• No results found

Tổng Hợp Và Thử Tác Dụng Sinh Học Của Một Số Acid Hydroxamic Mang Khung 5-Aryl-1,3,4-Thiadiazol Hướng Ức Chế Histon Deacetylase

N/A
N/A
Protected

Academic year: 2021

Share "Tổng Hợp Và Thử Tác Dụng Sinh Học Của Một Số Acid Hydroxamic Mang Khung 5-Aryl-1,3,4-Thiadiazol Hướng Ức Chế Histon Deacetylase"

Copied!
100
0
0

Loading.... (view fulltext now)

Full text

(1)

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ

TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI

TRẦN THỊ BÍCH LAN

TỔNG HỢP VÀ THỬ TÁC DỤNG SINH HỌC CỦA

MỘT SỐ ACID HYDROXAMIC

MANG KHUNG 5-ARYL-1,3,4-THIADIAZOL HƢỚNG

ỨC CHẾ HISTON DEACETYLASE

LUẬN VĂN THẠC SĨ DƢỢC HỌC

(2)

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ

TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI

TRẦN THỊ BÍCH LAN

TỔNG HỢP VÀ THỬ TÁC DỤNG SINH HỌC CỦA MỘT

SỐ ACID HYDROXAMIC

MANG KHUNG 5-ARYL-1,3,4-THIADIAZOL HƢỚNG ỨC

CHẾ HISTON DEACETYLASE

LUẬN VĂN THẠC SĨ DƢỢC HỌC

CHUYÊN NGÀNH

CÔNG NGHỆ DƢỢC PHẨM VÀ BÀO CHẾ THUỐC

MÃ SỐ: 60720402

Ngƣời hƣớng dẫn khoa học:

TS. Đào Thị Kim Oanh

PGS.TS. Nguyễn Hải Nam

(3)

LỜI CẢM ƠN

Trong quá trình thực hiện luận văn, tôi đã nhận đƣợc sự hƣớng dẫn tận tình và nhiều giúp đỡ quý báu của các thày cô, đồng nghiệp, gia đình và bạn bè.

Từ tận đáy lòng mình, tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành và sự biết ơn sâu sắc tới TS. Đào Thị Kim Oanh và PGS.TS. Nguyễn Hải Nam, những ngƣời thày đã chỉ dẫn tôi tận tình và tạo mọi điều kiện tốt nhất cho tôi hoàn thành luận văn.

Tôi xin chân thành cảm ơn các anh chị em làm việc và thực hiện đề tài tại bộ môn Hóa dƣợc, đặc biệt các em Đỗ Thị Mai Dung và Lƣơng Xuân Huy, đã ủng hộ và giúp đỡ tôi rất nhiệt tình trong suốt quá trình nghiên cứu.

Tôi cũng nhận đƣợc sự phối hợp và giúp đỡ từ các cán bộ làm việc tại Khoa Hóa – trƣờng Đại học Khoa học tự nhiên – Đại học quốc gia Hà Nội, Viện Hóa học các hợp chất tự nhiên, Viện hóa học Việt Nam, Viện Khoa học và Công Nghệ Việt Nam, cùng toàn thể các thày cô trong các phòng, ban, thƣ viện. Tôi xin chân thành cảm ơn.

Cuối cùng, tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới gia đình và bè bạn – những ngƣời luôn sát cánh, động viên và khích lệ tôi trong cuộc sống và học tập.

Hà Nội, ngày 30 tháng 08 năm 2014 Học viên

(4)

MỤC LỤC

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT DANH MỤC CÁC BẢNG

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, SƠ ĐỒ

ĐẶT VẤN ĐỀ ... 1

Chƣơng 1. TỔNG QUAN ... 2

1.1. HISTON DEACETYLASE (HDAC) ... 2

1.1.1. Khái niệm, phân loại ... 2

1.1.2. Cấu trúc của HDAC ... 3

1.1.3. Mối liên quan giữa ung thƣ và sự bất thƣờng hoạt động của HDAC ... 3

1.2. CÁC CHẤT ỨC CHẾ HDAC ... 4

1.2.1. Phân loại các chất ức chế HDAC (HDIs) ... 4

1.2.2. Cơ chế tác dụng ... 6

1.2.3. Cấu trúc của các chất ức chế HDAC ... 6

1.3. TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU TRÊN THẾ GIỚI VỀ CÁC ACID HYDROXAMIC ỨC CHẾ HDAC ... 7

1.4. TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU Ở TRONG NƢỚC VỀ CÁC CHẤT ỨC CHẾ HDAC ... 15

Chƣơng 2. NGUYÊN VẬT LIỆU, TRANG THIẾT BỊ, NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ... 19

2.1. NGUYÊN VẬT LIỆU ... 19

2.1.2. Hóa chất chính ... 19

2.1.2. Các hóa chất và dung môi khác ... 19

2.2. THIẾT BỊ ... 19

2.3. NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ... 20

(5)

Chƣơng 3. THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ ... 26

3.1. NGHIÊN CỨU DOCKING ... 26

3.2. TỔNG HỢP HÓA HỌC ... 27 3.2.1. Tổng hợp chất N1-[5-(furan-2-yl)-1,3,4-thiadiazol-2-yl]-N8 -hydroxyoctandiamid (Va) ... 27 3.2.2. Tổng hợp chất N1-[5-(5-bromofuran-2-yl)-1,3,4-thiadiazol-2-yl]-N8 -hydroxyoctandiamid (Vb)... 31 3.2.3. Tổng hợp chất N1-hydroxy-N8 -[5-(5-methylfuran-2-yl)-1,3,4-thiadiazol-2-yl]octandiamid (Vc) ... 33 3.2.4.... Tổng hợp chất N1-hydroxy-N8 -[5-(thiophen-2-yl)-1,3,4-thiadiazol-2-yl]octandiamid (Vd) ... 34 3.2.5. Tổng hợp chất N1 -[5-(5-bromothiophen-2-yl)-1,3,4-thiadiazol-2-yl]-N8-hydroxyoctandiamid (Ve) ... 36 3.2.6. Tổng hợp chất N1-hydroxy-N8 -[5-(5-methylthiophen-2-yl)-1,3,4-thiadiazol-2-yl]octandiamid (Vf) ... 37 3.2.7. Tổng hợp chất N1-hydroxy-N8 -[5-(pyridin-2-yl)-1,3,4-thiadiazol-2-yl]octandiamid (Vg) ... 39 3.2.8. Tổng hợp chất N1-hydroxy-N8 -[5-(pyridin-3-yl)-1,3,4-thiadiazol-2-yl]octandiamid (Vh) ... 40 3.2.9. Tổng hợp chất N1-hydroxy-N8 -[5-(pyridin-4-yl)-1,3,4-thiadiazol-2-yl]octandiamid (Vi) ... 42

3.2. KIỂM TRA ĐỘ TINH KHIẾT ... 43

3.3. KHẲNG ĐỊNH CẤU TRÚC ... 44 3.3.1. Phổ hồng ngoại (IR) ... 44 3.3.2. Phổ khối lƣợng (MS) ... 46 3.3.3. Phổ cộng hƣởng từ hạt nhân (1 H-NMR, 13C-NMR) ... 46 3.5. HOẠT TÍNH SINH HỌC ... 50 3.5.1. Tác dụng ức chế HDAC ... 50

3.5.2. Hoạt tính kháng tế bào ung thƣ in vitro ... 51

(6)

4.1. TỔNG HỢP HÓA HỌC ... 52 4.2. KHẲNG ĐỊNH CẤU TRÚC ... 53 4.2.1. Phổ hồng ngoại (IR) ... 53 4.2.2. Phổ khối (MS) ... 54 4.2.3. Phổ cộng hƣởng từ hạt nhân (1H-NMR, 13C-NMR) ... 55 4.3. HOẠT TÍNH SINH HỌC ... 58 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ... 64 TÀI LIỆU THAM KHẢO

(7)

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT

AsPC-1: Tế bào ung thƣ tụy ngƣời

13

C - NMR: Phổ cộng hƣởng từ hạt nhân 13C

1H - NMR: Phổ cộng hƣởng từ hạt nhân 1H

dd: Dung dịch

HAT: histon acetyltranferase HDAC: Histon deacetylase H460: Tế bào ung thƣ phổi ngƣời

HDI, HDIs: Histon deacetylase Inhibitor(s) IR: Phổ hồng ngoại

MCF-7: Tế bào ung thƣ vú ngƣời MS: Phổ khối lƣợng

MTT: (3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromid) NCI-H460: Tế bào ung thƣ phổi ngƣời

NST: Nhiễm sắc thể

PC-3: Tế bào ung thƣ tiền liệt tuyến ngƣời Rt: khuấy đều

SAHA: Acid suberoylanilid SKLM: Sắc ký lớp mỏng

SW620: Tế bào ung thƣ đại tràng ngƣời TSA: Trichostatin A

(8)

DANH MỤC CÁC BẢNG

STT Tên bảng

1 Bảng 1.1: Các chất ức chế HDAC đang thử nghiệm trên lâm sàng

2 Bảng 1.2: Tác dụng kháng các tế bào ung thƣ in vitro của N25 (IC50±SD [µM])

3 Bảng 1.3: Hoạt tính ức chế HDAC các tuýp và tác dụng kháng tế bào ung thƣ in vitro của các dẫn chất amido-lactam ở vị trí 7 của khung SAHA

4 Bảng 1.4: Các acid hydroxamic mang khung 5-phenyl-1,3,4-thiadiazol-2-yl và độc tính trên một số dòng tế bào 5 Bảng 3.1: Kết quả docking của các chất Va-i với HDAC8 6 Bảng 3.2: Giá trị Rf và T0nc của các chất Va-i

7 Bảng 3.3: Số liệu phân tích phổ IR của Va-i

8 Bảng 3.4: Số liệu phân tích phổ khối lƣợng của các chất 9 Bảng 3.5: Số liệu phân tích phổ 1H-NMR

10 Bảng 3.6: Số liệu phân tích phổ 13C-NMR

11 Bảng 3.7: Tác dụng ức chế HDAC của các dẫn chất tổng hợp 12 Bảng 4.1: Kết quả thử hoạt tính kháng tế bào ung thƣ ngƣời

in vitro

13 Bảng 4.2: So sánh tác dụng kháng tế bào ung thƣ của Va-d, Vf-h với một số dẫn chất acid hydroxamic mang khung 5-phenyl-1,3,4-thiadiazol

(9)

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, SƠ ĐỒ

HÌNH VẼ

STT Tên hình

1 Hình 1.1: Vai trò sinh học của các HDAC trong sinh lý tế bào ung thƣ

2 Hình 1.2: Điều hòa sự phát triển và sống sót của tế bào bởi các chất ức chế HDAC

3 Hình 1.3: Công thức cổ điển của HDI

4 Hình 1.4: HDIs có cấu trúc acid hydroxamic

5 Hình 1.5: Các acid phenylthiazol hydroxamic tƣơng tự SAHA

6 Hình 1.6: Một số acid phenylthiazol hydroxamic 7 Hình 1.7: Các dẫn chất acid biphenyl-hydroxamic 8 Hình 1.8: Các acid isoxazol-hydroxamic

9 Hình 1.9: Các triazol-hydroxamic

10 Hình 1.10: Một số dẫn chất saccarin của acid hydroxamic mới 11 Hình 1.11: Công thức một số dẫn chất amido-lactam ở vị trí 7

của khung SAHA

12 Hình 1.12: Các acid hydroxamic mang khung benzothiazol, cầu nối 6 carbon

13 Hình 2.1: Các dẫn chất hydroxamic mang khung 5-aryl-1,3,4-thiadiazol dự kiến tổng hợp

14 Hình 3.1: Mô hình tƣơng tác của Va, Vg và SAHA với HDAC8

15 Hình 4.1: Phổ hồng ngoại của chất Vb 16 Hình 4.2: Phổ khối lƣợng của chất Vb

17 Hình 4.3: Phổ 1H-NMR dãn rộng của chất Vd 18 Hình 4.4: Phổ 13C-NMR của chất Vb

19 Hình 4.5: Kết quả phân tích Western blot của các chất Va-i SƠ ĐỒ

(10)

STT Tên sơ đồ

1 Sơ đồ 1.1: Tổng hợp các acid isoxazol-hydroxamic 2 Sơ đồ 1.2: Tổng hợp acid triazol-hydroxamic (4)

3 Sơ đồ 2.1: Tổng hợp các dẫn chất hydroxamic mang khung 5-aryl-1,3,4-thiadiazol 4 Sơ đồ 3.1: Quy trình tổng hợp chất Va 5 Sơ đồ 3.2: Tổng hợp chất IIa 6 Sơ đồ 3.3: Tổng hợp chất IIIa 7 Sơ đồ 3.4: Tổng hợp chất IVa 8 Sơ đồ 3.5: Tổng hợp chất Va 9 Sơ đồ 3.6: Quy trình tổng hợp chất Vb 10 Sơ đồ 3.7: Quy trình tổng hợp chất Vc 11 Sơ đồ 3.8: Quy trình tổng hợp chất Vd 12 Sơ đồ 3.9: Quy trình tổng hợp chất Ve 13 Sơ đồ 3.10: Quy trình tổng hợp chất Vf 14 Sơ đồ 3.11: Quy trình tổng hợp chất Vg 15 Sơ đồ 3.12: Quy trình tổng hợp chất Vh 16 Sơ đồ 3.13: Quy trình tổng hợp chất Vi 17 Sơ đồ 4.1: Cơ chế phản ứng đóng vòng tổng hợp 2-amino-5-aryl-1,3,4-thiadiazol

(11)

ĐẶT VẤN ĐỀ

Histon deacetylase (HDAC) là một nhóm enzym có ảnh hƣởng lên quá trình sao chép và biểu hiện gen. Các nghiên cứu cho thấy sự hoạt động bất thƣờng của HDAC là căn nguyên của nhiều bệnh ung thƣ [7,11,15,24]. Vì thế, việc tìm ra các thuốc có hoạt tính ức chế HDAC để điều trị ung thƣ đang là một hƣớng nghiên cứu đƣợc rất nhiều nhà khoa học quan tâm.

Một trong các nhóm chất ức chế HDAC đƣợc tập trung nghiên cứu hiện nay là các dẫn chất acid hydroxamic. Nhóm chất này có hoạt tính ức chế mạnh, cấu trúc đơn giản dễ tổng hợp, trong đó acid suberoylanilid hydroxamic (SAHA) là chất đầu tiên đã đƣợc FDA phê duyệt sử dụng trong điều trị u lympho da tế bào T [31]. Tiếp tục thành công này, nhiều nhóm nghiên cứu trên thế giới vẫn đang nỗ lực tìm kiếm các dẫn chất mới tối ƣu hơn dựa trên phiên mẫu của SAHA và các chất đã tìm đƣợc.

Tại Việt Nam, một số nghiên cứu thiết kế, tổng hợp các dẫn chất acid hydroxamic hƣớng ức chế HDAC đã và đang đƣợc thực hiện tại bộ môn Hóa Dƣợc – trƣờng Đại học Dƣợc Hà Nội. Các nghiên cứu này tập trung vào hai hƣớng: thay đổi cầu nối hoặc nhóm khóa hoạt động dựa trên khung của SAHA. Trong luận án tiến sĩ của tác giả Đào Thị Kim Oanh, dẫn chất mang khung benzothiazol với vai trò là nhóm khóa hoạt động thay cho nhân phenyl của SAHA và cầu nối 6 carbon cho hoạt tính rất đáng lƣu ý [3]. Ngoài ra, trong một công bố gần đây của tác giả Nguyễn Hải Nam và cộng sự, các dẫn chất acid hydroxamic mang khung 5-phenyl-1,3,4-thiadiazol-2-yl với cầu nối 6 carbon cũng cho hoạt tính rất tốt [21].

Vì vậy, tiếp tục hƣớng nghiên cứu này, chúng tôi tiến hành đề tài “Tổng hợp

và thử tác dụng sinh học của một số acid hydroxamic mang khung 5-aryl-1,3,4-thiadiazol hướng ức chế histon deacetylase” với hai mục tiêu:

- Tổng hợp đƣợc một số dẫn chất acid hydroxamic mang khung 5-aryl-1,3,4-thiadiazol.

- Thử tác dụng ức chế histon deacetylase và hoạt tính kháng một số dòng tế bào ung thƣ in vitro của các chất tổng hợp đƣợc.

(12)

-

Chƣơng 1. TỔNG QUAN

1.1. HISTON DEACETYLASE (HDAC) 1.1.1. Khái niệm, phân loại

Histon là các protein cơ bản cấu tạo nên nhiễm sắc thể, trong đó bốn cặp histon (H2A, H2B, H3 và H4) tạo nên lõi protein của nucleosom. Các cặp histon lõi có 2 phần quan trọng: đuôi C nằm bên trong lõi và đầu N nằm bên ngoài nucleosom. Đầu amin này mang nhiều điện tích dƣơng nên tƣơng tác mạnh với phần phosphat mang điện âm trên phân tử ADN tạo nên cấu trúc nucleosom và các cấu trúc bậc cao hơn của nhiễm sắc thể.

Việc tích điện dƣơng của histon mạnh hay yếu thông qua quá trình acetyl hóa đầu amin ở phần đuôi của histon. Ở dạng deacetyl hóa, histon tích điện dƣơng lớn, tƣơng tác điện tích với ADN mạnh làm đóng xoắn nhiễm sắc thể gây ức chế quá trình dịch mã và tổng hợp protein, ức chế sự biểu hiện gen. Ngƣợc lại, khi bị acetyl hóa, điện tích dƣơng bị trung hòa, nhiễm sắc thể đƣợc tháo xoắn, quá trình tổng hợp protein diễn ra và đặc tính của gen đƣợc biểu hiện. Trong tế bào, quá trình acetyl hóa này đƣợc điều hòa bởi 2 enzym: histon acetyltranferase (HAT) và histon deacetylase (HDAC) [1, 13, 27, 29].

Histon deacetylase (HDAC) là nhóm gồm 18 enzym xúc tác cho sự di chuyển làm giảm bớt nhóm acetyl trên phần đuôi lysin của các protein histon H2A, H2B, H3 và H4 trong lõi nucleosom. Hiện nay, 18 HDAC khác nhau ở ngƣời đã đƣợc xác định, chia làm 4 nhóm [1, 5, 6, 27, 29].

- Nhóm I: HDAC 1, HDAC 2, HDAC 3, HDAC 8 : Nằm ở nhân tế bào, có protein đích là các histon.

- Nhóm IIa: HDAC 4, HDAC 5, HDAC 7, HDAC 9: Nằm ở nhân hoặc tế bào chất, có protein đích là các protein histon và không phải histon.

- Nhóm IIb: HDAC 6, HDAC 10 : Nằm ở tế bào chất, có đích là các protein không phải histon.

(13)

- Nhóm III: Các protein điều hoà chuỗi thông tin 2 (SIRT): SIRT 1 – 7, chúng có ở bào tƣơng, ty thể và nhân.

- Nhóm IV: HDAC 11 : Nằm ở nhân tế bào, có đích là các histon.

Các HDAC nhóm I, II, IV đƣợc gọi là các HDAC “kinh điển” phụ thuộc vào Zn2+ và bị ức chế bởi các chất tạo phức chelat với Zn2+ nhƣ các acid hydroxamic, thiol... Trong khi đó các HDAC nhóm III lại phụ thuộc vào NAD+ [6]. Thuật ngữ

các chất ức chế HDAC thƣờng đƣợc dùng cho những chất có mục tiêu phân tử là các HDAC kinh điển và hiện đang đƣợc nghiên cứu trên lâm sàng [1, 6].

1.1.2. Cấu trúc của HDAC

Bằng phƣơng pháp kết tinh tạo tinh thể và chụp tia X ngƣời ta đã xác định đƣợc cấu trúc 3D của một số HDAC và các trung tâm xúc tác phản ứng deacetyl của chúng. Về cơ bản các HDAC có cấu trúc trung tâm hoạt động khá giống nhau, chúng đều gồm các phần cơ bản sau:

+ Ion Zn2+ là coenzym của HDAC nằm ở trung tâm xúc tác của chúng. Đây là thành phần tham gia liên kết mạnh nhất với phần đuôi histon bằng liên kết phối trí. Thông thƣờng các chất ức chế HDAC liên kết càng mạnh với Zn2+

thì tác dụng ức chế HDAC và độc tính tế bào càng mạnh [12, 19, 28].

+ Kênh enzym là nơi chứa đựng cơ chất và tham gia liên kết Van der Walls với cơ chất. Kênh này có cấu trúc dạng túi hình ống hẹp, đƣợc cấu tạo bởi các acid amin thân dầu đặc biệt là các acid amin có nhân thơm nhƣ: Phe, Tyr, Pro, His. Nó có cấu trúc khá linh động có thể thay đổi kích thƣớc để phù hợp với cơ chất và tham gia phản ứng deacetyl. Trên miệng túi có một vành nhỏ đƣợc tạo nên từ 1 vài vòng xoắn protein (phần vành sẽ tƣơng tác với nhóm nhận diện bề mặt của HDAC). Đối với các hợp chất acid hydroxamic chiều dài của kênh này là tối ƣu với khoảng 5-6 liên kết carbon [12, 28, 29].

1.1.3. Mối liên quan giữa ung thƣ và sự bất thƣờng hoạt động của HDAC Nhƣ đã trình bày trong phần khái niệm, hoạt động của HDAC ảnh hƣởng tới sự tích điện trên phần đầu amin của histon, từ đó gây tác động lên quá trình phiên mã. Các sai lệch của quá trình phiên mã là một trong những nguyên nhân dẫn tới sự hình thành khối u [1]. Chẳng hạn, mối tƣơng quan giữa hoạt động của HDAC và sự

(14)

tạo thành khối u đƣợc thể hiện rõ nhất trong bệnh ung thƣ bạch cầu tiền tủy bào cấp tính (APL). Những nghiên cứu trên phạm vi rộng đã chỉ ra rằng sự ức chế phiên mã không thích hợp của HDAC là cơ chế phổ biến tạo ra các protein gây ung thƣ (oncoprotein). Ngoài ra trong các tế bào ung thƣ ngƣời ta còn thấy sự hoạt động quá mức của HDAC nhƣ ung thƣ buồng trứng (HDAC1-3), ung thƣ dạ dày (HDAC2); ung thƣ phổi (HDAC1, 3) [11, 24].

Các nghiên cứu có ý nghĩa thống kê đã chỉ ra rằng các HDAC liên quan đến nhiều giai đoạn điều hòa cơ bản của quá trình sinh học trong tế bào ung thƣ nhƣ chu trình tế bào, sự biệt hóa, sự chết tế bào theo chƣơng trình, kể cả sự di chuyển, sự xâm lấn và sự tạo mạch. Vai trò chức năng của các HDAC trong quá trình sinh học của tế bào ung thƣ đƣợc tóm tắt ở hình 1.1 [7, 11, 15, 24].

Hình 1.1: Vai trò sinh học của các HDAC trong sinh lý tế bào ung thư

1.2. CÁC CHẤT ỨC CHẾ HDAC

1.2.1. Phân loại các chất ức chế HDAC (HDIs)

HDIs đƣợc chia thành 5 nhóm chính dựa trên cấu trúc hóa học: các acid hydroxamic, các peptid vòng, các acid béo, benzamid và các dẫn chất ceton. [9]

(15)

Bảng 1.1: Các chất ức chế HDAC đang thử nghiệm trên lâm sàng Chất Cấu trúc Chất Cấu trúc Các acid hydroxamic TSA (Trichostatin A) NHOH O N O Oxamflatin O NHOH H N S O O Acid suberoylanilid hydroxamic (SAHA) H N NHOH O O NVP-LAQ-824 CBHA (Acid m-carboxycinnamic bishydroxamid) Acid sulfonamid hydroxamic Scriptaid Peptid vòng Depsipeptid (FK-228) H N O CH3 HN O H3C CH3 O NH O CH3 CH3 O HN O S S Acipidin CHAP Benzamid MS-275 N O O N H H N O NH2 CI-994 Các acid béo Acid valproic O OH Phenyl butyrat O ONa

(16)

Các dẫn chất ceton

Trifluoromethyl ceton

Alpha-cetoamid

Mỗi nhóm có những hạn chế riêng: các acid hydroxamic là những chất bị chuyển hóa nhanh và ức chế không chọn lọc các HDAC; các benzamid và các acid béo có hiệu lực hạn chế, trong khi các peptid vòng có cấu trúc quá phức tạp và gây ra sự chảy máu khó chữa và FK-228 trong cấu trúc có một phần liên kết với kim loại có chứa lƣu huỳnh không mong muốn [4, 14].

1.2.2. Cơ chế tác dụng

Các chất ức chế HDAC có tác dụng chống ung thƣ do tác động lên nhiều giai đoạn quan trọng của chu trình tế bào làm mất sự điều hòa trong tế bào ác tính. Trong đó, yếu tố then chốt quyết định hoạt tính chống ung thƣ của HDIs là thúc đẩy sự biệt hóa, ức chế chu trình tế bào và thúc đẩy sự chết tế bào.

Ngoài ra, hoạt hóa đáp ứng miễn dịch và ức chế tạo mạch cũng là vai trò rất quan trọng của HDIs, gián tiếp ức chế sự phát triển in vivo của khối u (hình 1.2) [2, 13].

Hình 1.2: Điều hòa sự phát triển và sống sót của tế bào bởi các chất ức chế HDAC

(17)

- Nhóm gắn với ion Zn2+ (Zinc binding group - ZBG) (A): tƣơng tác với ion Zn2+ tại trung tâm hoạt động của các HDAC nhƣ acid hydroxamic, các thiol, nhóm o-aminoanilin của benzamid, mercaptoceton..., quyết định tính đặc hiệu và hiệu lực của HDIs.

- Vùng cầu nối sơ nƣớc (B): thƣờng là những hydrocacbon thân dầu có thể tạo các liên kết Van der Waals với kênh enzym.

- Nhóm khóa hoạt động (capping group) hay vùng nhận diện bề mặt (surface recognition group) (C): là các vòng thơm hoặc peptid vòng, thƣờng nằm trên bề mặt enzym.

Hình 1.3: Công thức cổ điển của HDI

Cấu trúc tinh thể kết tinh của các HDAC liên kết với một số chất ức chế HDAC cho thấy phần A, B và một phần của C nằm trong túi enzym, làm lấp đầy khoảng trống trong lòng kênh enzym. Phần còn lại của nhóm khóa hoạt động C tƣơng tác với phần vành trên bề mặt miệng túi enzym. Nhóm nhận diện bề mặt C có thể liên kết với phần cầu nối thông qua một số liên kết peptid làm tăng khả năng phân cực và góp phần cải thiện dƣợc động học cho các chất ức chế HDAC. Việc nghiên cứu thiết kế cấu trúc các chất mới đều dựa trên cấu trúc cổ điển này.

1.3. TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU TRÊN THẾ GIỚI VỀ CÁC ACID HYDROXAMIC ỨC CHẾ HDAC

Acid hydroxamic là nhóm chất ức chế HDAC đƣợc nghiên cứu rộng rãi nhất, với nồng độ ức chế nằm trong khoảng micromol đến nanomol.

Trichostatin A ( (R)-TSA) là chất đầu tiên đƣợc phân lập từ Streptomyces

hygroscopicus đã đƣợc chứng minh có tác dụng ức chế mạnh, đặc hiệu với HDAC

(Ki=3,4nM), có tác dụng rất tốt trong việc làm giảm sự biệt hóa tế bào trong bệnh

bạch cầu Friend, và đóng vai trò nhƣ chất ngăn cản sự di căn trong ung thƣ đại tràng. Tuy nhiên việc sản xuất ra TSA rất tốn kém với hiệu suất thấp (trải qua 20

(18)

bƣớc với hiệu suất 2%) nên việc nghiên cứu ra các chất ức chế HDAC thay thế TSA đang đƣợc nhiều nhà nghiên cứu quan tâm. Hiện nay, TSA chủ yếu đƣợc dùng làm chất đối chiếu trong nghiên cứu tìm ra HDIs mới [23].

Một chất ức chế HDAC đã đƣợc nghiên cứu tổng hợp thành công là acid suberoylanilid hydroxamic (SAHA). Chất này đã đƣợc FDA phê duyệt sử dụng trong điều trị u lympho da tế bào T. SAHA làm tăng sự acetyl hóa của các histon H2B, H3 và H4, đồng thời thay đổi sự biểu hiện của một số gen dẫn đến sự chết tế bào theo chƣơng trình [31].

Bên cạnh đó, nhiều dẫn chất acid hydroxamic ức chế HDAC đang đƣợc nghiên cứu rộng rãi và đƣợc chia thành nhiều phân nhóm nhỏ (hình 1.4).

Hình 1.4: HDIs có cấu trúc acid hydroxamic

Đặc điểm chung của các chất này là nhóm hydroxamic dễ tạo phức với Zn2+

của HDAC nên ức chế không chọn lọc cả HDAC nhóm I, II và bị chuyển hóa nhanh [20, 30].

Chính vì vậy các nhà khoa học trên thế giới vẫn đang nỗ lực tìm kiếm các dẫn chất mới dựa trên phiên mẫu TSA, SAHA và các chất đã tìm đƣợc. Dựa trên

(19)

nghiên cứu có thể tiến hành thay đổi một trong 2 phần cấu trúc: nhóm khóa hoạt động (C), cầu nối (B).

Sau đây là tổng kết một số nghiên cứu trên thế giới về thay đổi nhóm khóa hoạt động của các acid hydroxamic.

Các nhà khoa học thuộc Viện nghiên cứu quân đội Walter Reed (Mỹ) đã thiết kế và tổng hợp hàng trăm dẫn chất acid hydroxamic mang hợp phần phenylthiazol thay thế vào vị trí của phenyl trong SAHA (1, hình 1.5) [10]. Một dẫn chất oxazol là WR301849 cũng đƣợc tổng hợp [17].

Hình 1.5: Các acid phenylthiazol hydroxamic tương tự SAHA

Kết quả đánh giá tác dụng trên HDAC cho thấy dẫn chất WR301801 (1a) với nhóm khóa hoạt động là 3-aminophenyl-5-thiazolyl có tác dụng ức chế mạnh nhất với IC50 = 10,4 nM, mạnh hơn cả SAHA trên cùng thử nghiệm. Đồng phân vị

trí của WR301801 là WR301826 (1b) (nhóm thế amino ở vị trí ortho) cũng có tác dụng mạnh tƣơng đƣơng SAHA [30].

Sử dụng hai chất WR301801 và WR301826 làm những chất dẫn đƣờng mới, nhóm nghiên cứu của Alan P. Kozikowski thuộc Đại học Illinois (Chicago, Mỹ) tiếp tục thiết kế dãy acid phenylthiazol-hydroxamic dẫn chất hóa dựa trên nhóm amino của vòng phenyl (hình 1.6) [16]. Kết quả cho thấy, khi nhóm amin thế trên vòng phenyl đƣợc acyl hóa bằng những nhóm cồng kềnh, tác dụng ức chế nhiều týp HDAC tăng. Tác dụng mạnh nhất thu đƣợc với dẫn chất 1a-5 (hình 10). IC50 của

dẫn chất này với HDAC2, HDAC3 thấp dƣới mức 0,2 nM. Kết quả thử độc tính trên 5 dòng tế bào ung thƣ tụy công bố với 1a, 1b, 1a-2 cho thấy các dẫn chất này đều có IC50 nhỏ hơn 3 M [16].

(20)

Hình 1.6: Một số acid phenylthiazol hydroxamic

Trong quá trình nghiên cứu các dẫn chất acid phenylthiazol-hydroxamic, nhóm nghiên cứu của Alan P. Kozikowski cũng đồng thời tiến hành thiết kế và tổng hợp một dãy các dẫn chất acid biphenyl-hydroxamic tƣơng tự SAHA (hình 1.7) [16]. Kết quả các dẫn chất biphenyl ức chế HDAC mạnh hơn SAHA trên 6 loại HDAC (HDAC1, 2, 3, 8, 10, 6). Khi gắn thêm nhóm -NH2 vào vị trí ortho trên vòng phenyl thứ 2 hoạt tính giảm song khi nhóm -NH2 này đƣợc acyl hóa bằng

những nhóm aminoacyl cồng kềnh, tác dụng ức chế HDAC lại đƣợc tăng cƣờng. Điều này chứng tỏ phần nhận diện bề mặt của trung tâm hoạt động của HDAC có thể chấp nhận nhiều nhóm có kích thƣớc lớn. Kết quả này cũng gợi ý các tƣơng tác đƣợc tạo lập thêm từ những nhóm aminoacyl này với các acid amin tại vành của túi hoạt động đã làm tăng ái lực đối với HDAC của các dẫn chất. Một số acid biphenyl-hydroxamic cũng cho độc tính trên 5 dòng tế bào ung thƣ tụy thử nghiệm nhƣng tác dụng không tốt bằng các acid phenylthiazol hydroxamic.

Hình 1.7: Các dẫn chất acid biphenyl-hydroxamic

Trong quá trình nghiên cứu các dẫn chất acid phenylthiazol-hydroxamic, nhóm nghiên cứu của Alan P. Kozikowski thuộc Đại học Illinois (Chicago, Mỹ) đã tổng hợp dẫn chất acid phenylisoxazol-hydroxamic WR301849 (hình 1.8) [17]. Dẫn chất isoxazol này có tác dụng ức chế các HDAC1, 3 và 6 rất mạnh với IC50

thấp đến 0,002 nM. Tiếp tục mạch nghiên cứu này, một số dẫn chất trong đó vòng isoxazol đƣợc đƣa vào vị trí ngay sát cạnh nhóm acid hydroxamic đã đƣợc thiết kế

(21)

Sơ đồ 1.1: Tổng hợp các acid isoxazol-hydroxamic

* Tác nhân và điều kiện: (a) acid 7-heptynoic, POCl3, pyridin, -13 o

Crt, 30 phút; (b) ethyl clorooxamidoacetat, triethylamin, THF, rt, 16 h; (c) NH2OH.HCl, KOH, MeOH, rt, 15 phút.

Kết quả thử hoạt tính ức chế HDAC cho thấy một số dẫn chất trong các acid isoxazol-hydroxamic tổng hợp ức chế cả 5 tuýp HDAC1, 2, 3, 6 và 10 với IC50

trung bình khoảng 150 nM [25]. Tác dụng này kém hơn nhiều so với các acid phenylthiazol-hydroxamic (1) và acid biphenyl-hydroxamic (2). Có thể nhận xét, khi có mặt vòng isoxazol cạnh nhóm hydroxamic, nhóm khóa hoạt động là quinolin hoặc biphenyl không tối ƣu cho hoạt tính, trong khi hai dẫn chất với vòng 5-phenylthiazol (3a, 3b) có tác dụng ức chế HDAC khá mạnh, gần tƣơng đƣơng SAHA (hình 1.8). Đây cũng là hai dẫn chất thể hiện độc tính tế bào mạnh nhất với IC50 thấp đến 1 µM. Điều ngạc nhiên là mặc dù 3b ức chế HDAC mạnh hơn 3a song 3a lại có độc tính tế bào mạnh hơn 3b [25]. Có thể sự có mặt của nhóm 3-amino ở 3b đã làm giảm tính thấm qua màng tế bào của chất này, dẫn đến độc tính tế bào thấp hơn so với 3a. Có thể các dẫn chất acyl hóa của 3b sẽ cải thiện cả tác dụng trên HDAC và tế bào, tƣơng tự nhƣ với các dẫn chất acid phenylthiazol-hydroxamic (1).

Hình 1.8: Các acid isoxazol-hydroxamic

Cũng nhằm mục tiêu tìm ra cầu nối và nhóm khóa hoạt động thích hợp, các nhà khoa học tại Viện Parker H. Petit thuộc Viện Công nghệ Georgia đã thiết kế và tổng hợp dãy các dẫn chất hydroxamic chứa vòng triazol (4, sơ đồ 1.2) [17].

(22)

Sơ đồ 1.2: Tổng hợp acid triazol-hydroxamic (4). Tác nhân và điều kiện: (a) CuI, Hunig base, THF, rt; (b) dd NH2OH, KCN, THF/MeOH (1/1), rt.

Kết quả sàng lọc hoạt tính ức chế HDAC cho thấy cầu nối giữa phần hydroxamic và triazol 5, 6C là tối ƣu. Tuy nhiên, không thấy có quy luật rõ ràng khi so sánh hai dẫn chất có cùng nhóm khóa hoạt động Ar và khác nhau về độ dài cầu nối. Với nhóm Ar cồng kềnh, dẫn chất 5C thƣờng có tác dụng ức chế HDAC mạnh hơn trong khi những chất có Ar nhỏ, dẫn chất 6C thƣờng biểu thị hoạt tính trên HDAC mạnh hơn. Khi so sánh với SAHA, rất nhiều dẫn chất triazol chứng tỏ có ái lực mạnh hơn với HDAC. In vitro, 4 dẫn chất 4t, 4v, 4y, 4w gây độc đối với dòng tế bào ung thƣ tiền liệt tuyến của ngƣời DU145 với IC50 thấp nhất đến 2,25 µM, tƣơng đƣơng với SAHA (hình 1.9) [8].

Hình 1.9: Các triazol-hydroxamic

Đã có nhiều nghiên cứu về các dẫn chất acid hydroxamic ức chế HDAC (các dẫn chất N-hydroxybenzamid, 1,3,4-thiadiazol và tetrahydroisoquinolin), gần đây, nhóm các nhà khoa học của Trung Quốc và Mỹ tiếp tục công bố kết quả tổng hợp và thử tác dụng sinh học của một dãy các dẫn chất saccarin (1,2-dihydrobenzo[d]isothiazol-3-1-1,1-dioxid) của acid hydroxamic mới (hình 1.10) [18].

(23)

Hình 1.10: Một số dẫn chất saccarin của acid hydroxamic mới

Việc khảo sát độ dài cầu nối n=1-5 cũng cho thấy các dẫn chất có cầu nối 5C cho hoạt tính ức chế HDAC mạnh nhất. Đặc biệt các chất 5e, 5m, 5p ức chế HDAC tƣơng tự hoặc tốt hơn SAHA (với IC50 lần lƣợt là 0,152; 0,113; 0,096µM so với

SAHA là 0,135µM). Các đánh giá sinh học sâu hơn cho thấy 5m có hoạt tính kháng các tế bào ung thƣ MDA-MB-231 (tế bào ung thƣ vú); PC-3 (tế bào ung thƣ tiền liệt tuyến) và KG1 (tế bào ung thƣ bạch cầu nguyên bào tủy) mạnh nhất với IC50 =

4,34; 9,28 và 1,66 µM, tƣơng đƣơng SAHA [18]. Kết quả này gợi ý rằng các dẫn chất hydroxamat mang khung saccarin có thể là các chất dẫn đƣờng để phát triển các hoạt chất kháng ung thƣ mới.

Một nhóm các nhà khoa học Trung Quốc khác cũng vừa đăng ký bằng sáng chế (số CN 103159646) cho một dẫn chất mới của SAHA là N1-(2,5-dimethoxyphenyl)-N(8)-hydroxyoctandiamid (N25) [32]. Hoạt tính kháng ung thƣ của N25 mạnh hơn SAHA trên các dòng tế bào ung thƣ phổi H460, A549, H1299 và ung thƣ thần kinh đệm U251 (bảng 1.2).

(24)

Bảng 1.2: Tác dụng kháng các tế bào ung thư in vitro của N25 (IC50±SD [µM])

Một hƣớng thay đổi nhóm khóa hoạt động của SAHA đƣợc thực hiện bởi các nhà khoa học Italia (Maurizio Taddei và cộng sự, cuối năm 2013) bằng cách gắn các lactam-carboxyamid vào vị trí số 7 của khungsuberoylanilid đã thu đƣợc kết quả rất đáng lƣu ý. Việc gắn lactam vào nhóm khóa hoạt động này đã tăng cƣờng đáng kể tác dụng in vitro. Nhiều dẫn chất đƣợc tạo ra có khả năng ức chế HDAC các tuýp với IC50 ở mức nanomol, thấp hơn SAHA hàng trăm lần, điển hình là 3 chất 6, 7, 8 (hình 1.11, bảng 1.3) [26].

Hình 1.11: Công thức một số dẫn chất amido-lactam ở vị trí 7 của khung SAHA

Nghiên cứu tác dụng kháng tế bào ung thƣ (H460) cũng cho thấy các dẫn chất amido-lactam ở vị trí 7 của khung SAHA cho hoạt tính rất mạnh. Các dẫn chất

(25)

dƣới micromol, đặc biệt các chất 6, 7 và 8 có IC50 = 0.5 µM, thấp hơn SAHA hơn

60 lần (bảng 1.3) [26].

Bảng 1.3: Hoạt tính ức chế HDAC các tuýp và tác dụng kháng tế bào ung thư in vitro của các dẫn chất amido-lactam ở vị trí 7 của khung SAHA.

Nhìn chung, các dẫn chất SAHA chứa (S)-7-amino carboxylactam ức chế các tuýp HDAC với giá trị IC50 ở mức nano, cho thấy sự có mặt của vòng amid trên

vùng khóa hoạt động có ảnh hƣởng đặc biệt lên ái lực với enzym. Sự biến đổi trên nhóm khóa hoạt động của SAHA này đã mang lại các chất có hoạt tính cực mạnh trên các HDAC nhóm I và II, đƣợc chứng thực thêm bằng khả năng kháng ung thƣ đầy hứa hẹn trên dòng tế bào thử nghiệm. Chất 6 có thể coi là một chất dẫn đƣờng hấp dẫn, với các biến đổi đơn giản nhƣng tạo đƣợc đƣợc một chất kháng ung thƣ mới hƣớng ức chế HDAC đầy triển vọng [26].

1.4. TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU Ở TRONG NƢỚC VỀ CÁC CHẤT ỨC CHẾ HDAC

Tại Việt Nam, lần đầu tiên các nghiên cứu thiết kế, tổng hợp các chất ức chế HDAC và thử hoạt tính để sàng lọc tìm ra chất có hƣớng tác dụng kháng tế bào ung thƣ đã và đang đƣợc nhóm nghiên cứu tại bộ môn Hóa Dƣợc, trƣờng Đại học Dƣợc Hà Nội thực hiện.

Luận án tiến sĩ của tác giả Đào Thị Kim Oanh đã tiến hành thay thế nhân phenyl của SAHA bằng khung benzothiazol với vai trò là nhóm khóa hoạt động (hình 1.12). Kết quả khảo sát độ dài cầu nối từ 2 – 6 carbon cho thấy với cầu nối 6C cho hoạt tính tối ƣu [3].

(26)

Hình 1.12: Các acid hydroxamic mang khung benzothiazol, cầu nối 6 carbon

Kết quả thử độc tính tế bào in vitro cho thấy chất 9b, 9g có hoạt tính mạnh tƣơng đƣơng SAHA. Thậm chí trên 3 dòng tế bào SW620, AsPC-1 và NCI-H460, chất 9g có tác dụng mạnh gần gấp đôi so với SAHA, thể hiện ở giá trị IC50 = 0,32;

0,34; 0,39 µg/ml (tƣơng ứng với từng dòng tế bào) so với của SAHA là IC50 = 0,50;

0,69; 0,68 µg/ml. Thử nghiệm hoạt tính kháng tế bào ung thƣ tiền liệt tuyến PC-3

in vivo với mô hình ghép dị chủng ở chuột trụi lông cho thấy chất 9g ức chế

49,00% sự phát triển của khối u tƣơng đƣơng SAHA (48,30%) (liều 30 mg/kg). Giữ nguyên cầu nối 6 carbon đã đƣợc khảo sát trong luận án trên, nhóm nghiên cứu tại bộ môn Hóa Dƣợc trƣờng Đại học Dƣợc Hà Nội tiếp tục hƣớng nghiên cứu thay đổi nhóm khóa hoạt động. Dãy dẫn chất acid hydroxamic mang khung 5-phenyl-1,3,4-thiadiazol-2-yl đã đƣợc thiết kế, tổng hợp và kết quả cũng cho hoạt tính rất đáng chú ý (bảng 1.4) [21].

(27)

Bảng 1.4: Các acid hydroxamic mang khung5-phenyl-1,3,4-thiadiazol-2-yl và độc tính trên một số dòng tế bào Chất R Độc tính trên các dòng tế bào (IC50, * µM) SW620 MCF-7 PC3 AsPC-1 NCI-H460 10a H 0,70 1,80 0,88 2,71 1,07 10b 2-Cl 0,34 1,23 1,42 0,63 0,11 10c 3-Cl 0,45 1,23 1,76 1,10 1,94 10d 4-Cl 1,62 0,73 0,84 1,34 1,50 10e 4-F 3,58 8,05 2,92 1,88 4,79 10f 4-Br 0,72 1,27 0,83 0,08 1,42 10g 4-CH3 11,52 20,78 14,90 6,38 13,16 10h 4-OCH3 1,46 2,46 1,63 0,80 1,97 10i 4-N(CH3)2 6,61 6,67 7,35 7,16 8,18 10j 2-NO2 19,23 31,18 14,69 33,47 16,69 10k 4-NO2 26,71 76,25 25,57 76,25 76,25 10l 2,6-Cl2 16,21 16,29 15,18 14,95 14,38 10m 3,4-CH2OCH2- 1,89 2,15 2,54 3,04 3,34 10n 2,3,4-(OCH3)3 2,29 4,15 1,77 2,11 3,21 10o 3,4,5-(OCH3)3 4,31 3,50 1,89 6,02 10,20 SAHA 3,70 6,82 4,31 3,66 2,77

*Nồng độ của chất gây ra sự giảm 50% số lượng tế bào, số liệu được lấy trung bình ba kết quả với độ lệch dưới 10%.

SAHA: acid suberoylanilid hydroxamic.

Nghiên cứu này đã tổng hợp đƣợc nhiều dẫn chất chất mang khung 5-phenyl-1,3,4 thiadiazol có hoạt tính kháng tế bào ung thƣ mạnh. Các chất 10a-c có IC50

thấp hơn SAHA 3-20 lần trên các dòng tế bào thử nghiệm, còn 10d-f, 10m-o cũng cho hoạt tính thấp hơn hoặc tƣơng đƣơng SAHA.

Các nghiên cứu trên cho thấy, việc giữ cầu nối 6C và thay nhân phenyl của SAHA bằng các dẫn chất vòng benzothiazol, 5-phenyl-1,3,4-thiadiazol đều tạo ra đƣợc các chất có tác dụng kháng ung thƣ hiệu quả với hoạt lực mạnh hơn. Vì vậy,

(28)

đề tài này sẽ tiếp tục hƣớng nghiên cứu trên, thay khung 5-phenyl-1,3,4-thiadiazol bằng khung 5-aryl-1,3,4-thidiazol và vẫn giữ nguyên cầu nối 6 carbon.

(29)

Chƣơng 2. NGUYÊN VẬT LIỆU, TRANG THIẾT BỊ,

NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1. NGUYÊN VẬT LIỆU

Các hóa chất, dung môi sử dụng trong quá trình thực nghiệm là loại dành cho tổng hợp đƣợc nhập từ công ty Merck hoặc Sigma-Aldrich. Các hóa chất này đƣợc sử dụng trực tiếp không qua tinh chế thêm. Bao gồm:

2.1.2. Hóa chất chính Các aldehyd: Furan-2-carbaldehyd Pyridin-2-carbaldehyd Pyridin-3-carbaldehyd Pyridin-4-carbaldehyd Thiophen-2-carbaldehyd 5-Bromothiophen-2-carbaldehyd 5-Bromofuran-2-carbaldehyd

FeCl

3

.12H

2

O

Acid suberic monomethyl ester Carbonyldiimidazol (CDI) Hydroxylamin hydroclorid Thiosemicarbazid

2.1.2. Các hóa chất và dung môi khác

DMF Aceton MeOH Acid acetic băng n-Hexan

HCl EtOH NaOH Dicloromethan Nƣớc cất

2.2. THIẾT BỊ

- Bình cầu đáy tròn dung tích 50 ml có nút mài, máy khuấy từ gia nhiệt, sinh hàn hồi lƣu, máy cất quay chân không, tủ lạnh, tủ sấy, pipet, phễu thủy tinh, giấy

(30)

lọc, cân phân tích, cân kỹ thuật, bình chạy sắc ký lớp mỏng (SKLM), chị thị màu vạn năng.

- SKLM tiến hành trên bản mỏng silicagel 60 F254 tráng sẵn.

- Nhiệt độ nóng chảy (tonc) đƣợc xác định bằng máy đo nhiệt độ nóng chảy nhiệt

điện (Electrothermal digital).

- Phổ hồng ngoại (IR) đƣợc ghi trên máy Perkin Elmer – USA tại bộ môn Hóa vật liệu – Khoa hóa – Trƣờng Đại học Khoa học tự nhiên – Đại học quốc gia Hà Nội.

- Phổ khối lƣợng (MS) đƣợc ghi bằng máy khối phổ LC-MSD-Trap-SL (của Viện hóa học Việt Nam) và Agilent 6310 Ion Trap (của Viện hóa học các hợp chất thiên nhiên).

- Phổ cộng hƣởng từ hạt nhân (1H - NMR) và carbon (13C - NMR) đƣợc ghi bằng máy Bruker AV-500 tại Trung tâm khoa học và công nghệ Việt Nam.

2.3. NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.3.1. Nội dung nghiên cứu

- Khảo sát và tổng hợp 9 chất với công thức nhƣ sau:

Hình 2.1: Các dẫn chất hydroxamic mang khung 5-aryl-1,3,4-thiadiazol dự kiến tổng hợp

STT Chất R Tên 1 Va N 1 -[5-(furan-2-yl)-1,3,4-thiadiazol-2-yl]-N8 -hydroxyoctandiamid. 2 Vb N 1 -[5-(5-bromofuran-2-yl)-1,3,4-thiadiazol-2-yl]-N8-hydroxyoctandiamid.

(31)

3 Vc N 1 -hydroxy-N8 -[5-(5-methylfuran-2-yl)-1,3,4-thiadiazol-2-yl]octandiamid. 4 Vd N 1 -hydroxy-N8 -[5-(thiophen-2-yl)-1,3,4-thiadiazol-2-yl]octandiamid. 5 Ve N 1 -[5-(5-bromothiophen-2-yl)-1,3,4-thiadiazol-2-yl]-N8-hydroxyoctandiamid. 6 Vf N 1 -hydroxy-N8 -[5-(5-methylthiophen-2-yl)-1,3,4-thiadiazol-2-yl]octandiamid. 7 Vg N 1 -hydroxy-N8 -[5-(pyridin-2-yl)-1,3,4-thiadiazol-2-yl]octandiamid. 8 Vh N 1 -hydroxy-N8 -[5-(pyridin-3-yl)-1,3,4-thiadiazol-2-yl]octandiamid. 9 Vi N 1 -hydroxy-N8 -[5-(pyridin-4-yl)-1,3,4-thiadiazol-2-yl]octandiamid. - Khẳng định cấu trúc của các chất tổng hợp đƣợc

- Thử tác dụng ức chế HDAC và hoạt tính kháng một số dòng tế bào ung thƣ (in vitro) của các chất tổng hợp đƣợc

2.3.2. Phƣơng pháp nghiên cứu

2.3.2.1. Nghiên cứu Docking

Sau khi thiết kế dãy dẫn chất, để nghiên cứu sơ bộ tƣơng tác của các chất với HDAC, chúng tôi đã tiến hành docking cho các chất tổng hợp đƣợc với HDAC8 [12]. Cấu trúc HDAC8 đƣợc lấy từ ngân hàng dữ liệu protein (Protein Data Bank (PDB)) (PDB ID: 1T69). Cấu trúc của HDAC8 có điểm tƣơng đồng cao với HDAC4 với điểm DALI Z (Z-score điểm đánh giá độ giống) = 40,4 và điểm r.m.s.d (root-meansquare deviation, độ lệch) = 2,1Å, thứ tự acid amin giống nhau (46%) và là HDAC của động vật có vú đầu tiên có cấu trúc không gian đƣợc nghiên cứu kỹ nhất. Chúng tôi thực hiện kiểm soát thử nghiệm lắp ghép của các chất vào HDAC8 bằng chƣơng trình AutoDock Vina [22]. Tiếp theo chúng tôi dự đoán năng lƣợng

(32)

của sự tƣơng tác liên kết của các chất tổng hợp đƣợc với HDAC8 từ sự lắp ghép trên.

Nghiên cứu docking đƣợc thực hiện tại Phòng Nghiên cứu cấu trúc Đại học Quốc gia Seoul, Hàn Quốc.

Kết quả đƣợc minh họa bằng hình ảnh docking và số liệu dự đoán tƣơng tác.

2.3.2.2. Tổng hợp hóa học

Tổng hợp 9 chất mục tiêu theo sơ đồ sau:

Sơ đồ 2.1: Tổng hợp các dẫn chất hydroxamic mang khung 5-aryl-1,3,4-thiadiazol

a) Thiosemicarbazid, ethanol, đun hồi lưu; (b) FeCl3.12H2O; c) Acid suberic monomethyl

ester, CDI, DMF; d) NH2OH.HCl, MeOH, NaOH.

Dùng TLC để theo dõi quá trình tiến triển của phản ứng.

2.3.2.3. Kiểm tra độ tinh khiết

Nhiệt độ nóng chảy: Đo bằng máy đo điểm chảy nhiệt điện (Electrothermal

digital).

Sắc ký lớp mỏng: Dùng để theo dõi quá trình phản ứng, xác định thời điểm

kết thúc phản ứng và kiểm tra độ tinh khiết của sản phẩm sau khi tinh chế.

 Sắc ký lớp mỏng đƣợc tiến hành trên bản mỏng silicagel 60 F254 tráng sẵn,

hoạt hóa ở 110oC trong 30 phút. Hệ dung môi tùy thuộc vào đặc điểm của

từng chất. Mẫu thử đƣợc hòa tan trong dung môi thích hợp. Chấm khoảng 2l.

(33)

2.3.2.4. Xác định cấu trúc Sử dụng các phƣơng pháp phổ IR, MS, NMR (1 H và 13C) để xác định cấu trúc của các chất tổng hợp. 2.3.2.5. Thử hoạt tính sinh học * Thử hoạt tính ức chế HDAC:

Phân tích dựa trên Western blot, đƣợc tiến hành tại khoa Dƣợc, ĐH Chungbuk, Hàn Quốc. Tác dụng ức chế HDAC của các dẫn chất tổng hợp đƣợc đánh giá gián tiếp thông qua xác định mức độ acetyl hóa histon H3, H4 trong các tế bào ung thƣ. Phân tích dựa trên Western blot có thể khẳng định đƣợc tác dụng của các mẫu thử làm tăng hoặc giảm sự acetyl hóa histon H3, H4 khi so sánh với mẫu trắng.

Nguyên liệu và nuôi cấy tế bào:

Các tế bào ung thƣ đại tràng SW620 đƣợc nuôi cấy trong môi trƣờng RPMI (bổ sung L-glutamin, 10% huyết thanh bào thai bò (fetal bovine serum)), gọi là môi trƣờng nuôi cấy hoàn chỉnh (complete medium). Tất cả tế bào đƣợc ủ ở 37 C với 5% (w/v) CO2 và 95% (w/v) không khí. Trƣớc khi sử dụng, các mẫu thử nghiệm

dạng bột đƣợc hòa tan trong dimethylsulfoxid (DMSO) để tạo dung dịch gốc nồng độ 10 mg/ml. Các dung dịch gốc sau đó đƣợc pha loãng bằng môi trƣờng nuôi cấy hoàn chỉnh để tạo các dung dịch làm việc ở nồng độ 1 g/ml và 10 g/ml.

Phân lập histon và Western Blot

Tế bào SW620 (khoảng 1 x 106) đƣợc ủ với mẫu thử trong 24 giờ, song song

làm mẫu trắng (tế bào không ủ với mẫu thử). Sau đó, các tế bào đƣợc xử lý và rửa bằng dung dịch muối có bổ sung đệm phosphat. Tế bào đƣợc ly giải trong dung dịch đệm [20 mM Tris-HCl (pH 7,5); 150 mM NaCl; 1 mM Na2EDTA; 1 mM

EGTA; 1% triton; 2,5 mM Na pyrophosphat; 1 mM -glycerophosphat; 1 mM Na3VO4; 1 g/ml leupeptin], ủ trong đá 15 phút. Hỗn dịch đƣợc ly tâm và phần dịch đƣợc thu hồi để tiến hành điện di trên gel. Histon đƣợc điện di qua gel SDS-PAGE 10% và chuyển vào màng PVDF. Các màng đƣợc ủ qua đêm cùng kháng thể 1 là kháng acetyl histon H3, kháng acetyl histon H4 (Milipore), tiếp theo ủ với kháng thể 2 là kháng thể IgG thỏ liên hợp peroxidase của ngựa trong 2 giờ. Các dải

(34)

có phản ứng dƣơng tính đƣợc phát hiện nhờ sự phát quang đã đƣợc tăng cƣờng. Các thí nghiệm đƣợc làm lặp lại ít nhất 3 lần một cách độc lập.

* Thử hoạt tính kháng tế bào ung thư in vitro:

Thử độc tính tế bào in vitro đƣợc thực hiện tại Khoa Dƣợc, Trƣờng Đại học Chungbuk, Hàn Quốc theo phƣơng pháp MTT và giá trị IC50 đƣợc tính theo phƣơng

pháp GraphPad Prism.

Dòng tế bào thử nghiệm: SW620 (tế bào ung thƣ đại tràng ngƣời), MCF-7 (tế bào ung thƣ vú ngƣời), AsPC-1 (tế bào ung thƣ tụy ngƣời), PC-3 (tế bào ung thƣ tiền liệt tuyến ngƣời).

Các dòng tế bào ung thƣ đƣợc lấy từ Ngân hàng tế bào ung thƣ của Viện nghiên cứu Sinh học và Công nghệ sinh học Hàn Quốc (KRIBB) và đƣợc nuôi cấy trong môi trƣờng RPMI bổ sung 10% FBS (huyết thanh bào thai bò). Độc tính tế bào của các chất đƣợc thử bằng phƣơng pháp MTT theo các bƣớc sau:

- Chuẩn bị: Các tế bào ở pha logarit đƣợc trypsin hóa và phân tán vào hỗn dịch đơn

tế bào trong môi trƣờng RPMI bổ sung 10% FBS và điều chỉnh đến nồng độ khoảng 1,5.104

đến 3,5. 104 tế bào, sau đó chia đều vào các giếng của đĩa 96 giếng, mỗi giếng 200 µl. Các đĩa sau đó đƣợc ủ ở 37oC trong điều kiện 5% CO

2. Sau 24

giờ ủ, các mẫu thử đƣợc chuẩn bị trong 20 µl môi trƣờng RPMI bổ sung 10% FBS từ dung dịch gốc 10 mg/mL trong dimethyl sulfoxid (DMSO) rồi thêm 2 µl mẫu thử vào các giếng ở nhiều nồng độ khác nhau, các đĩa này sau đó đƣợc ủ thêm 48 giờ. Tất cả các mẫu đƣợc chuẩn bị sao cho nồng độ cuối cùng của DMSO không quá 0,1%.

- Tiến hành thử: Sau khi ủ 48 giờ, thêm vào mỗi giếng 20 µl thuốc nhuộm MTT

(3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromid) với nồng độ MTT là 5 mg/mL trong muối đệm phosphat - PBS. Các đĩa đƣợc ủ thêm 3 giờ ở 37oC trong

điều kiện 5% CO2. Tiếp theo, mỗi giếng đƣợc cho 100µl dung dịch DMSO, để 5

phút cho MTT formazan đƣợc hòa tan. Độ hấp thụ đƣợc đọc ở bƣớc sóng 510 nm.

(35)

quả cuối cùng là giá trị trung bình của 4 lần đo độc lập với giá trị độ hấp thụ khác nhau không quá 5%. Giá trị IC50 đƣợc tính dựa trên phần mềm GraphPad Prism.

(36)

Chƣơng 3. THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ

3.1. NGHIÊN CỨU DOCKING

Để tìm hiểu sơ bộ về khả năng tƣơng tác của các chất với mục tiêu phân tử là các HDAC, chúng tôi nghiên cứu và dự đoán năng lƣợng liên kết các chất trong thiết kế với trung tâm hoạt động của HDAC8. Kết quả năng lƣợng liên kết dự đoán đƣợc trình bày trong bảng 3.1.

Bảng 3.1: Kết quả docking của các chất Va-i với HDAC8

STT Chất R Năng lƣợng tƣơng tác (kcal/mol) 1 Va -6.9 2 Vb -7.1 3 Vc -6.9 4 Vd -6.8 5 Ve -6.6 6 Vf -6.8 7 Vg -6.9 8 Vh -6.4 9 Vi -6.4 SAHA -4.4

(37)

hƣớng thiết kế tìm kiếm các chất có tác dụng ức chế HDAC nên chúng tôi tiếp tục tiến hành tổng hợp và thử tác dụng sinh học của dãy chất.

Dƣới đây là hình ảnh minh họa bằng mô hình tƣơng tác của các chất với HDAC8 của chất Va, Vg (hình 3.1).

Hình 3.1: Mô hình tương tác của Va, Vg và SAHA với HDAC8

Chú thích: SAHA (màu vàng); Va (màu xanh dương), Vg(màu vàng nâu); Ion Zn2+ (màu xám) 3.2. TỔNG HỢP HÓA HỌC 3.2.1. Tổng hợp chất N1-[5-(furan-2-yl)-1,3,4-thiadiazol-2-yl]-N8 -hydroxyoctandiamid (Va) Chất Va đƣợc tổng hợp theo sơ đồ 3.1. Sơ đồ 3.1: Sơ đồ phản ứng tổng hợp chất Va 3.2.1.1. Tổng hợp chất IIa

Tổng hợp 2-(ylmethyliden)hydrazincarbothioamid (IIa) từ

furan-2-carbaldehyd (Ia) đƣợc thực hiện bằng phản ứng ngƣng tụ với xúc tác là acid hữu

(38)

Sơ đồ 3.2: Tổng hợp chất IIa Tiến hành phản ứng:

Cho 0,18ml (2mmol) furan-2-carbaldehyd (Ia) và 0,2180g (2,4mmol) thiosemicarbazid vào bình cầu 50 mL. Thêm 20 ml dung môi EtOH tuyệt đối và 2 giọt acid acetic băng làm xúc tác. Đun hồi lƣu và khuấy 300 vòng/phút trong 4h.

Thu sản phẩm:

Cất thu hồi dung môi bằng máy cất quay ở nhiệt độ 400C sau đó thêm 15

mL nƣớc cất để tủa sản phẩm. Lọc và rửa tủa 3 lần bằng 15 mL nƣớc cất. Sấy khô tủa ở 600C (trong khoảng 24h).

Kết quả:

 Cảm quan: Bột tinh thể màu trắng .

 Hiệu suất: 90,5% (0,3059g).

 T0nc: 165-1670C.

 Kiểm tra bằng TLC với pha động DCM : MeOH (9:1) cho Rf = 0,66.

Toàn bộ sản phẩm IIa đƣợc dùng để thực hiện bƣớc tiếp theo của quá trình tổng hợp chất Va.

3.2.1.2. Tổng hợp chất IIIa

Thực hiện việc tổng hợp chất 5-(furan-2-yl)-1,3,4-thiadiazol-2-amin (IIIa) từ IIa bằng phản ứng đóng vòng nội phân tử. Quá trình tổng hợp đƣợc thực hiện theo sơ đồ 3.3 [33].

Sơ đồ 3.3: Tổng hợp chất IIIa Tiến hành phản ứng:

(39)

mmol) chất IIa, hòa tan bằng 20 mL dung môi EtOH tuyệt đối trong cốc có mỏ, đun nóng khoảng 70ºC.

Đổ dung dịch chất IIa từ cốc có mỏ vào bình phản ứng, tiếp tục đun hồi lƣu và khuấy 300 vòng/phút. Kết thúc phản ứng sau 3 giờ.

Thu sản phẩm:

Cất thu hồi bớt dung môi bằng máy cất quay ở nhiệt độ khoảng 400C trong 2 phút sau đó pha loãng hỗn hợp phản ứng bằng nƣớc cất. Kiềm hóa hỗn hợp bằng khoảng 10 mL dung dịch NaOH 30% (kiểm tra bằng giấy quỳ).

Chiết 3 lần bằng cloroform (mỗi lần 5-10 mL), thu lớp dƣới. Gộp dịch chiết của 3 lần chiết lại với nƣớc muối bão hòa. Cất thu hồi dung môi của dịch chiết bằng máy cất quay ở nhiệt độ 400C đến khi hết dung môi, thu sản phẩm IIIa. Sấy sản phẩm ở 600C trong 4h.

Kết quả:

 Cảm quan: Bột kết tinh màu vàng nhạt.

 Hiệu suất: 72,1% (0,1204g).

 T0nc: 196-1970C.

 Kiểm tra bằng TLC với pha động DCM : MeOH (9:1) cho Rf = 0,54.

3.2.1.3. Tổng hợp chất IVa

Chất methyl 8-{[5-(furan-2-yl)-1,3,4-thiadiazol-2-yl]amino}-8-oxooctanoat (IVa) đƣợc tổng hợp từ chất IIIa bằng phản ứng acyl hóa của chất IIIa với acid suberic monomethyl ester. Quy trình tổng hợp đƣợc thực hiện nhƣ sau:

Sơ đồ 3.4: Tổng hợp chất IVa Tiến hành phản ứng:

Cho 0,1620g (1 mmol) 1,1’-carbonyldiimidazol (CDI) và 1mL (1 mmol) acid suberic monomethyl ester vào bình cầu 50mL. Thêm 3mL dung môi DMF. Hoạt hóa trong 5 phút ở nhiệt độ phòng. Sau khi hỗn hợp trong bình phản ứng đã

(40)

hoạt hóa đủ thời gian, cho 0,1670g (1 mmol) chất IIIa vào bình phản ứng, gia nhiệt lên 600C, khuấy 300 vòng/phút trong vòng 24h.

Thu sản phẩm:

Làm lạnh bình phản ứng bằng nƣớc đá. Đổ từ từ 15 mL dung dịch HCl loãng, lạnh vào bình phản ứng, vừa đổ vừa lắc. Để yên 15 phút.

Lọc và rửa tủa 3 lần bằng 15 mL dung dịch acid HCl loãng, lạnh. Sấy tủa ở 600C trong 24h.

Kết quả:

 Cảm quan: Bột kết tinh màu trắng hơi hồng.

 Hiệu suất: 57,0% (0,1921g).

 T0nc: 228-2300C.

 Kiểm tra bằng TLC với pha động DCM : MeOH (9:1) cho Rf = 0,72.

3.2.1.4. Tổng hợp chất Va

Chất N1

-[5-(furan-2-yl)-1,3,4-thiadiazol-2-yl]-N8-hydroxyoctandiamid (Va)

đƣợc tổng hợp bằng phản ứng giữa chất IVa với hydroxylamin hydroclorid. Tổng hợp chất Va đƣợc thực hiện nhƣ sau:

Sơ đồ 3.5: Tổng hợp chất Va Tiến hành phản ứng:

Cho 0,1690g (0,5 mmol) chất IVa và 0,33g (5 mmol) hydroxylamin hydroclorid vào bình cầu 50 mL, thêm 20 mL dung môi MeOH, dùng siêu âm để tạo hỗn dịch đồng nhất. Đặt bình phản ứng trong hỗn hợp nƣớc đá và muối ăn, duy trì nhiệt độ dƣới 00C, khuấy 300 vòng/phút.

Hòa tan 0,40g (10mmol) NaOH trong 5 ml nƣớc cất trong ống nghiệm và làm lạnh xuống dƣới 00C trong hỗn hợp nƣớc đá muối. Đổ dung dịch NaOH vào bình phản ứng, giữ nhiệt độ dƣới 00C, phản ứng kết thúc sau 1giờ. Theo dõi tiến

(41)

trình phản ứng và xác định thời điểm kết thúc bằng cách dùng dung dịch FeCl3 và TLC, cụ thể làm nhƣ sau:

- Acid hóa khoảng 0,1 mL hỗn hợp phản ứng bằng dung dịch HCl loãng trên khay sứ, sau đó nhỏ 1 giọt dung dịch FeCl3 5%, xuất hiện màu đỏ vang chứng tỏ đã

có acid hydroxamic đƣợc tạo ra.

- Acid hóa khoảng 0,1 mL hỗn hợp phản ứng, kiểm tra TLC với pha động DCM : MeOH (9:1). Kết thúc phản ứng khi ester ban đầu đã hết.

Thu sản phẩm:

Acid hóa hỗn hợp phản ứng bằng dung dịch HCl loãng, lạnh điều chỉnh pH về khoảng 4-5 (kiểm tra bằng giấy quỳ vạn năng). Để qua đêm sau đó lọc và rửa tủa 3 lần bằng 15 mL dung dịch HCl loãng. Sấy tủa ở 600C trong 24h.

Kết quả:

 Cảm quan: Bột kết tinh màu trắng.

 Hiệu suất: 51,2% (0,0865g).

 Kiểm tra bằng TLC và xác định cấu trúc (kết quả cụ thể đƣợc trình bày trong bảng 3.1 và phần 3.3).  T0nc: 198-2010C. 3.2.2. Tổng hợp chất N1-[5-(5-bromofuran-2-yl)-1,3,4-thiadiazol-2-yl]-N8 -hydroxyoctandiamid (Vb) Chất Vb đƣợc tổng hợp theo sơ đồ 3.6. Sơ đồ 3.6: Sơ đồ phản ứng tổng hợp chất Vb

(42)

3.2.2.1. Tổng hợp chất IIb

Tổng hợp chất IIb từ 0,3500g (2 mmol) chất 5-bromofuran-2-carbaldehyd (Ib) đƣợc thực hiện tƣơng tự nhƣ tổng hợp chất IIa. Kết quả nhƣ sau:

 Cảm quan: Sản phẩm thu đƣợc là bột kết tinh màu trắng.

 Hiệu suất: 85,0% (0,4216g).

 T0nc: 171-1740C.

 Kiểm tra bằng TLC với pha động DCM : MeOH (9:1) cho Rf = 0,65.

3.2.2.2. Tổng hợp chất IIIb

Tổng hợp chất 5-(5-bromofuran-2-yl)-1,3,4-thiadiazol-2-amin (IIIb) từ 0,2480g (1 mmol) chất IIb đƣợc tiến hành tƣơng tự nhƣ tổng hợp chất IIIa. Kết quả nhƣ sau:

 Cảm quan: Bột kết tinh màu vàng nhạt.

 Hiệu suất: 70,3% (0,1729g).

 T0nc: 192-1940C.

 Kiểm tra bằng TLC với pha động DCM : MeOH (9:1) cho Rf = 0,53.

3.2.2.3. Tổng hợp chất IVb

Tổng hợp chất methyl

8-{[5-(5-bromofuran-2-yl)-1,3,4-thiadiazol-2-yl]amino}-8-oxooctanoat (IVb) từ 0,2460g (1 mmol) chất IIIb đƣợc tiến hành

tƣơng tự nhƣ tổng hợp chất IVa. Kết quả của quá trình nhƣ sau:

 Cảm quan: Bột kết tinh màu trắng ngà.

 Hiệu suất: 62,9% (0,2617g).

 T0nc: 210-2120C.

 Kiểm tra bằng TLC với pha động DCM : MeOH (9:1) cho Rf = 0,77.

3.2.2.4. Tổng hợp chất Vb

Tổng hợp chất đích N1

-[5-(5-bromofuran-2-yl)-1,3,4-thiadiazol-2-yl]-N8 -hydroxyoctandiamid (Vb) từ 0,2080g (0,5 mmol) chất IVb đƣợc tiến hành tƣơng

(43)

 Hiệu suất phản ứng: 52,0% (0,1084g).

 T0nc: 200-2030C.

 Kiểm tra bằng TLC và xác định công thức (kết quả cụ thể đƣợc trình bày trong bảng 3.1 và phần 3.3). 3.2.3. Tổng hợp chất N1-hydroxy-N8 -[5-(5-methylfuran-2-yl)-1,3,4-thiadiazol-2-yl]octandiamid (Vc) Chất Vc đƣợc tổng hợp theo sơ đồ 3.7. Sơ đồ 3.7: Sơ đồ phản ứng tổng hợp chất Vc 3.2.3.1. Tổng hợp chất IIc

Tổng hợp chất IIc từ 0,2220g (2 mmol) chất 5-methylfuran-2-carbaldehyd (Ic) đƣợc thực hiện tƣơng tự nhƣ tổng hợp chất IIa. Kết quả nhƣ sau:

 Cảm quan: Sản phẩm thu đƣợc là bột kết tinh màu trắng.

 Hiệu suất: 86,6% (0,3170g).

 T0nc: 169-1710C.

 Kiểm tra bằng TLC với pha động DCM : MeOH (9:1) cho Rf = 0,65.

3.2.3.2. Tổng hợp chất IIIc

Tổng hợp chất 5-(5-methylfuran-2-yl)-1,3,4-thiadiazol-2-amin (IIIc) từ 0,1830g (1 mmol) chất IIc đƣợc tiến hành tƣơng tự nhƣ tổng hợp chất IIIa. Kết quả nhƣ sau:

 Cảm quan: Bột kết tinh màu vàng nhạt.

 Hiệu suất: 71,0% (0,1285g).

 T0nc: 186-1890C.

(44)

3.2.3.3. Tổng hợp chất IVc

Tổng hợp chất methyl

8-{[5-(5-methylfuran-2-yl)-1,3,4-thiadiazol-2-yl]amino}-8-oxooctanoat (IVc) từ 0,1810g (1 mmol) chất IIIc đƣợc tiến hành

tƣơng tự nhƣ tổng hợp chất IVa. Kết quả của quá trình nhƣ sau:

 Cảm quan: Bột kết tinh màu trắng ngà.

 Hiệu suất: 58,8% (0,2064g).

 T0nc: 199-2020C.

 Kiểm tra bằng TLC với pha động DCM : MeOH (9:1) cho Rf = 0,75.

3.2.3.4. Tổng hợp chất Vc

Tổng hợp chất đích N1-hydroxy-N8 -[5-(5-methylfuran-2-yl)-1,3,4-thiadiazol-2-yl]octandiamid (Vc) từ 0,1800g (0,5 mmol) chất IVc đƣợc tiến hành tƣơng tự

nhƣ tổng hợp chất Va. Kết quả của quá trình nhƣ sau:

 Cảm quan: Bột kết tinh màu trắng.

 Hiệu suất phản ứng: 54,9% (0,0966g).

 T0nc: 178-1810C.

 Kiểm tra bằng TLC và xác định công thức (kết quả cụ thể đƣợc trình bày trong bảng 3.1 và phần 3.3).

3.2.4. Tổng hợp chất N1-hydroxy-N8 -[5-(thiophen-2-yl)-1,3,4-thiadiazol-2-yl]octandiamid (Vd)

(45)

3.2.4.1. Tổng hợp chất IId

Tổng hợp chất IId từ 0,19mL (2mmol) chất thiophen-2-carbaldehyd (Id) đƣợc thực hiện tƣơng tự nhƣ tổng hợp chất IIa. Kết quả nhƣ sau:

 Cảm quan: Bột kết tinh màu trắng.

 Hiệu suất: 86% (0,3182g).

 T0nc: 170-1720C.

 Kiểm tra bằng TLC với pha động DCM : MeOH (9:1) cho Rf = 0,63.

3.2.4.2. Tổng hợp chất IIId

Tổng hợp chất 5-(thiophen-2-yl)-1,3,4-thiadiazol-2-amin (IIId) từ 0,185g (1 mmol) chất IId đƣợc tiến hành tƣơng tự nhƣ tổng hợp chất IIIa. Kết quả nhƣ sau:

 Cảm quan: Bột kết tinh màu vàng nâu.

 Hiệu suất: 70,0% (0,1281g).

 T0nc: 182-1840C.

 Kiểm tra bằng TLC với pha động DCM : MeOH (9:1) cho Rf = 0,53.

3.2.4.3. Tổng hợp chất IVd

Tổng hợp chất methyl

8-oxo-8-{[5-(thiophen-2-yl)-1,3,4-thiadiazol-2-yl]amino}octanoat (IVd) đƣợc tiến hành tƣơng tự nhƣ tổng hợp chất IVa. Kết quả

của quá trình nhƣ sau:

 Cảm quan: Bột kết tinh màu trắng .

 Hiệu suất: 60,3% (0,2120g).

 T0nc: 196-1980C.

 Kiểm tra bằng TLC với pha động DCM : MeOH (9:1) cho Rf = 0,77.

3.2.4.4. Tổng hợp chất Vd

Tổng hợp chất đích N1-hydroxy-N8 -[5-(thiophen-2-yl)-1,3,4-thiadiazol-2-yl]octanediamid (Vd) từ 0,1775g ( 0,5 mmol) chất IVd đƣợc

tiến hành tƣơng tự nhƣ tổng hợp chất Va. Kết quả nhƣ sau:

 Cảm quan: Bột kết tinh màu trắng.

 Hiệu suất phản ứng: 55,2% (0,0977g).

(46)

 Kiểm tra bằng TLC và xác định cấu trúc (kết quả cụ thể đƣợc trình bày trong bảng 3.1 và phần 3.3). 3.2.5. Tổng hợp chất N1-[5-(5-bromothiophen-2-yl)-1,3,4-thiadiazol-2-yl]-N8 -hydroxyoctandiamid (Ve) Chất Ve đƣợc tổng hợp theo sơ đồ 3.9. Sơ đồ 3.9: Sơ đồ phản ứng tổng hợp chất Ve 3.2.5.1. Tổng hợp chất IIe

Tổng hợp chất IIe từ 0,24ml (2 mmol) chất

5-bromothiophen-2-carbaldehyd (Ie) đƣợc thực hiện tƣơng tự nhƣ tổng hợp chất IIa. Kết quả nhƣ sau:

 Cảm quan: Sản phẩm thu đƣợc là bột kết tinh màu trắng.

 Hiệu suất: 90,1% (0,4757g).

 T0nc: 175-1770C.

 Kiểm tra bằng TLC với pha động DCM : MeOH (9:1) cho Rf = 0,60.

3.2.5.2. Tổng hợp chất IIIe

Tổng hợp chất 5-(5-bromothiophen-2-yl)-1,3,4-thiadiazol-2-amin (IIIe) từ 0,2640g (1 mmol) chất IIe đƣợc tiến hành tƣơng tự nhƣ tổng hợp chất IIIa. Kết quả nhƣ sau:

 Cảm quan: Bột kết tinh màu vàng nhạt.

 Hiệu suất: 68,5% (0,1795g).

(47)

3.2.5.3. Tổng hợp chất IVe

Tổng hợp chất methyl

8-{[5-(5-bromothiophen-2-yl)-1,3,4-thiadiazol-2-yl]amino}-8-oxooctanoat (IVe) từ 0,2620g (1mmol) chất IIIe đƣợc tiến hành tƣơng

tự nhƣ tổng hợp chất IVa. Kết quả của quá trình nhƣ sau:

 Cảm quan: Bột kết tinh màu trắng ngà.

 Hiệu suất: 55% (0,2376g).

 T0nc: 203-2050C.

 Kiểm tra bằng TLC với pha động DCM : MeOH (9:1) cho Rf = 0,76.

3.2.5.4. Tổng hợp chất Ve

Tổng hợp chất đích N1-[5-(5-bromothiophen-2-yl)-1,3,4-thiadiazol-2-yl]-N8 -hydroxyoctandiamid (Ve) từ 0,2240g (0,5 mmol) chất IVe đƣợc tiến hành tƣơng tự

nhƣ tổng hợp chất Va. Kết quả của quá trình nhƣ sau:

 Cảm quan: Bột kết tinh màu trắng.

 Hiệu suất phản ứng: 51,8% (0,1121g).

 T0nc: 181-1830C.

 Kiểm tra bằng TLC và xác định công thức (kết quả cụ thể đƣợc trình bày trong bảng 3.1 và phần 3.3).

3.2.6. Tổng hợp chất N1-hydroxy-N8 -[5-(5-methylthiophen-2-yl)-1,3,4-thiadiazol-2-yl]octandiamid (Vf)

Chất Vf đƣợc tổng hợp theo sơ đồ 3.10.

References

Related documents

[...] » Ἀνίσως ὅμως καθένας ἀπὸ σᾶς διὰ τὴν πλεονεξίαν του, διὰ νὰ ὠφελῇ τὸν ἑαυτόν του, κατατυραννῇ ἀσεβῶς καὶ βασανίζῃ τοὺς πτωχοὺς ῥαγιᾶδες

Figure 6.15 Effect of Redox state on RC-LH1 : Cytochrome c2 interaction at 250mM NaCl Distribution of unbinding forces and interaction frequency for cyt c 2 being in

Summary of all metrics assessing the performance of the RF-applicators, including the worst reflection and coupling coefficients (column 1, ‘Scattering ’), the Hyperthermia

Two patients died within 30 days of rupture, of which one patient had a known ruptured AAA at the time of EVAR repair; the other was taken back to the operating room on the day of

In 2015, the Supreme Court ruled, with a five to four, majority that state laws preventing the issuance of marriage licences to same-sex couples, and recognition of marriages

Comparative overview on key aspects from implementing the transdisciplinary approach within 5 Caste study regions (synthesis from Ludi and Oates, 2015) Study site Gumsalassa

This paper investigates conditional and unconditional maize price volatility in Malawi at the country and local-economy market levels and related welfare costs.. The empirical

legislativas y en caso de violación de las leyes en vigor o de sus obligaciones por parte de los miembros fundadores del partido antes o después de la celebración