32

vector at BamHI – Kpn I sites

(5)

ﯽـﺳﺎﻣﻮﮐﺎـﺑیﺰﯿﻣآﮓﻧرزاﺲﭘزرﻮﻓوﺮﺘﮑﻟایﺎﻬﻟژزاﯽﮑﯾ

راﺮـﻗهدﺎﻔﺘـﺳادرﻮـﻣﻦﯿﺌﺗوﺮـﭘیﺎﻫﺪـﻧﺎﺑهﺪﻫﺎﺸـﻣرﻮﻈﻨﻣﻪﺑﻮﻠﺑ

ﺖﻓﺮﮔ . یﺎﺸـﻏﮏـﯾﻪـﺑﺎـﻫﻦﯿﺌﺗوﺮﭘلﺎﻘﺘﻧاﺖﻬﺟمودلژزا

(Millipore)PVDF

شورزا

(Towbin et.al)

هدﺎﻔﺘــــﺳا

ﺪﺷ ) 12 .(

ﯽﻟﻮﻠﺳءاﺰﺟاﻪﯿﻬﺗیاﺮﺑ ﺪـﺘﻣزا

Bronner

ﺶﻧارﺎـﮑﻤﻫو

) 13 ( ﺪﺷهدﺎﻔﺘﺳا .

ءﺰـﺟﯽﮔدﻮـﻟآناﺰـﯿﻣیﺮـﯿﮔهزاﺪـﻧایاﺮـﺑ

هﺪـﺷیزﺎـﺳﻞﯾﺪـﻌﺗشورزاﯽﻤـﺳﻼﭘﻮﺘﯿﺳءاﺰـﺟاﺎﺑﯽﺋﺎﺸﻏ

Maagd&Lugtenberg

) 14 ( ﺪـــﺷهدﺎﻔﺘـــﺳا .

شورﻦـــﯾارد

ﻫدتﻻﺎـــﻣناﺰـــﯿﻣ زﺎﻧژورﺪـــﯿ

(MDH)

ﻢﯾﺰـــﻧآﮏـــﯾﻪـــﮐ

دﻮـﺷﯽـﻣیﺮـﯿﮔهزاﺪـﻧاﺖﺳاﯽﻤﺳﻼﭘﻮﺘﯿﺳ .

یاﺮـﺑﻦﯿـﻨﭽﻤﻫ

هدﺎﻔﺘـﺳاﺎـﺑءﺎﺸﻏﺎﺑﯽﻤﺳﻼﭘﻮﺘﯿﺳءﺰﺟﯽﮔدﻮﻟآناﺰﯿﻣﺶﺠﻨﺳ

شورزا

Hayashi

ﺶﻧارﺎﮑﻤﻫو )

15 ( ﺖﯿﻟﺎﻌﻓناﺰﯿﻣ

NADH

زﺎﻧژورﺪــﯿﻫدﺪﯿﻧﺎﯿــﺳیﺮــﻓ

(NFD)

درﻮــﻣءﺎﺸــﻏﻪــﺑﻞﺼــﺘﻣ

ﺖﻓﺮﮔراﺮﻗهدﺎﻔﺘﺳا .

اﺰﯿﻣشورودﺮﻫرد ﺮـﺘﻤﮐمﺎﺗﺖﯿﻟﺎﻌﻓن

یوﺎﺴﻣﺎﯾ 3

% ﯽﻣنﺎﺸﻧارﺮﮕﯾدءﺰﺟﻪﺑضﺎﻤﻏاﻞﺑﺎﻗﯽﮔدﻮﻟآ

ﺪﻫد .

ﺞﯾﺎﺘﻧ ﺎـﺑﯽـﻨﯿﺌﺗوﺮﭘﺪـﻧﺎﺑﮏـﯾدﻮـﺟوهﺪﻨﻫدنﺎﺸﻧﻪﻠﺻﺎﺣﺞﯾﺎﺘﻧ

ﯽﻟﻮﮑﻟﻮﻣنزو

KDa

66 ) یاﺮـﺑرﺎـﻈﺘﻧادرﻮـﻣﺪـﻧﺎﺑ

KfiB (

و

دﻮﺑﺮﺘﮑﭼﻮﮐیﺎﻫﺪﻧﺎﺑ .

ﺮﺘﮑﭼﻮﮐیﺎﻫﺪﻧﺎﺑﻪﮐﺪﯿﺳرﯽﻣﺮﻈﻧﻪﺑ

نﺪﺷﻪﺘﺴﮑﺷزا

KfiB

ﺎﺠﯾا ﺪﻨـﺷﺎﺑهﺪـﺷد .

رد

SDS-PAGE

ﺮـﻈﻧدرﻮـﻣﻦﯿﺌﺗوﺮـﭘ،ﻮﻠﺑﯽﺳﺎﻣﻮﮐﻂﺳﻮﺗهﺪﺷیﺰﯿﻣآﮓﻧر

دﻮﺒﻧهﺪﻫﺎﺸﻣﻞﺑﺎﻗ .

ﺪﯿﻟﻮﺗﻦﯿﯾﺎﭘناﺰﯿﻣﻦﺘﻓﺮﮔﺮﻈﻧردﺎﺑﻦﯾاﺮﺑﺎﻨﺑ

ﺪـﯿﻟﻮﺗﻞـﻣﺎﮐﻦﯿﺌﺗوﺮـﭘیﻻﺎـﺑﺖﯿﺳﺎﺴﺣﺎﺑهاﺮﻤﻫﻦﯿﺌﺗوﺮﭘﻦﯾا

ﻪـﻌﻟﺎﻄﻣﻪﻣاداﻪﺑﻢﯿﻤﺼﺗ،ﯽﮑﯿﺘﯿﻟﻮﺌﺗوﺮﭘﺐﯾﺮﺨﺗﻪﺑﺖﺒﺴﻧهﺪﺷ

ﺎــﺠﯾاﻖــﯾﺮﻃزا تﺎــﻌﻄﻗﻪــﮐﺮــﮕﯾدﯽﻧﺎــﯿﺑرﺎﺘﺧﺎــﺳﻦﯾﺪــﻨﭼد

زاتوﺎﻔﺘﻣ

KfiB

یﺎـﻬﺘﻧاودزاﯽـﮑﯾزاﯽﯾﺎﻬﺸـﺨﺑﺪـﻗﺎﻓﻪﮐ

ﻪــﺑﻞﺼــﺘﻣ وﯽــﻨﯿﻣآﺎــﯾﯽﻠﯿﺴــﮐﻮﺑﺮﮐ

His-tag

ﯽــﻣﺪــﯿﻟﻮﺗار

ﺪﯿﺳرﯽﻣﺮﻈﻧﻪﺑیروﺮﺿﺪﻧدﻮﻤﻧ .

زاهدﺎﻔﺘﺳاﺎﺑﯽﺗﺎﻌﻄﻗﻦﯿﻨﭼ

وﯽﺻﺎﺼــﺘﺧایﺎــﻫﺮﻤﯾاﺮﭘ

pMA1

ــﺑ ﻪ ﺎــﺑﻮــﮕﻟاناﻮــﻨﻋ

PCR

زاﺲــﭘوهﺪــﺷﻪﺘﺧﺎــﺳ ﻪــﺑلﺎﺼــﺗا

pQE32

ﻪــﺑلﺎــﻘﺘﻧاو

XL1Blue

،ﯽﺑﺎــﯾﯽﻟاﻮــﺗوﯽــﻤﯾﺰﻧآشﺮــﭘشورﻪــﺑﺪــﯿﯾﺎﺗو

ﻦﯾوﺎﻨﻋﺖﺤﺗ

pMA2,3,5,6

ﺪﻧﺪﺷیراﺬﮕﻣﺎﻧ .

ﻪـﺑیدﺎﺑﯽﺘﻧآ

ﺘﻓررﺎﮐ ـ یاﺮﺑﻪ ﺷ ـ ﺳﺎﻨ ـ ﯽﺋﺎ

His-tag

ﯾﻮﻣ ـ ﻟﻮﺗﺪ ـ ﺗﺪﯿ ــ ﮑ ـ یﺎﻫﻪ

ﺌﺗوﺮﭘ ـ ﻨﯿ ـ ﯽ

KfiB

ﺻﯽﻟﻮﮑﻠﻣنزوﺎﺑ ـ

ﻣﺢﯿﺤ ـ رﺎﻈﺘﻧادرﻮ ﻌﯾ

ـ ﯽﻨ ﺌﺗوﺮﭘ

ـ ﻨﯿ ـ ﯽ

KfiB

ﺻﯽﻟﻮﮑﻠﻣنزوﺎﺑ ـ

ﻣﺢﯿﺤ ـ رﺎﻈﺘﻧادرﻮ ﻌﯾ

ـ ﯽﻨ

5

.

21

(pMA3)

، 55

(pMA5)

و 16 نﻮﺘﻟادﻮﻠﯿﮐ

(pMA6)

دﻮﺑ . یوﺎـﺣﻪﯾﻮـﺳردﯽـﻨﯿﺌﺗوﺮﭘﭻﯿـﻫﺎﻣا

pMA2

بﺎـﯿﻏرد

ﺪﺸﻧهﺪﻫﺎﺸﻣلﻮﺴﭙﮐیﺎﻬﻨﯿﺌﺗوﺮﭘﺮﯾﺎﺳ .

ﺎــﺑﺎــﻬﻨﯿﺌﺗوﺮﭘﻞــﻣﺎﮐﺎﻧتﺎــﻌﻄﻗﺎــﯾﻞــﻣﺎﮐﻦﯿﺌﺗوﺮــﭘنﺎــﯿﺑ

pMA6,pMA5,pMA3, pMA1

رﻮﻀـﺣنوﺪـﺑ

IPTG

ـﯿﻧ ﺰ

ﺚـﻋﺎﺑلﻮﺴـﭙﮐیﺎـﻬﻨﯿﺌﺗوﺮﭘﺮـﮕﯾدرﻮﻀـﺣ،هدﻮﺑﺖﯾورﻞﺑﺎﻗ

ﻞﻣﺎﮐﻦﯿﺌﺗوﺮﭘیراﺪﯾﺎﭘﺶﯾاﺰﻓا

KfiB

ﻪـﮐﺪـﻨﭼﺮـﻫ،ﺪﺷﯽﻣ

ﻦـﯾا،ﺪـﺷﯽﻣهﺪﻫﺎﺸﻣﺰﯿﻧﺮﮕﯾدتﺎﻌﻄﻗردیﺪﺣﺎﺗﺮﯿﺛُﺎﺗﻦﯾا

ﺎﺑﻦﯿﺌﺗوﺮﭘﺪﯿﻟﻮﺗردیﺮﯿﺛﺎﺗرﻮﻀﺣ

pMA2

ﺖﺷاﺪﻧ ) ﻞﮑﺷ 2 (

ﻞﮑﺷ

2

;

ﻞـﻣﺎﮐﻦﯿﺌﺗوﺮـﭘﻞﯿﻠﺤﺗوﻪﯾﺰﺠﺗ

ﻞـﻣﺎﮐﺎﻧتﺎـﻌﻄﻗو

6His-KfiB

هﺪﺸﻧﺎﻘﻟاﻂﯾاﺮﺷرد

نﻮﺘﺳ 1 ، XL1-Blue[pMA1]

نﻮﺘﺳ 2 ،

XL1-Blue[pMA1][pPC6::23]

نﻮﺘﺳ 4 ، XL1-Blue[pMA2][pPC6::23]

66 kD

a

55 kD a

2 1. 5

k ₁₆

kDa

10

9

8

7

6

5

4

3

2

1

(6)

ندﻮﻤﻧﻞﯿﻤﮑﺗیﺎﻫﺰﯿﻟﺎﻧآ

(complementation)

ﺎﻬﺸﻬﺟ

ﻦﯿﺌﺗوﺮـﭘیزﺎﺳﻞﯿﻤﮑﺗدﺮﮑﻠﻤﻋﻦﯿﯿﻌﺗرﻮﻈﻨﻣﻪﺑ

KfiB

،

زاتوﺎــﻔﺘﻣیﺎﻫرﺎﺘﺧﺎــﺳمﺎــﻤﺗ

KfiB

یﺮﺘﮐﺎــﺑﻞــﺧادﻪــﺑ

[pPc6::23] XL1Blue

ﺪﻧﺪـــﺷﻞـــﻘﺘﻨﻣ .

MS101

نﺎـــﯿﺑﺎـــﺑ

لﻮﺴﭙﮐ

K5

ژﺎـﻓﻮﯾﺮﺘﮐﺎﺑﻪﺑ

K5

،هدﻮـﺑسﺎﺴـﺣ pPC6::23

ﺪـﯿﻟﻮﺗیاﺮـﺑﻪـﺘﻓﺎﯾﺶـﻬﺟﮏـﯾناﻮﻨﻌﺑ

KfiB

ﺪـﯿﻟﻮﺗﯽﯾﺎـﻧاﻮﺗ

لﻮﺴــﭙﮐ

K5

لﺮــﺘﻨﮐیاﺮــﺑودﻦــﯾازایورﻦــﯾازادراﺪــﻧار

ﺪـﯾدﺮﮔهدﺎﻔﺘـﺳاﯽـﻔﻨﻣوﺖﺒﺜﻣ .

ﻒـﻠﺘﺨﻣیﺎﻫﺪﯿﻤـﺳﻼﭘﻪـﻤﻫ

KfiB

یﺎﻨﺜﺘــﺳاﻪــﺑ

pMA1

نﻮﯿـــﺳﺎﺗﻮﻣیزﺎــﺳﻞــﯿﻤﮑﺗرد

pPC6::23

ﺪﻧدﻮﺑناﻮﺗﺎﻧلﻮﺴﭙﮐﺪﯿﻟﻮﺗﯽﯾﺎﻧاﻮﺗنﺪﻧادﺮﮔزﺎﺑو .

ﻂـﺳﻮﺗﯽﻤـﺳﻼﭘﻮﺘﯿﺳوﯽﯾﺎﺸـﻏءاﺰـﺟاﻞـﯿﻠﺤﺗوﻪﯾﺰﺠﺗ تﻼﺑنﺮﺘﺳو

یﺎﻬﺘﺴـﺗﯽﻤـﺳﻼﭘﻮﺘﯿﺳزاﯽﺋﺎﺸﻏءاﺰﺟاﮏﯿﮑﻔﺗلﺎﺒﻧدﻪﺑ

NFD

و

MDH

ءﺰﺟودﻦﯾاﯽﮔدﻮﻟآناﺰﯿﻣﻪﮐﺪﻧدﻮﻤﻧﺪﯿﯾﺄﺗ

ﺖﺳاضﺎﻤﻏاﻞﺑﺎﻗﺮﮕﯾﺪﻤﻫﺎﺑ .

ﺮﯾﺎــﺳناﺪــﻘﻓردﻪــﮐدادنﺎﺸــﻧتﻼــﺑنﺮﺘــﺳوﺞﯾﺎــﺘﻧ

یﺰﺘﻨـﺳﻮﯿﺑﺲﮑﻠﭙﻤﮐیﺎﻬﻨﯿﺌﺗوﺮﭘ

K5

ﻦﯿﺌﺗوﺮـﭘﻞـﻣﺎﮐﻪـﻌﻄﻗ،

KfiB

ردﻪــﻧوهدﻮــﺑءﺎﺸــﻏﻪــﺑلﺎﺼــﺗاوﻊــﻤﺠﺗﻪــﺑردﺎــﻗﻪــﻧ

دﻮﺷﯽﻣهﺪﯾدﻢﺳﻼﭘﻮﺘﯿﺳ .

یﺎـﻬﻨﯿﺌﺗوﺮﭘﺮـﮕﯾدرﻮﻀـﺣردﺎﻣا

دﻮـﺷﯽﻣﻞﺼﺘﻣءﺎﺸﻏﻪﺑﻦﯿﺌﺗوﺮﭘﻦﯾاﻢﻈﻋاﺖﻤﺴﻗیﺰﺘﻨﺳﻮﯿﺑ

) ﻞﮑــــﺷ 3 ﻒــــﻟا .( یﺎــــﻬﻨﯿﺌﺗوﺮﭘﺮﯾﺎــــﺳناﺪــــﻘﻓرد

K5

،

ﻦﯿﺌﺗوﺮﭘ 5 / 21

ـﺷﺪـﯿﻟﻮﺗﯽﻧﻮﺘﻟادﻮﻠﯿﮐ ـ

ﺎـﺑهﺪ

pMA3

ـﻫ ـ ردﻢ

ﺟ ـ ﺘﯿﺳءﺰ ـ ﺳﻼﭘﻮ ـ دﻮـﺷﯽـﻣهﺪﻫﺎﺸﻣﯽﺋﺎﺸﻏءﺰﺟردﻢﻫوﯽﻤ

ﻪـﺑﺮـﺠﻨﻣﺖـﺳاﻦﮑﻤﻣﺲﮑﻠﭙﻤﮐیﺎﻬﻨﯿﺌﺗوﺮﭘﺮﮕﯾدرﻮﻀﺣو

دﻮﺸـﺑﯽﺋﺎﺸـﻏءﺰﺟردﻪﻌﻄﻗﻦﯾاﺮﺘﺸﯿﺑﻊﻤﺠﺗ ).

ﻞﮑـﺷ 3 ب .(

یﺎـﻬﻨﯿﺌﺗوﺮﭘﺮﯾﺎـﺳناﺪﻘﻓرد

K5

ﻦﯿﺌﺗوﺮـﭘ، 55

ﯽﻧﻮـﺘﻟادﻮـﻠﯿﮐ

ﺎـﺑهﺪﺷﺪﯿﻟﻮﺗ

pMA5

،ﯽﺋﺎﺸـﻏءﺰـﺟردهﺪﻫﺎﺸـﻣﻢـﻏرﯽـﻠﻋ

رﻮﻀـﺣردودﻮـﺷﯽـﻣهﺪﻫﺎﺸـﻣﯽﻤﺳﻼﭘﻮﺘﯿﺳءﺰﺟردﺮﺘﺸﯿﺑ

دوﺪـﺣردﯽـﻨﯿﺌﺗوﺮﭘﺪـﻧﺎﺑﮏـﯾﺮـﮕﯾدیﺎﻬﻨﯿﺌﺗوﺮﭘ 110

ﻮـﻠﯿﮐ

ﺮﻤﯾادﮏﯾﺪﻧاﻮﺗﯽﻣﻪﮐنﻮﺘﻟاد

KfiB

مﺎـﺗلﻮﺼـﺤﻣردﺪﺷﺎﺑ

هﺪـﺷﺐـﯾﺮﺨﺗیﺎﻬﻟﻮﻠﺳ

ﻼﭘﻮﺘﯿﺳءﺰـﺟو ﯽـﻣهﺪﻫﺎﺸـﻣﯽﻤـﺳ

دﻮﺷ ) ﻞﮑﺷ 3 ج .( ﺮﯾﺎـﺳناﺪـﻘﻓﺎـﯾ رﻮﻀـﺣﺖـﻟﺎﺣودﺮﻫرد

ﻦﯿﺌﺗوﺮﭘ،ﺎﻬﻨﯿﺌﺗوﺮﭘ 16

ﺎـﺑهﺪـﺷﺪﯿﻟﻮﺗﯽﻧﻮﺘﻟادﻮﻠﯿﮐ

pMA6

رد

ﯽﻤــﺳﻼﭘﻮﺘﯿﺳوﯽﺋﺎﺸــﻏ ودﺮــﻫردیاﻪﺴــﯾﺎﻘﻣﻞــﺑﺎﻗﺮﯾدﺎــﻘﻣ

ﺪﻨﺑﺎﯾﯽﻣﻊﻤﺠﺗ )

ﻞﮑﺷ 3 د .( یﺰـﯿﻣآﮓـﻧریﺎـﻬﻟژﻦﯿـﻨﭽﻤﻫ

اﯽﯾﺎﺳﺎﻨﺷﻞﺑﺎﻗﺮﯾدﺎﻘﻣﻮﻠﺑﯽﺳﺎﻣﻮﮐﺎﺑهﺪﺷ ﺎـﻬﻨﯿﺌﺗوﺮﭘﻊـﻤﺠﺗز

ﻞﻣﺎﮐﺎﻧتﺎﻌﻄﻗﯽﺋﺎﺸﻏءﺰﺟردار

KfiB

ﺪﻧداﺪﻧنﺎﺸﻧ .

ﻞﮑﺷ 3

;

ﻣﺎﮐﺎﻧ تﺎﻌﻄﻗ و ﻞﻣﺎﮐ ﻦﯿﺌﺗوﺮﭘ ﻊﻤﺠﺗ ﻞﺤﻣ ﻞﯿﻠﺤﺗ و ﻪﯾﺰﺠﺗ ﻞ

6His-KfiB

یﺰﺘﻨـﺳﻮﯿﺑ ﺲﮑﻠﭙﻤﮐ یﺎﻬـﻨـﯿﺌـﺗوﺮـﭘ ﺮﯾﺎـﺳ رﻮﻀﺣ ﺎﯾ ناﺪﻘﻓ ﺖﻟﺎﺣ رد

K5

) 1 و 2 و 3 ءﺰـﺟ ،هﺪـﺷ ﺐـﯾﺮﺨﺗ یﺎﻬﻟﻮﻠـﺳ مﺎﺗ لﻮﺼﺤﻣ ﻪﺑ طﻮﺑﺮﻣ ﺐﯿﺗﺮﺘﺑ

ﺪﻨﺷﺎﺑ ﯽﻣ ﯽﻤﺳﻼﭘﻮﺘﯿﺳ ءﺰﺟ و ﯽﺋﺎﺸﻏ .(

ﺚﺤﺑ ﭗـﯿﺗﻮﻨﻓﻦﺘﻓﺎﯾﺮﻫﺎﻈﺗﻪﮐدادنﺎﺸﻧﻪﻌﻟﺎﻄﻣﻦﯾا

pPC6::23

نژردﺐـﯾﺮﺨﺗﻞﯿﻟدﻪﺑ

KfiB

ﺮـﭘوهدﻮـﺑ ﻞـﻣﺎﮐﻦﯿﺌﺗو

KfiB

ﻂﺳﻮﺗﻪﮐﻦﯾﺪﯿﺘﺴﯿﻫﻪﺑﻞﺼﺘﻣ

pMA1

ﯽﺘﯿﻟﺎﻌﻓ،دﻮﺷﯽﻣنﺎﯿﺑ

ﻦﯿﺌﺗوﺮﭘﺎﺑﻪﺑﺎﺸﻣ

KfiB

درادﯽﺸﺣو .

ﻦﯿﺌﺗوﺮﭘ

KfiB

ﻪﺑﻞﺼﺘﻣ

یاﺮـﺑﻞـﯿﻟدﻦﯿـﻤﻫﻪـﺑ ﻪـﮐدرادﯽـﻤﮐًﺎﺘﺒﺴـﻧنﺎـﯿﺑﻦﯾﺪﯿﺘﺴﯿﻫ

ﺪﺷﺎﺑﯽﻣﺐﺳﺎﻨﻣﺎﻧﺺﯿﻠﺨﺗفاﺪﻫا .

نﺎﯿﺑیاﺮﺑیدﺪﻌﺘﻣﻞﯾﻻد

اردﺐﯿﮐﺮﺗﻮﻧیﺎﻬﻨﯿﺌﺗوﺮﭘردﻢﮐ ﺪﺷﺎﺑﯽﻣحﺮﻄﻣﯽﻠﮐﺎﯿﺷﺮﺷ

. ﺪـﺷﺎﺑﯽـﻣحﺮـﻄﻣﺎـﻬﻧآندﻮـﺑﯽﻤـﺳﻪـﮐﯽﯾﺎـﻬﻨﯿﺌﺗوﺮﭘمﻮﻤﻋ

ﺎـﺑﻪـﮐﺪـﻧاﯽﺋﺎﺸـﻏیﺎﻬﻨﯿﺌﺗوﺮﭘ

DNA

لﺎـﻘﺘﻧایﺎﻬﻤﺘﺴـﯿﺳﺎـﯾ

ﻞﺧاﺪﺗنوﺮﺘﮑﻟا (interaction)

ﺪﻨﻨﮐﯽﻣاﺪﯿﭘ .

KfiB

ﮏـﯾ

ترﻮـﺻﻪـﺑﻦﯿﺌﺗوﺮـﭘﻦﯾانﺎﯿﺑناﺰﯿﻣﻪﮐﺖﺳاﯽﺋﺎﺸﻏﻦﯿﺌﺗوﺮﭘ

دﻮﺑﻢﮐﻞﻣﺎﮐ .

ﯿﺌﺗوﺮـﭘﻦﯾاﻪﮐﯽﻣﺎﮕﻨﻫ زاﺮﺗﻻﺎـﺑﺮﯾدﺎـﻘﻣردﻦ

ﻪـﺑﺖـﺳاﻦـﮑﻤﻣدﻮـﺷﯽـﻣنﺎـﯿﺑلﻮﻠﺳﻞﺧادردلﻮﻤﻌﻣﺪﺣ

ﻟد ـ ﻞﯿ ﺼﺗا ـ ﻀﺣﺎﯾلﺎ ـ ﯾارﻮ ـ ﺌﺗوﺮﭘﻦ ـ ﯿﺳردﻦﯿ ـ ﯽﺗﺎﯿﺣیﺎﻬﻤﺘﺴ

ﮐﻪﺑﺮﺠﻨﻣﯽﻟﻮﻠﺳﻢﺴﯿﻟﻮﺑﺎﺘﻣردﻞﺧاﺪﺗﺎﯾﯽﯾﺎﺸﻏ ـ

ﺑﺶﻫﺎ ـﯿ ـ نﺎ

ﭘـ ﺌﺗوﺮ ـﯿ ـ دﻮﺸﺑقﻮﻓیﺎﻬﻨ .

یدراﻮﻣردیﺪﻌﺑتﺎﻌﻟﺎﻄﻣرد

ﺗﻪﮐ ـ ﯿﻟﻮ ـ ﻣﺪ ـ ﻘ ـ ﯾدﺎ ـ ﯾﻻﺎﺑﺮ

ـﺌﺗوﺮﭘزاﯽ ـ

ـﻣﺎﮐﻦ ـ ﻞ

KfiB

ﻞﺼـﺘﻣ

ﻦﯿـﻨﭼردنآﻦﯿﯾﺎـﭘنﺎـﯿﺑﺪـﯾﺎﺑﺪـﺷﺎﺑزﺎـﯿﻧدرﻮـﻣﻦﯾﺪﯿﺘﺴﯿﻫﻪﺑ

ﯽﻄﯾاﺮﺷ دﺮﯿﮕﺑراﺮﻗﺮﻈﻧﺪﻣ .

ناﺰﯿﻣﺎﺑﻪﮐﯽﺘﯿﻤﺳﺶﻫﺎﮐیاﺮﺑ

ﻦﯿﺌﺗوﺮﭘﻦﯾایﻻﺎﺑﺪﯿﻟﻮﺗ دﻮﺷﯽﻣدﺎﺠﯾا

هدﺎﻔﺘﺳاﺎﺑناﻮﺗﯽﻣ زا

یﺎﻬﻨﯿﺌﺗوﺮﭘ ﺮﯾﺎﺳ رﻮﻀﺣ رد

K5

یﺎﻬﻨﯿﺌﺗوﺮﭘ ﺮﯾﺎﺳ ناﺪﻘﻓ رد

K5

1 2 3

MA 1

MA 3

MA 5

MA 6

ﻒﻟا

ب

ج

د

(7)

هﺪــﻨﻫدﺖــﻣﻼﻋﯽﻟاﻮــﺗﮏــﯾ

(signal sequence)

ﻪــﮐ

اﺪﻫﺚﻋﺎﺑ ﻪـﺑدﻮـﺷﯽـﻣﯽﻤـﺳﻼﭘیﺮﭘیﺎﻀﻓﻪﺑﺎﻬﻨﯿﺌﺗوﺮﭘﺖﯾ

دادﻞﯿﻠﻘﺗارﯽﻤﺳتاﺮﺛاﻦﯾاﯽﻬﺟﻮﺗﻞﺑﺎﻗناﺰﯿﻣ .

ﺪﺷرتراﺮﺣﺶﻫﺎﮐﺎﺑﺮﺗهدﺎﺳشورﮏﯾ ردﻦﯿﻨﭽﻤﻫ

ﺎﺗ

oc

25 ﺖﺳاهﺪﻣآﺖﺳدﻪﺑﻪﻨﯿﻣزﻦﯾاردﯽﯾﺎﻬﺘﯿﻘﻓﻮﻣ )

16 . (

فاﺪـﻫاوﻞﮑﺸـﻣﻦـﯾاﺮـﺑنﺪﻣآﻖﺋﺎﻓیاﺮﺑﻪﻌﻟﺎﻄﻣﻦﯾاردﺎﻣ

ﻠﺘﺨﻣتﺎﻌﻄﻗ،ﺮﮕﯾد ﯽـﮑﯾزاﯽﯾﺎﻬﺸـﺨﺑ ﻪـﮐارﻦﯿﺌﺗوﺮﭘزاﯽﻔ

ﻢﯾدﻮــﻤﻧدﺎــﺠﯾادﻮــﺑهﺪــﺷفﺬــﺣﺎــﻬﻧآیﺎــﻬﺘﻧاودزا .

نﺎــﯿﺑ

ﯽــﻨﯿﻣآﻪــﻧﺎﯾﺎﭘزاﯽﺸــﺨﺑﺪــﻗﺎﻓیﺎــﻬﻨﯿﺌﺗوﺮﭘ

(N-terminus)

ﻓ، ـ ﻘ ـ ﻂ

ﻣالﻮﺴﭙﮐﻪﺑطﻮﺑﺮﻣیﺎﻬﻨﯿﺌﺗوﺮﭘﺮﮕﯾدرﻮﻀﺣرد ـ

نﺎﮑ

ﺮﯾﺬــﭘ دﻮــﺑ . ﺶﯾاﺰــﻓازاﯽــﺳﺎﮑﻌﻧاﺪــﻧاﻮﺗﯽــﻣعﻮــﺿﻮﻣﻦــﯾا

ﺖﯿﺳﺎﺴﺣ ﻤﯾﺰﻧآﻪﺑﺖﺒﺴﻧ

ـ ﺗوﺮﭘیﺎﻬ ـﺌ ـ ﻟﻮ ـ ﺷردهﺪﻨﻨﮐﺰﯿ ـ

ﯾاﺮ ـ ﻂ

ﺖﯿﻤﻫاهﺪﻨﻫدنﺎﺸﻧولﻮﺴﭙﮐیﺎﻬﻨﯿﺌﺗوﺮﭘﺮﮕﯾدناﺪﻘﻓ

یﺎﻬﺘﻧا

ﯽﻨﯿﻣآ

KfiB

ﺪﺷﺎﺑ . ﻦﯿﺌﺗوﺮﭘ 16 ﯿﮐ ـ ﻟادﻮﻠ ـﺘ ـ ﺗﯽﻧﻮ ـ ﻟﻮ ـ هﺪﺷﺪﯿ

9). Sieberth V. Rigg GP, Roberts IS, Jann K. Expression and characterization of UDPGlc

dehydrogenase (KfiD), which is encoded in the type-specific region 2 of the Escherichia coli K5 capsule genes. J.Bacteriol. 1995;177:4562-4565.

10). Rigg GP, Barrett B, Roberts IS. The localization of KpsC, S and T, and KfiA, C and D proteins involved in the biosynthesis of the Escherichia coli K5 capsular polysaccharide: evidence for a membrane-bound complex. Microbiology. 1998; 144 (Pt 10):2905-2914. 11). Mandel M, HigaA. Calcium-dependent bacteriophage DNA infection. J. Mol. Biol., 1970;14;53(1):159-62.

12). Towbin H, Staehelin T, Gordon J. Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose filters: procedure and some applications. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1979;76: 4350-4354. 13). Bronner D, Sieberth V, Pazzani C, Smith A, Boulnois G, Roberts I, Jann B, Jann, K. Synthesis of the K5 (group II) capsular polysaccharide in transport-deficient recombinant Escherichia coli. FEMS Microbiol. Lett. 1993.,1;113(3):279-84.

14). De Maagd RA, Lugtenberg B. Fractionation of Rhizobium leguminosarum cells into outer membrane, cytoplasmic membrane, periplasmic, and cytoplasmic components. J. Bacteriol. 1986; 167(3):1083-5.

15). Hayashi M, Miyoshi T, Takashina S, Unemoto T. Purification of NADH-ferricyanide dehydrogenase and NADH-quinone reductase from Escherichia coli membranes and their roles in the respiratory chain. Biochim. Biophys. Acta., 1989;26;977(1):62-9.

16). Waeber U, Buhr A, Schunk T. Erni B. The glucose transporter of Escherichia coli. Purification and characterization by Ni+ chelate affinity chromatography of the IIBCGlc subunit. FEBS Lett. 1993; 7;324(1):109-12.

ﺎﺑ

pMA6

ـﯾﺎﭘوﺪـﯿﻟﻮﺗناﺰﯿﻣﻞﯿﻟدﻪﺑ ـ

ﻣیراﺪ ـ ﺎﻨ ـﺳ ـ دﺰﻣﺎـﻧﺐ

ﺑﻮﺧ ـ

ﺨﺗیاﺮـﺑﯽ ـ

ـﯿﻠ ـ ﺘﺳاوﺺ ـ ـﻔ ـ ـﺗردهدﺎ ـ ـﻧآﺪﯿﻟﻮ ـ یدﺎـﺑﯽﺘ

یاﺮﺑﯽﺻﺎﺼﺘﺧا

KfiB

ﯿﻫﺪﺷﺎﺑﯽﻣ ـ

ﯾﭻ ـ

ﺳﻼﭘزاﮏ ـ

ﻤ ـ ﺎﻫﺪﯿ

ﺳاﻪﺑ ـﺘ ـ یﺎﻨﺜ

pMA1

ﻗ ـ

ﻤﮑﺗﻪـﺑردﺎ ــ

ـﯿ ـ ـﺟوﻞ ـ ـﺛﺎﺗناﺮﺒ ـ تاﺮﯿ

ﺟ ـ ﻬ ـ

ﮐﺎﺑﻪـﺑلﻮﺴـﭙﮐﺪـﯿﻟﻮﺗنﺎـﮑﻣانﺪﯿﻧادﺮﮔزﺎﺑوﺶ ـ

ـﺘ ـ یﺮ

ﺟیاراد ـ ـــﻬ ـ ﺶ

(null mutant) رد

KfiB (K5-)

ﻧ ـ ـــﺒ ـ دﻮ .

ﺗـ ﻤﮑ ـ ﻘﻓﻮﻣﻞﯿ ـ ﺎﺑﺰﯿﻣآﺖﯿ

pMA1

ﻧﻪـﮐﻦـﯾاﺮـﺑهوﻼﻋ ــ

ﺸ ـ نﺎ

ﻫد ـ

ﻗﻪﺑزﺎﯿﻧهﺪﻨ ـ

ﻌﻄ ـ ﻣﺎﮐﻪ ـ ﭘﻞ ـ ﺗوﺮ ـﺌ ـ ﻦﯿ

KfiB

ـﺑ ـ ﺗیاﺮ ـ ـﯿﻟﻮ ـ ﺪ

ﺴﭙﮐ ـ ﺑﯽﻣلﻮ ـ ﺷﺎ ـ ﺣ،ﺪ ـ ﮑ ـ ﯾﺎ ـ ﻋزاﺖ ـ ﺣاﺰﻣمﺪ ـ ـﻤ ـ ﻗﺖ ـ ﻄ ـ ـﻌ ـ ﻪ

6His-tag

ﺑ ـ ﯾایاﺮ ـ درادرﻮﻈﻨﻣﻦ .

ﻋاﺖﻈﻓﺎﺤﻣ ـ

ـﺷﺎﻄ ـ ﻪـﺑهﺪ

ﭘـ ﺌﺗوﺮ ـﯿ ـ ﻦ

KfiB

ﻧدﻪﺑ ـﺒ ـ ﺗلﺎ ﺠ ـ

ـﯾدﺎﺑنآﻊﻤ ـ

ـﺌﺗوﺮﭘﺮﮕ ـ یﺎﻬﻨﯿ

ﺗﺮﻣ ـ ﮐﻪﺑﻂﺒ ـ ﺸﻧلﻮﺴﭙ ـ ﻞـﻣﺎﻌﺗﮏـﯾهﺪـﻨﻫدنﺎ

(interaction)

ﮓﻨﺗﺎﮕﻨﺗ

KfiB

ﻂﺒﺗﺮﻣیﺎﻬﻨﯿﺌﺗوﺮﭘزاﯽﮑﯾزاﺮﺘﺸﯿﺑﺎﯾﮏﯾﺎﺑ

ﺪﺷﺎﺑﯽﻣلﻮﺴﭙﮐﺪﯿﻟﻮﺗﺎﺑ .

References

1). Roberts IS. The biochemistry and genetics of capsular polysaccharide production in bacteria. Annu. Rev. Microbiol., 1996;50: 285-315.

2). Roberts IS. Bacterial polysaccharides in sickness and in health. Microbiol. 1995;141: 2023-2031.

3). Whitfield C, Roberts IS. Structure, assembly and regulation of expression of capsules in Escherichia coli. Mol. Microbiol., 1999;31:1307-1319.

4). Whitfield C. Biosynthesis and assembly of capsular polysaccharides in Escherichia coli. Annu. Rev. Biochem. 2006;75:39-68.

5). Griffiths G, Cook NJ, Gottfridson E, Lind T, Lidholt K, Roberts IS. Characterization of the glycosyltransferase enzyme from the Escherichia coli K5 capsule gene cluster and identification and characterization of the glucuronyl active site. J. Biol. Chem. 1998; 273:11752-11757.

6). Hodson N, Griffiths G, Cook N , Pourhoussein M, Gottfridson E, Lind T,.Lidholt K, Roberts IS. Identification that KfiA, a protein essential for the biosynthesis of the Escherichia coli K5 capsular polysaccharide, is an alpha -UDP-GlcNAc glycosyltransferase. The formation of a membrane-associated K5 biosynthetic complex requires KfiA, KfiB, and KfiC. J. Biol. Chem. 2000; 275:27311-27315 7). McNulty C, Thompson J, Barrett B, Lord L, Andersen C, Roberts IS. The cell surface expression of group 2 capsular polysaccharides in Escherichia coli: the role of KpsD, RhsA and a multi-protein complex at the pole of the cell. Mol. Microbiol. 2006; 59:907-922. 8). Chen M, Bridges A and Liu J. Determination of the substrate specificities of N-acetyl-d-glucosaminyltrans- ferase. Biochemistry 2006;10; 45(40):12358-65.