• No results found

Xây Dựng Quy Trình Xác Định (Định Tính, Định Lượng) Bifidobacterium Longum Trong Các Chế Phẩm Probiotics

N/A
N/A
Protected

Academic year: 2021

Share "Xây Dựng Quy Trình Xác Định (Định Tính, Định Lượng) Bifidobacterium Longum Trong Các Chế Phẩm Probiotics"

Copied!
112
0
0

Loading.... (view fulltext now)

Full text

(1)

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

BỘ Y TẾ

TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI

TRỊNH THỊ PHƢƠNG DUNG

XÂY DỰNG QUY TRÌNH XÁC ĐỊNH (ĐỊNH

TÍNH, ĐỊNH LƢỢNG) BIFIDOBACTERIUM

LONGUM TRONG CÁC CHẾ PHẨM

PROBIOTICS

LUẬN VĂN THẠC SĨ DƢỢC HỌC

HÀ NỘI 2014

(2)

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

BỘ Y TẾ

TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI

TRỊNH THỊ PHƢƠNG DUNG

XÂY DỰNG QUY TRÌNH XÁC ĐỊNH (ĐỊNH

TÍNH, ĐỊNH LƢỢNG) BIFIDOBACTERIUM

LONGUM TRONG CÁC CHẾ PHẨM

PROBIOTICS

LUẬN VĂN THẠC SĨ DƢỢC HỌC

CHUYÊN NGÀNH KIỂM NGHIỆM THUỐC VÀ ĐỘC CHẤT

MÃ SỐ 60 72 04 10

Người hướng dẫn khoa học:

TS. Trần Việt Hùng

(3)

LỜI CẢM ƠN

Luận văn này được hoàn thành tại khoa Vi Sinh – Viện Kiểm nghiệm Thuốc Trung Ương – Bộ Y tế. Để có được bản luận văn tốt nghiệp này tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành và sâu sắc tới TS. Trần Việt Hùng, người thầy đã trực tiếp hướng dẫn, dìu dắt tôi trong suốt thời gian thực hiện nghiên cứu này.

Xin chân thành cám ơn các thầy cô trong Ban Giám hiệu, Phòng Đào tạo sau đại học, Bộ môn Kiểm Nghiệm Thuốc và Độc chất và các Bộ môn khác của trường Đại Học Dược Hà Nội đã giúp tôi trang bị tri thức, tạo môi trường, điều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt quá trình học tập tại trường cũng như trong quá trình hoàn thành luận văn.

Tôi xin chân thành cảm ơn TS. Đoàn Cao Sơn – Viện trưởng Viện kiểm Nghiệm Thuốc Trung Ương, Ban Giám Đốc Viện Kiểm Nghiệm Thuốc Trung Ương, các đồng nghiệp trong khoa và Th s. Khổng Thị Minh Huệ đã hỗ trợ, giúp đỡ để tôi hoàn thành tốt luận văn thạc sĩ và hoàn thành khóa học theo đúng thời hạn.

Cuối cùng, tôi xin gửi lời tri ân sâu sắc đến gia đình và bạn bè đã luôn ở bên tôi động viên, chia sẻ, giúp đỡ tôi trong thời gian vừa qua

Hà Nội 27 tháng 8 năm 2014 Dược sỹ Trịnh Thị Phương Dung

(4)

MỤC LỤC

CÁC CHỮ VIẾT TẮT DANH MỤC BẢNG DANH MỤC HÌNH ĐẶT VẤN ĐỀ ... 1 CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN ... 3 1.1. TỔNG QUAN VỀ PROBIOTICS ... 3 1.1.1. Định nghĩa ... 3

1.1.2. Ứng dụng của probiotics trong ngành Dược ... 3

1.1.3. Các vi sinh vật thường được sử dụng trong chế phẩm probiotics... 4

1.1.4. Tổng quan về tiêu chuẩn chất lượng probiotics ... 4

1.2. TỔNG QUAN VỀ CHI BIFIDOBACTERIUM ... 6

1.2.1. Đặc điểm chung của chi Bifidobacterium [30], [33],... 6

1.2.2. Bifidobacteria với vai trò là probiotics. ... 6

1.3. TỔNG QUAN VỀ B. LONGUM ... 7

1.3.1. Đặc điểm hình thái ... 7

1.3.2. Khả năng chuyển hóa carbohydrat [31]. ... 8

1.3.3. Cấu trúc gen cuả B. longum [24] ... 8

1.3.4. Vai trò của B. longum [9], [11], [24], [26] , [15], [33], [35]. ... 9

1.3.5. Phương pháp kiểm nghiệm B. longum trong chế phẩm probiotics ... 10

1.3.6. Tình hình nghiên cứu định tính và định lượng B. longum trong các chế phẩm probiotics trong những năm gần đây ... 17

CHƢƠNG 2. ĐỐI TƢỢNG, NGUYÊN VẬT LIỆU, TRANG THIẾT BỊ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ... 20

2.1. PHƢƠNG TIỆN DÙNG TRONG NGHIÊN CỨU ... 20

2.1.1. Môi trường, hoá chất, dung môi, thiết bị ... 20

2.1.1.1. Môi trường ... 20

2.1.1.2. Hoá chất, dung môi ... 22

2.1.1.3. Thiết bị, dụng cụ ... 23

2.1.2. Phần mềm xử lý kết quả: Apiweb của hãng BioMérieux. ... 24

2.1.3. Chủng vi sinh vật chuẩn ... 24

(5)

2.3. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ... 26

2.3.1. Phương pháp định lượng B. longum trong chế phẩm ... 26

2.3.2. Phương pháp định danh vi sinh vật bằng kit API 20A ... 27

2.3.2.1. Nguyên tắc chung ... 27

2.3.2.2. Tiến hành ... 28

2.3.3. Định danh đến loài bằng kỹ thuật PCR và giải trình tự ... 31

2.3.3.1. Sơ đồ chung định tính B. longum trong các chế phẩm probiotics bằng kỹ thuật PCR và giải trình tự ... 31

2.3.3.2. Tách DNA vi khuẩn bằng WizardR Genomic DNA Purification Kit ... 32

2.3.3.3. Định lượng DNA bằng phương pháp đo độ hấp thụ ánh sáng tử ngoại ở bước sóng 260 nm (A260) ... 33

2.3.3.4. Nghiên cứu, thiết kế mồi đặc hiệu ... 33

2.3.3.5. Kiểm tra khả năng tách DNA ... 34

2.3.3.6. Nhân bản đoạn gen đặc hiệu của các đối tượng nghiên cứu bằng kỹ thuật PCR ... 35

2.3.3.7. Nhân dòng và giải trình tự ... 36

2.3.4. Thẩm định quy trình đã xây dựng ... 39

2.3.4.1. Thẩm định phương pháp định lượng B. longum ... 39

2.3.4.2. Thẩm định qui trình định danh bằng kit API 20A ... 41

2.3.4.3. Thẩm định qui trình định danh bằng kỹ thuật PCR và giải trình tự 41 2.3.5. Ứng dụng quy trình chuẩn để định lượng và định tính B. longum trong các chế phẩm probiotics đang lưu hành trên thị trường ... 44

CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU ... 45

3.1. XÁC ĐỊNH SỐ LƢỢNG VI SINH VẬT TRONG CHẾ PHẨM PROBIOTICS ... 45

3.2. ĐỊNH DANH VI SINH VẬT BẰNG KIT API 20A ... 46

3.3. KẾT QUẢ ĐỊNH DANH VI SINH VẬT TRONG CÁC MẪU BẰNG KỸ THUẬT PCR VÀ GIẢI TRÌNH TỰ ... 51

3.3.1. Kết quả tách DNA ... 51

3.3.1.1 Tách DNA bằng WizardR Genomic DNA Purification kit của hãng Promega ... 51

3.3.1.2. Kiểm tra khả năng tách DNA ... 51

3.3.2. Nhân bản các đoạn gen đặc hiệu của các đối tượng vi sinh vật thuộc đối tượng nghiên cứu ... 52

(6)

3.3.3. Nhân dòng và giải trình tự ... 55

3.3.3.1.Tinh sạch sản phẩm PCR nhân bản các đoạn gen đặc hiệu của các vi sinh vật phân lập từ các mẫu nghiên cứu bằng bộ kit Fermentas ... 55

3.3.3.2. Nhân dòng các đoạn gen đặc hiệu vào vector nhân dòng và biến nạp vào tế bào E. coli chủng DH5α ... 56

3.3.3.3. Kiểm tra sự có mặt của các đoạn gen đặc hiệu trong plasmid tái tổ hợp ... 57

3.3.3.4. Giải trình tự mẫu chứa phân đoạn 831 bp ... 60

3.4. ĐÁNH GIÁ PHƢƠNG PHÁP ... 62

3.4.1. Kết quả kiểm tra tính chọn lọc của môi trường định lượng BSM agar . 62 3.4.2. Độ lặp lại của phép định lượng ... 63

3.4.3. Thẩm định độ đặc hiệu của quy trình định danh vi sinh vật bằng kit API 20A ... 64

3.4.4. Đánh giá độ đặc hiệu của quy trình định danh vi sinh vật bằng kỹ thuật PCR ... 65

3.4.5. Xác định ngưỡng phát hiện của quy trình nhân bản đoạn gen đặc hiệu của B. longum bằng cặp mồi đặc hiệu. ... 68

CHƢƠNG 4. BÀN LUẬN ... 71

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ... 73

TÀI LIỆU THAM KHẢO ... 74 PHỤ LỤC

(7)

CÁC CHỮ VIẾT TẮT

AA: Acid acetic AL: Acid lactic

ATCC: American Type Culture Collection B. longum: Bifidobacterium longum

dATP: Deoxy adenosine Triphosphat dCTP: Deoxy cytosineTriphosphat dGTP: Deoxy guanine Triphosphat DNA: Deoxyribo nucleic acid dNTP: Deoxy nucleic Triphosphat dTTP: Deoxy thymin Triphosphat E. coli : Escherichia coli

EDTA Ethylenediaminetetraacetic acid

FAO Food and Agriculture Organization of the United Nations

FISH: fluorescence in situ hydridization JCM: Japan Colletion of Microorganisms LAB: Lactic acid bacteria

LB Luria Bertani

PCR: Polymerase Chain Reaction rRNA: Ribosome Ribonucleic acid VSV: Vi sinh vật

(8)

DANH MỤC BẢNG

Trang

Bảng 2.1 Mồi đặc hiệu 22

Bảng 2.2 Hóa chất, dung môi 22

Bảng 2.3 Các vi sinh vật chuẩn được sử dụng 24 Bảng 2.4

Cách đọc kết quả kit Api 20A

30 Bảng 2.5 Trình tự các cặp mồi dùng cho phản ứng PCR 34 Bảng 2.6 Thành phần của phản ứng PCR kiểm tra DNA mới tách 35 Bảng 2.7 Thành phần của phản ứng PCR đơn mồi 36 Bảng 2.8 Thành phần phản ứng gắn sản phẩm PCR vào vector 38 Bảng 2.9 Các chủng chuẩn kiểm tra tính chọn lọc của môi trường BSM

agar

40

Bảng 2.10 Công thức tính độ đặc hiệu 42 Bảng 2.11 Tiêu chuẩn đánh giá chất lượng của sản phẩm PCR 43 Bảng 3.1 Số lượng vi sinh vật trong chế phẩm 45 Bảng 3.2 Theo dõi phản ứng định danh vi sinh vật bằng kit API 20A 48 Bảng 3.3 Kết quả định danh vi sinh vật bằng phần mềm Apiweb 50 Bảng 3.4 Kết quả đo quang các dung dịch DNA mới tách 51 Bảng 3.5 Thành phần của phản ứng PCR 53 Bảng 3.6 Kết quả kiểm tra tính chọn lọc của môi trường BSM agar 62 Bảng 3.7 Kết quả đếm số lượng vi khuẩn trong mẫu A 64 Bảng 3.8 Kết quả kiểm tra độ đặc hiệu của cặp mồi BlonF/BlonR trên

20 chủng

66

Bảng 3.9 Kết quả đếm số lượng vi khuẩn B. longum 68 Bảng 3.10 Kết quả xác định ngưỡng phát hiện 69

(9)

DANH MỤC HÌNH

Trang Hình 1.1 Hình ảnh B. longum trên kính hiển vi điện tử 8

Hình 1.2 Hình ảnh genom B. longum 8

Hình 1.3 Sơ đồ phản ứng chuỗi polymerase 14 Hình 1.4 Hình minh họa kỹ thuật PCR 14 Hình 2.1 Sơ đồ định tính B. longum bằng kỹ thuật PCR và giải trình tự 31 Hình 3.1 Định danh vi sinh vật trong trong mẫu A bằng kit API 20A 46 Hình 3.2 Định danh vi sinh vật trong trong mẫu B bằng kit API 20A 46 Hình 3.3 Định danh vi sinh vật trong trong mẫu C bằng kit API 20A 47 Hình 3.4 Định danh vi sinh vật trong trong mẫu D bằng kit API 20A 47 Hình 3.5 Định danh vi sinh vật trong trong mẫu E bằng kit API 20A 47 Hình 3.6 Quan sát giếng ESC dưới đèn UV ở bước sóng 365nm 48 Hình 3.7 Kết quả điện di sản phẩm PCR nhân bản đoạn gen 16S rDNA

bằng cặp mồi ID16R08F và IDL16R09R

52

Hình 3.8 Kết quả điện di sản phẩm PCR nhân bản đoạn gen đặc hiệu của B. longum bằng cặp mồi BlonF/BlonR

54

Hình 3.9 Kết quả điện di mẫu tinh sạch sản phẩm PCR nhân bản các đoạn gen đặc hiệu phân lập từ các mẫu nghiên cứu trên gel agarose 1%

55

Hình 3.10 Sơ đồ vector nhân dòng pGEMT-eseay 56 Hình 3.11 Kết quả biến nạp sản phẩm gắn vào vi khuẩn E. Coli DH5α. và

cấy trải trên môi trường nuôi cấy có bổ sung ampicillin 100µg/ml

57

Hình 3.12 Kết quả điện di sản phẩm PCR kiểm tra plasmid tái tổ hợp mang các đoạn gen có kích thước 831bp

58

Hình 3.13 Kết quả điện di sản phẩm cắt giới hạn vector tái tổ hợp mang các phân đoạn 831 bp bằng enzym EcoRI

(10)

Hình 3.14 Hình thái khuẩn lạc B. longum trên môi trường BSM agar 63 Hình 3.15 Định danh B. longum JCM 1217 bằng kit Api 20A 65 Hình 3.16 Kết quả điện di sản phẩm PCR kiểm tra độ đặc hiệu của cặp

mồi nhân bản đoạn gen đặc hiệu của B. longum

67

Hình 3.17 Kết quả điện di sản phẩm PCR xác định ngưỡng phát hiện của quy trình nhân bản đoạn gen đặc hiệu của B. longum

(11)

1

ĐẶT VẤN ĐỀ

Vi khuẩn lactic (LAB) có vai trò rất quan trọng trong cuộc sống của chúng ta. Chúng tạo ra các thực phẩm lên men và bảo quản thực phẩm khỏi bị hư hỏng. Từ đầu thế kỷ 20, Elie Metchnikoff (1845-1916) đã đề xuất sử dụng các LAB cho mục đích chữa bệnh. Từ đó, lĩnh vực nghiên cứu probiotics ngày càng được quan tâm và phát triển. Đến nay, những nghiên cứu về probiotics đã không ngừng cung cấp những bằng chứng có tính khoa học về hiệu quả thực sự của probiotics đối với sức khỏe con người. Bên cạnh đó, các sản phẩm chức năng sử dụng các vi khuẩn probiotics xuất hiện ngày càng nhiều ở Châu Âu, Nhật, Mỹ… Năm 2008, doanh thu từ các chế phẩm này là 15,9 tỉ USD trên toàn cầu [10].

Probiotics bắt nguồn từ ngôn ngữ Hy Lạp có nghĩa là vì sự sống (for life). Năm 2002 tổ chức Nông Lương Liên hiệp quốc và tổ chức Y tế thế giới nêu rõ: “probiotics là những vi sinh vật sống mà khi sử dụng với một lượng thích hợp, sẽ tạo nên những hiệu quả tốt đối với sức khỏe của cơ thể chủ” [32]. Các probiotics thường có trong các chế phẩm là vi khuẩn sinh acid lactic (LAB) trong đó bao gồm chi Lactobacillus và chi Bifidobacterium, vi khuẩn sinh bào tử Bacillus, nấm Saccharomyces cerevisiae…

Theo Robin Temmerman (2001) trong số 55 mẫu khảo sát chỉ có khoảng 20% chế phẩm có chứa vi khuẩn đúng như trên nhãn, 16% chế phẩm không chứa một trong các chủng probiotics được liệt kê trên nhãn [28]. Mặt khác số lượng vi sinh vật trong các chế phẩm probiotics giảm nhiều trong thời gian bảo quản. Như vậy, việc định tính, định lượng các loài vi khuẩn probiotics trong các chế phẩm là rất quan trọng, đảm bảo chất lượng của chế phẩm, mang lại hiệu quả cho người dùng.

Thị trường thuốc Việt Nam hiện có hàng trăm chế phẩm probiotics dưới dạng thuốc và thực phẩm chức năng, trong đó có rất nhiều chế phẩm có chứa Bifidobacterium longum (B. longum là một vi khuẩn thuộc nhóm LAB) dưới dạng đơn hoặc đa thành phần. Mặc dù trên thế giới đã có rất nhiều công trình nghiên cứu để định tính và định lượng B. longum trong các chế phẩm đa thành phần, tuy nhiên ở Việt Nam việc kiểm soát chất lượng của các chế phẩm probiotics còn đang bỏ

(12)

2

ngỏ. Cụ thể là Việt Nam chưa có một tài liệu chính thức nào hướng dẫn kiểm soát chất lượng các chế phẩm probiotics bao gồm cả các chế phẩm chứa B. longum. Đa số các tiêu chuẩn cơ sở của các thuốc và thực phẩm chức năng trong nước cũng như nhập khẩu chưa định lượng riêng cũng như chưa định tính được B. longum trong các chế phẩm có chứa hỗn hợp nhiều vi sinh vật.

Xuất phát từ nhu cầu thực tế và tính cấp thiết về yêu cầu kiểm tra chất lượng của các chế phẩm probiotics, chúng tôi tiến hành đề tài: “Xây dựng quy trình xác định (định tính, định lượng) Bifidobacterium longum trong các chế phẩm probiotics” với các mục tiêu:

- Xây dựng quy trình chuẩn định tính, định lượng B. longum trong các chế phẩm đa thành phần.

- Ứng dụng quy trình đã thiết lập để khảo sát chất lượng của một số chế phẩm probiotics có chứa B. longum đang lưu hành trên thị trường.

(13)

3

CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN

1.1. TỔNG QUAN VỀ PROBIOTICS

1.1.1. Định nghĩa

Hàng ngàn năm trước đây, con người đã biết sử dụng các chế phẩm sữa lên men với mục đích tăng cường sức khỏe. Tuy nhiên, phải đến đầu thế kỷ 19 nhà khoa học người Nga Elie Metchnikoff mới thực sự nghiên cứu về vấn đề này. Từ đó đến nay, lĩnh vực nghiên cứu về probiotics ngày càng được quan tâm và phát triển. Có rất nhiều định nghĩa khác nhau về probiotics, tuy nhiên định nghĩa của tổ chức Nông Lương Liên hiệp quốc và tổ chức Y tế thế giới năm 2002 là được sử dụng rộng rãi phổ biến nhất: “probiotics là những vi sinh vật sống mà khi sử dụng với một lượng thích hợp, sẽ tạo nên những hiệu quả tốt đối với sức khỏe của cơ thể chủ” [32].

1.1.2. Ứng dụng của probiotics trong ngành Dƣợc Probiotics có các tác dụng sau:

- Tiêu diệt hoặc kìm hãm sự phát triển của các vi sinh vật có hại bằng cách tiết ra các chất giống kháng sinh như acidolin, lactocidin và acidophilin. - Sinh ra các vitamin bao gồm niacin, acid folic, biotin, vitamin B6... - Hỗ trợ cho quá trình tiêu hóa, điều chỉnh nồng độ enzym.

- Giảm pH bằng cách sinh ra acid lactic, hydrogen peroxyd... do đó ức chế sự phát triển của các vi sinh vật và nấm có hại.

- Giải độc và bảo vệ niêm mạc ruột: Lactobacillus có khả năng liên kết với các chất độc như kim loại nặng, tế bào ung thư, các vi sinh vật này sẽ chết cùng với chất độc và được loại trừ ra khỏi cơ thể cùng với chất độc dưới dạng chất thải rắn.

- Giảm nồng độ cholesterol.

- Hỗ trợ hấp thu các khoáng chất, đặc biệt là calci do tác dụng làm giảm pH ruột của chúng.

(14)

4

Với những tác dụng trên, Probiotics được sử dụng với mục đích chính là làm cân bằng hệ vi sinh vật đường ruột trong hoặc sau khi điều trị bằng kháng sinh do kháng sinh đã làm thay đổi hệ vi sinh vật trong đường tiêu hóa, giảm số lượng vi sinh vật có lợi và thường gây ỉa chảy, rối loạn tiêu hóa [34]. Ngoài ra, Probiotics còn được sử dụng để điều trị viêm đường tiêu hóa thường gặp ở trẻ sơ sinh do bị nhiễm Rota virus, điều trị tiêu chảy, ung thư ruột kết, đau dạ dày do nhiễm Helicobacteria pylori, bệnh về dị ứng, ngăn cản nhiễm trùng âm đạo do Candida albicans...[3], [6].

1.1.3. Các vi sinh vật thƣờng đƣợc sử dụng trong chế phẩm probiotics

Nếu trước kia sự lựa chọn vi sinh vật cho chế phẩm Probiotics dùng làm thuốc chủ yếu dựa trên kinh nghiệm thì hiện nay, các nhà khoa học đã đưa ra những tiêu chí rất rõ ràng, đó là:

- Có khả năng chịu được pH thấp ở dạ dày và acid mật ở ruột non - Có khả năng bám dính vào niêm mạc đường tiêu hóa

- Không gây bệnh, không sinh độc tố - Có khả năng sống và cư trú trong ruột.

Bốn nhóm vi sinh vật thường được sử dụng trong các chế phẩm probiotics là Lactobacillus, Bifidobacterium, Saccharomyces, Enterococcus. Ngoài ra, còn một số nhóm vi sinh vật khác được sử dụng như Bacillus, Streptococcus… [3], [6], [29].

1.1.4. Tổng quan về tiêu chuẩn chất lƣợng probiotics

Hiện nay trên thế giới có rất nhiều hướng dẫn xây dựng tiêu chuẩn chất lượng của probiotics. Theo khuyến cáo của FAO (2002), tiêu chuẩn chất lượng của các probiotics bao gồm các chỉ tiêu [32]:

- Định danh vi sinh vật: yêu cầu phải định danh đến loài bao gồm cả kiểu hình và kiểu gen

- Các thử nghiệm in vitro về hoạt tính của probiotics: kháng kháng sinh, kháng dịch vị, kháng muối mật

- Các bằng chứng về sự an toàn

(15)

5 - Các yêu cầu về nhãn sản phẩm

Năm 2009, Bộ y tế Canada cũng ban hành chuyên mục về probiotics, trong đó cũng yêu cầu định danh vi sinh vật đến loài bao gồm cả kiểu hình và kiểu gen [10].

Đến năm 2011, Bộ sức khỏe và gia đình cùng với Bộ Công nghệ sinh học của Ấn Độ đã ban hành hướng dẫn đánh giá chất lượng probiotics khá đầy đủ bao gồm 9 chỉ tiêu [16]:

- Định danh vi sinh vật: yêu cầu phải định danh đến loài bao gồm cả kiểu hình và kiểu gen. Trong đó chỉ ra kỹ thuật PCR là kỹ thuật sinh học phân tử để định danh vi sinh vật.

- Các thử nghiệm in vitro về hoạt tính của probiotics: kháng kháng sinh, kháng dịch vị, kháng muối mật

- Các bằng chứng về sự an toàn trên động vật

- Các thử nghiệm về tác dụng của probiotics trên động vật - Các bằng chứng về sự an toàn trên người

- Thử tác dụng trên người - Các yêu cầu về nhãn sản phẩm - Các thử nghiệm xác định liều - Yêu cầu ghi nhãn

- Yêu cầu trong sản xuất và thủ tục đăng ký

Hiện nay Việt Nam chưa có văn bản chính thức nào về việc đánh giá chất lượng của các chế phẩm probiotics. Chỉ có duy nhất TCVN 7849:2008 đưa ra phương pháp đếm L. acidophilus trong sữa và các chế phẩm sữa trên môi trường đặc hiệu [5]. Việc kiểm soát chất lượng mới chỉ dừng lại ở xác định số lượng vi sinh vật, định tính dựa trên kiểu hình, độ nhiễm khuẩn và các chỉ tiêu về dạng bào chế theo tiêu chuẩn nhà sản xuất. Trong rất nhiều trường hợp, tiêu chuẩn chất lượng còn rất sơ sài, đặc biệt chưa định danh được tất cả các vi sinh vật trong chế phẩm.

(16)

6

1.2. TỔNG QUAN VỀ CHI BIFIDOBACTERIUM

1.2.1. Đặc điểm chung của chi Bifidobacterium [30], [33],

Các vi khuẩn thuộc chi Bifidobacterium trước đây thường được gọi là Lactobacillus bifidus và được phân loại thành 29 loài khác nhau. Ngày nay, người ta đã phát hiện ra hơn 33 loài thuộc chi Bifidobacterium, trong số đó có khoảng 12 loài có mặt ở đường tiêu hóa của người.

Bifidobacteria là các trực khuẩn gram dương, kị khí bắt buộc. Chúng thuộc loại vi khuẩn lên men không đồng nhất, không di động và không hình thành bào tử. Bifidobacteria cho phản ứng catalase âm tính, phản ứng indol âm tính và phản ứng fructose–6-phosphate phosphoketolase dương tính. Chúng phát triển ở khoảng nhiệt độ thích hợp từ 37-41oC, không phát triển ở nhiệt độ dưới 20oC và trên 46oC, Tuy

nhiên, có một số loài có thể phát triển ở nhiệt độ trên 46o

C như B. thermacidophilum. Khoảng pH tối ưu cho sự phát triển của Bifidobacteria là 6,5-7,0. Bifidobacteria không phát triển được ở pH dưới 4,5 và trên 8,5 ngoại trừ B. thermacidophilum có thể phát triển được ở pH 4,0.

Các vi khuẩn Bifidobacterium là những vi sinh vật quan trọng trong hệ đường ruột của người và chiếm 3,5 đến 10% hệ sinh vật ở ruột kết. Chúng chiếm ưu thế ở trong phân của trẻ bú mẹ, còn trong phân của trẻ bú bình chúng chiếm khoảng 40% hệ vi sinh vật. Chúng là một trong năm loài chiếm ưu thế trong hệ thống đường tiêu hóa của người, ngoài ra còn được tìm thấy ở âm đạo và khoang miệng. Ngoài ra Bifidobacteria cũng được tìm thấy trong hệ thống đường tiêu hóa của nhiều động vật như bò cái, cừu, lợn, gà, thỏ, chuột và ong mật.

1.2.2. Bifidobacteria với vai trò là probiotics.

Bifidobacteria là những probitics phổ biến và là một phần quan trọng của hệ vi khuẩn trong đường tiêu hóa. Chúng thuộc nhóm vi khuẩn sinh acid lactic (LAB), có khả năng tổng hợp amino acid (acid glutamic và acid aspartic), sản xuất một số vitamin như riboflavin, thiamin, vitamin B2, vitamin B6 và biotin.

(17)

7

Ngoài ra Bifidobacteria còn có khả năng sản xuất bacteriocin (hóa chất kháng khuẩn) và các chất giống kháng sinh do đó chúng rất có lợi đối với hệ thống tiêu hóa và miễn dịch [33].

Tuy nhiên, không giống như các vi khuẩn Lactobacillus, các vi khuẩn Bifidobacterium còn sản sinh ra acid acetic, là acid béo chuỗi ngắn. Acid acetic hạn chế nấm phát triển hiệu quả hơn acid lactic và nó cũng được xem là nguồn năng lượng cho cơ thể. Do tạo ra đồng thời acid acetic và acid lactic cũng như một số chất có ích khác nên các vi khuẩn Bifidobacterium rất cần thiết cho đường âm đạo và đường niệu sinh dục, nơi mà nấm và các vi khuẩn cơ hội có thể gây bệnh, cũng như trong hệ tiêu hóa [36].

Một số lợi khuẩn Bifidobacterium có tác dụng tốt đối với cơ thể người do chúng có thể làm thay đổi hệ miễn dịch. Trong một số trường hợp chúng giúp tăng cường hệ miễn dịch cũng như có tác động chống viêm.

Một số Bifidobacteria hay được dùng trong các chế phẩm thuốc, thực phẩm chức năng với vai trò là probiotics là Bifidobacterium longum, Bifidobacterium infantis, Bifidobacterium bifidum, Bifidobacterium lactis, Bifidobacterium breve…

1.3. TỔNG QUAN VỀ B. LONGUM

1.3.1. Đặc điểm hình thái

B. longum thuộc nhóm vi sinh vật sinh acid lactic và thuộc chi Bifidobacterium.

B. longum là vi khuẩn Gram dương, hình que phân nhánh, kỵ khí bắt buộc, không di động, không sinh bào tử và cho phản ứng catalase âm tính. B. longum tăng trưởng tối ưu ở 38 - 39°C, tối thiểu ở 19-20°C, tối đa ở 44,5-45°C. B. longum tăng trưởng tối ưu ở pH 7-8, không tăng trưởng ở pH 5,0 hoặc 9,5 [12].

(18)

8

Hình 1.1. Hình ảnh B. longum trên kính hiển vi điện tử

1.3.2. Khả năng chuyển hóa carbohydrat [31].

B. longum có khả năng lên men các đường: arabinose, xylose, glucose, fructose, mannose, galactose, maltose, sucrose, lactose, melibiose, raffinose. Sản phẩm cuối cùng của quá trình lên men đường là acid lactic (AL) và acid acetic (AA), với tỷ lệ từ 1,0 (AL): 1,7 (AA) đến 1,0 (AL): 2.0 (AA).

B. longum không lên men các đường: rhamnose, melezitose, cellobiose, trehalose, dextrin, tinh bột, inulin, sorbitol, manitol, glycerol, salicin, gluconate và lactate.

1.3.3. Cấu trúc gen cuả B. longum [24]

Nhiễm sắc thể của B. longum có chiều dài khoảng 2,26 Mb, tỷ lệ Guanine -Cytosine là 65%.

(19)

9 Trong đó:

A: Kích thước gen biểu diễn trên thang Mb

B: Chuỗi mã hóa: gồm 2 sợi bổ sung, các mũi tên chỉ phần chuyển tiếp GC C: Thang G-C

D: Cấu tạo nguyên vẹn genom của B. longum.Vùng hình tròn biểu diễn các rARN operon, hình vuông là vùng gen của prophage, tam giác biểu diễn vị trí của 3 vùng gen giống nhau của B. longum, hình chữ nhật là vùng gen plasmid tích hợp.

1.3.4. Vai trò của B. longum [9], [11], [24], [26] , [15], [33], [35].

B. longum là một loại vi khuẩn rất cần thiết với cơ thể con người, thường gặp ở ruột và âm đạo do nó có vai trò quan trọng trong việc giữ cho hệ tiêu hóa và hệ miễn dịch con người khỏe mạnh. B. longum đặc biệt quan trọng đối với trẻ sơ sinh do nó giúp tăng cường hệ miễn dịch của trẻ sơ sinh. B. longum có nhiều ở trong hệ tiêu hóa của trẻ sơ sinh và chiếm ưu thế hơn ở trẻ bú mẹ so với trẻ bú bình. Một điều dễ thấy là trẻ bú mẹ ít bị tiêu chảy và dị ứng hơn so với trẻ bú bình. Ở người lớn, B. longum giữ cho hệ thống miễn dịch khỏe mạnh, hỗ trợ cân bằng vi khuẩn đường ruột và có thể ngăn ngừa ung thư như ung thư ruột kết. B. longum sản sinh acid lactic, do vậy làm giảm nguy cơ viêm âm đạo.

Một nghiên cứu liên quan đến giảm cân, béo phì và táo bón chỉ ra rằng những người sử dụng B. longum đạt được kết quả giảm cân và cải thiện táo bón tốt hơn so với những người dùng thuốc nhuận tràng [11].

Một nghiên cứu khác hiện được thực hiện tại Nhật Bản nhằm xác định liệu B. longum có thể được sử dụng như là vector chuyển gen để điều trị ung thư hay không. Tiến hành thực nghiệm trên chuột cho thấy B. longum có thể xâm nhập vào khối u và tích lũy trong khối u. Đây là một nghiên cứu rất tích cực và hy vọng nó sẽ giúp cho các nhà nghiên cứu tìm ra cách mới để đưa thuốc trực tiếp vào khối u [15]. Do có vai trò rất quan trọng đối với sức khỏe con người nên B. longum được sử dụng rộng rãi trong các chế phẩm thuốc, thực phẩm chức năng, sữa...

(20)

10

1.3.5. Phƣơng pháp kiểm nghiệm B. longum trong chế phẩm probiotics 1.3.5.1. Phương pháp định lượng vi sinh vật trong chế phẩm [14], [19], [21].

a. Phương pháp đếm trên đĩa thạch

Phương pháp đếm trên đĩa thạch được sử dụng nhiều nhất để định lượng B. longum trong chế phẩm Probiotics do có độ chính xác cao, đơn giản, dễ thực hiện ở quy mô phòng thí nghiệm, đồng thời có thể định lượng riêng được B. longum trong hỗn hợp. Vi sinh vật trong chế phẩm ban đầu được pha loãng đến nồng độ thích hợp, sau đó được cấy trộn vào môi trường dinh dưỡng trong đĩa petri và nuôi cấy ở nhiệt độ, thời gian thích hợp. Sau thời gian nuôi cấy, đếm số khuẩn lạc và tính số lượng vi sinh vật có trong chế phẩm ban đầu

Tuy nhiên, nhược điểm của phương pháp này là tốn thời gian nuôi cấy, khó khăn trong việc lựa chọn môi trường đặc hiệu cho vi sinh vật cần định lượng trong hỗn hợp gồm nhiều vi sinh vật khác nhau.

b. Định lượng bằng phương pháp real-time PCR

Real-time PCR là một trong những kỹ thuật cho phép định lượng chính xác nhất số lượng trình tự DNA trong một mẫu thí nghiệm. Khác với việc định lượng khi quá trình khuếch đại đã hoàn tất, kỹ thuật này cho phép kiểm soát và định lượng số lượng DNA ngay cả khi phản ứng đang xảy ra. Trong kỹ thuật này, ở mỗi chu kỳ, lượng DNA được khuếch đại sẽ phát ra một lượng tín hiệu huỳnh quang nhất định. Nói cách khác, lượng tín hiệu huỳnh quang sẽ tăng tỉ lệ thuận với mỗi chu kỳ khuếch đại thành công của phản ứng real-time PCR. Như vậy bằng cách ghi nhận lượng tín hiệu huỳnh quang phát ra sau mỗi chu kỳ, ta có thể kiểm soát phản ứng PCR ngay trong giai đoạn khuếch đại tuyến tính của chúng. Và sự gia tăng đầu tiên của tín hiệu huỳnh quang sẽ tương ứng với lượng DNA ban đầu của mẫu

Trong phản ứng real-time PCR, người ta thường sử dụng hai tác nhân phát huỳnh quang bao gồm tác nhân gắn vào DNA mạch đôi (Ethidium Bromide, SYBR Green, EvaGreen...) hoặc tác nhân dùng đánh dấu mẫu dò đặc hiệu (FAM, HEX ...).

Tác nhân liên kết với mạch đôi DNA. Trong phản ứng, khi có sự hiện diện của các sản phẩm DNA mạch đôi do quá trình nhân bản thì các tác nhân liên kết với DNA mạch đôi như SYBR Green sẽ liên kết với các sản phẩm vừa được tạo ra này

(21)

11

và phát tín hiệu huỳnh quang mạnh mẽ hơn (so với trạng thái tự do trong dung dịch). Loại tác nhân huỳnh quang này có thể sử dụng được cho mọi trình tự đích nên chi phí sẽ thấp; nhưng độ đặc hiệu của sản phẩm phải được kiểm tra chặt chẽ thông qua một bước phân tích bổ sung sau khi phản ứng nhân bản kết thúc – phân tích đường cong nóng chảy (Melting curve analysis).

Tác nhân dùng đánh dấu mẫu dò đặc hiệu rất đa dạng như FAM, TAMRA, Texas Red, Cy3, Cy5… được sử dụng với nhiều loại mẫu dò khác nhau như mẫu dò lai, mẫu dò thủy giải, mẫu dò dạng kẹp tóc.

Khi sử dụng với các mẫu dò khác nhau, cường độ tín hiệu huỳnh quang đều tỉ lệ thuận với hàm lượng sản phẩm đích đang được nhân bản trong phản ứng. Các tín hiệu huỳnh quang phát ra sẽ được các đầu dò của máy luân nhiệt real-time PCR thu nhận và xử lý. Khi cường độ tín hiệu huỳnh quang của mẫu vượt qua đường tín hiệu huỳnh quang nền (base line) của phản ứng thì mẫu được xem là dương tính và người ta lấy thời điểm vượt qua đó (biểu hiện qua giá trị chu kỳ ngưỡng – Ct, Cycle Threshhold) để so sánh với một đường cong chuẩn (standard curve) đã biết để suy ra nồng độ trình tự DNA đích trong mẫu thử nghiệm ban đầu. Đường cong chuẩn được xây dựng từ chu kỳ ngưỡng của các mẫu chuẩn có chứa sản phẩm đích đã biết trước nồng độ.

c. Phương pháp lai huỳnh quang tại chỗ (FISH-fluorescent insitu hybridization).

FISH dò tìm và phát hiện ra các trình tự acid nucleic của vi sinh vật cần định lượng bằng cách dùng đầu dò được đánh dấu huỳnh quang lai đặc hiệu với các trình tự đặc hiệu bổ sung với nó bên trong tế bào nguyên vẹn (không cần phá vỡ tế bào) Quy trình thực hiện bao gồm các bước:

- Chuẩn bị mẫu và đầu đò - Cố định mẫu

- Lai giữa đầu dò và trình tự đích đặc hiệu nằm trong tế bào - Rửa mẫu để loại bỏ các đầu dò không được lai

- Dò tìm mẫu (bước này có thể bỏ qua nếu sử dụng đầu dò phát huỳnh quang trực tiếp)

(22)

12

- Quan sát, hiển thị và lưu trữ kết quả bằng kính hiển vi quét laze đồng tiêu hoặc kính hiển vi gắn thêm bộ lọc dải hẹp nhiều tần cùng với một máy ảnh và phần mềm xử lí hình ảnh.

Các đầu dò thường được sử dụng là các oligonucleotide rRNA 16S để đảm bảo sự liên kết bổ sung đạt hiệu quả cao nhất trong quá trình lai.

Đầu dò thường được đánh dấu bằng cách gắn trực tiếp chất nhuộm huỳnh quang lên đầu dò hoặc kết hợp đầu dò với một số chất chỉ thị như Digoxygenin, sau đó chúng sẽ được dò tìm thông qua một chất phản huỳnh quang

Ưu điểm của 2 phương pháp Realtime PCR và FISH là nhanh, cho độ chính xác cao. Tuy nhiên nhược điểm là đòi hỏi đầu tư thiết bị đắt tiền, yêu cầu trình độ kỹ thuật cao và không phân biệt được vi khuẩn sống hay vi khuẩn chết.

1.3.5.2. Định danh

a. Định danh kiểu hình

Dựa theo khóa phân loại được công nhận quốc tế: Dựa vào đặc điểm hình thái, phản ứng sinh hóa. Để tiến hành kiểm tra các đặc điểm sinh hóa thì phương pháp sử dụng phổ biến hiện nay là sử dụng các kit sinh hóa có sẵn (Ví dụ Api kit của hãng BioMerieux-Pháp). Để định danh vi sinh vật thuộc chi Bifidobacterium có thể sử dụng kit API 20A hoặc Rapid ID 32A.

b. Định danh kiểu gen.

Để định danh đến loài, kỹ thuật phổ biến được sử dụng hiện nay là kỹ thuật nhân gen và giải trình tự

Kỹ thuật này bao gồm các bước:

Tách chiết DNA của vi sinh vật nghiên cứu: Thành tế bào vi sinh vật được phá vỡ nhờ lysozyme và các chất tẩy rửa mạnh như SDS-tris-hydroclorid giúp giải phóng toàn bộ DNA của vi sinh vật. Protein và RNA được tách khỏi DNA nhờ các enzym RNAse, protease và isopropanol. Cuối cùng DNA được tủa bằng ethanol tuyệt đối.

Tiến hành phản ứng PCR: Với việc sử dụng DNA polymerase và các oligonucleotid tổng hợp nhân tạo, một đoạn DNA dùng làm khuôn được nhân lên nhanh chóng với số bản sao gấp hàng tỉ lần mà không cần đến

(23)

13

nhiều tế bào vi sinh vật. Nhờ phản ứng này, một đoạn gen bất kì sẽ được khuếch đại khi biết trình tự của hai điểm từ đầu 5’ đến đầu 3’ của sợi bổ sung và nhờ có enzym DNA polymerase mà DNA khuôn được tổng hợp khi đã có sẵn dNTP.

Kiểm tra sản phẩm bằng điện di trên gel agarose. Phân tích trình tự 16S rDNA theo phương pháp Sanger. Cuối cùng, chuỗi trình tự này được so sánh với tất cả các chuỗi nucleotid 16S rDNA đã được công bố trên ngân hàng gen quốc tế và từ đó đưa ra kết luận chính xác tên của vi sinh vật. Phương pháp này có độ chính xác rất cao. Cho đến nay, các chuyên gia phân loại vi sinh vật trên thế giới đều cho rằng phương pháp tốt nhất để định danh vi sinh vật và thành lập cây phát sinh chủng là dựa trên trình tự rDNA kết hợp với phương pháp phân loại kinh điển. Tuy nhiên, phương pháp này đòi hỏi đầu tư trang thiết bị rất lớn mà không phải phòng thí nghiệm nào cũng có khả năng trang bị được.

- Kỹ thuật nhân gen PCR (Polymerase Chain Reaction) [8].

PCR là một kỹ thuật được sử dụng phổ biến trong công nghệ sinh học hiện đại và đã đóng góp rất lớn cho những tiến bộ về sinh học phân tử.

PCR dựa trên cơ sở phản ứng kéo dài primer nhờ enzym Taq DNA polymerase để khuếch đại in vitro các acid nucleic đặc hiệu trong thiết bị điều nhiệt tuần hoàn (thermocycler) hay còn gọi là máy PCR. PCR cho phép khuếch đại theo hàm mũ lên đến hàng triệu lần các đoạn DNA có chiều dài từ 200- 3000 bp. Đoạn DNA được khuếch đại (DNA đích) được nhận dạng nhờ cặp primer đặc hiệu (oligonucleotid) thường có chiều dài khoảng 20 nucleotide.

Taq DNA polymerase là một loại enzym DNA polymerase chịu nhiệt (có ở vi khuẩn chịu nhiệt cao Thermus aquaticus), được dùng để tổng hợp các đoạn DNA mới trong môi trường có bốn loại deoxyribonucleotid (dATP, dCTP, dGTP và dTTP) và hai primer, trên cơ sở khuôn mẫu của một đoạn DNA nhất định đã biết hoặc chưa biết trình tự. Các đoạn DNA mới hình thành lại được sử dụng làm khuôn mẫu. Sau nhiều chu kì, số lượng đoạn DNA nói trên được nhân lên gấp nhiều lần, nhờ vậy có thể đủ số lượng để tách ra, phân tích trình tự hoặc tạo dòng...

(24)

14

Nguyên tắc của phản ứng khuếch đại gen được trình bày tổng quát trong Hình 1.3 và Hình 1.4

Hình 1.3. Sơ đồ phản ứng chuỗi polymerase

(25)

15

Nguyên tắc của PCR được trình bày trong Hình 1.3 và Hình 1.4. Theo đó, từ chu kỳ thứ hai, Taq polymerase (Taq pol) bắt đầu tạo ra các đoạn DNA có chiều dài xác định. Các primer thường là một oligonucleotid tổng hợp, có khoảng 10 - 20 nucleotid hoặc hơn. Nếu biết trình tự của đoạn gen cần khuếch đại thì có thể tổng hợp nhân tạo các primer tương ứng để thực hiện PCR và tách chúng ra bằng kỹ thuật điện di. Trong kỹ thuật PCR người ta thường tiến hành khoảng 25 - 35 chu kỳ. Mỗi chu kỳ PCR bao gồm ba bước có nhiệt độ khác nhau (xem hình vẽ minh hoạ): Bước 1 là biến tính DNA (ở 90- 95oC), có tác dụng tách hai sợi đơn từ sợi khuôn

xoắn kép. Bước 2 là bắt cặp hai mồi vào hai sợi đơn của khuôn (ở 40-65oC). Bước 3

là kéo dài chuỗi theo mồi, (ở nhiệt độ 70-72o

C)chiều 5’-3’ với quá trình trùng hợp gắn các dNTP dọc theo sợi khuôn để tạo thành phiên bản mới theo nguyên tắc bổ sung. Tính đặc hiệu của phản ứng được quy định bởi mồi và sự sao chép trực tiếp theo trình tự sợi khuôn giữa hai mồi. Như vậy, kết quả tạo ra hàng triệu phiên bản sợi khuôn trong vài giờ.

- Điện di DNA trên gel agarose

Nguyên lý điện di: các phân tử DNA là các polyanion nên trong môi trường trung tính và kiềm, dưới tác dụng của điện trường, chúng sẽ di chuyển về cực dương. Mức độ di chuyển của các phân tử DNA trong điện trường phụ thuộc chủ yếu vào kích thước (hay khối lượng phân tử) của chúng. Phân tử có kích thước nhỏ sẽ di chuyển nhanh còn phân tử có kích thước lớn sẽ di chuyển chậm. Sử dụng thang chuẩn DNA với kích thước đã biết có thể dễ dàng xác định được kích thước tương đối của DNA mẫu.

Tiến hành: chuẩn bị gel agarose X%, tiến hành tra mẫu gồm 10 l mẫu DNA được trộn với 2 l đệm mầu (có chứa: glycerol 20%, chất chỉ thị màu bromophenol xanh, xylene cyanol) và tra vào các giếng trên gel. Chạy điện di với hiệu điện thế ổn định là 10 volt/cm gel đến khi vạch màu bromophenol xanh cách mép gel khoảng 2 cm thì dừng lại. Nhuộm bản gel trong dung dịch ethidium bromide (EtBr) ở nồng độ 50 g/ l trong 15-30 phút. Sau đó, gel được lấy ra và soi dưới ánh sáng tử ngoại của máy soi chụp gel, các băng gắn với EtBr xuất hiện dưới dạng các băng màu sáng trên nền gel màu đen.

(26)

16 - Nhân dòng

Nhân dòng là sự tách lập và thu nhận nhiều bản sao đồng nhất của một gen hay của một mảnh đoạn DNA.

Nguyên tắc:

Kỹ thuật nhân dòng bao gồm việc phải cài một mảnh (chuỗi) DNA lạ vào một vector (plasmide hoặc phage λ) bằng phương pháp hóa sinh. Sau đó, đưa phân tử lai nay vào tế bào chủ đã chọn lựa bằng phương pháp biến nạp hoặc tải nạp. Trường hợp muốn tạo dòng tổng hợp enzym thì mảnh DNA định cài phải mã hóa cho gen cấu trúc của một enzyme nào đó.

+ Các bước cơ bản của phương pháp nhân dòng: Tách lập các DNA lạ cần nhân dòng:

Chọn và xử lý vector nhân dòng

Tạo DNA tái tổ hợp (vector tái tổ hợp).

Chuyển DNA tái tổ hợp vào tế bào chủ bằng phương pháp biến nạp hoặc tải nạp.

Phát hiện dòng cần tìm

Kiểm tra thu nhận sản phẩm của gen tái tổ hợp. - Giải trình tự

Phương pháp chính xác và đưa lại nhiều thông tin nhất cho định danh và định typ vi sinh vật là xác định chính xác trình tự chuỗi DNA của một vùng quy định trên nhiễm sắc thể. Phương pháp giải trình tự DNA phát triển nhanh chóng, kết quả so sánh sự tương đồng của trình tự gen nghiên cứu trở thành phương pháp phân loại chuẩn theo sinh học phân tử trong nghiên cứu hệ thống học và cây phả hệ di truyền giữa các đối tượng nghiên cứu. Các gen bảo thủ được giải trình tự làm cơ sở để xác định vị trí của sinh vật nghiên cứu, trong khi đó các trình tự không tương đồng (khác biệt) lại làm cơ sở cho sự biệt hóa cũng như xác định mối quan hệ giữa các cá thể gần với nhau.

Từ những năm 1977 một số phương pháp giải trình tự gen đã được phát minh như phương pháp giải trình tự gen theo phương pháp hóa học (Alan

(27)

17

Maxam và Walter Gilbert), phương pháp giải trình tự gen bằng enzyme (do Frederick Sanger và cộng sự )

Cả hai phương pháp này đã đánh dấu bước ngoặt lớn trong lịch sử phát triển của bộ môn sinh học hiện đại. Ngày nay, rất nhiều máy giải trình tự gen tự động đều dựa trên nguyên tắc chính là phương pháp giải trình tự gen của Sanger.

Phương pháp này dựa vào sự tổng hợp mạch bổ sung cho trình tự cần xác định nhờ DNA polymerase. Với việc sử dụng thêm các dideoxynucleotide cùng với các deoxynucleotid thông thường, kết quả tổng hợp cũng là sự hình thành một tập hợp nhiều đoạn DNA có kích thước khác nhau.

Các phân đoạn DNA sẽ được phân tách bằng điện di trên gel polyacrylamid có khả năng phân tách hai trình tự DNA chỉ chênh nhau một nucleotid. Với việc sử dụng một loại nucleotide có đánh dấu đồng vị phóng xạ, kết quả trình tự DNA cần xác định được đọc trên bản phóng xạ tự ghi từ bản điện di.

Để thực hiện được giải trình tự bằng máy tự động thì các mạch DNA đơn sản sinh trong ống phản ứng giải trình tự phải được đánh dấu huỳnh quang để các vạch điện di của các mạch đơn này phát sáng khi đi qua một chùm tia sáng laser. Nguyên tắc hoạt động của máy là trong suốt quá trình điện di, mỗi khi có một vạch điện di đi qua chùm tia laser thì vạch điện di sẽ phát sáng lên và sự phát sáng này sẽ được con mắt cản quang ghi nhận và lưu lại thành một đỉnh cường độ sáng trong biểu đồ. Từ biểu đồ của các đỉnh cường độ sáng này, máy sẽ so dòng của các đỉnh tương ứng với các màu để cuối cùng phân tích thành trình tự của đoạn DNA.

1.3.6. Tình hình nghiên cứu định tính và định lƣợng B. longum trong các chế phẩm probiotics trong những năm gần đây

- Trên thế giới

Phương pháp định lượng B. longum phổ biến vẫn là phương pháp đếm trên đĩa thạch. Bên cạnh đó các nhà khoa học đã nghiên cứu thêm một số phương pháp mới đó là phương pháp FISH, phương pháp real-time PCR và kỹ thuật nhuộm huỳnh quang.

(28)

18

Để định lượng B. longum trong các chế phẩm gồm nhiều vi sinh vật bằng phương pháp đếm trên đĩa thạch, việc khó khăn nhất là lựa chọn được môi trường phù hợp. Môi trường này phải đáp ứng yêu cầu là khuyến khích sự phát triển của B. longum và ức chế hoàn toàn sự phát triển của các vi sinh vật còn lại trong hỗn hợp. Để đạt được yêu cầu này, người ta thường dựa vào khả năng nhạy cảm hoặc kháng lại kháng sinh của vi sinh vật trong hỗn hợp. Do đó người ta sẽ thêm vào môi trường cơ bản ban đầu một hoặc nhiều kháng sinh khác nhau với mục đích là các kháng sinh này sẽ ức chế các vi sinh vật khác trong hỗn hợp, sẽ định lượng và phân lập riêng được vi sinh vật cần nghiên cứu là vi sinh vật đề kháng lại các kháng sinh đã thêm vào môi trường. Dựa trên nhiều công trình nghiên cứu của nhiều tác giả, Janet E.L.Corry và cộng sự đã tổng quan lại một số môi trường để định lượng Bifidobacteria trong chương 10 cuả quyển “Handbook of culture Media for Food and Water Microbiology, 3rd edition” [19]. Theo đó việc lựa chọn môi trường để định lượng tùy thuộc vào sự có mặt của những vi sinh vật nào trong hỗn hợp cần định lượng, từ đó cho phép định lượng riêng được từng vi sinh vật trong hỗn hợp.

Để định danh B. longum trong hỗn hợp, phương pháp phổ biến thường được dùng là định danh bằng kỹ thuật PCR [27], [22].

- Trong nước

Hiện nay, thị trường thuốc Việt Nam có rất nhiều thuốc và thực phẩm chức năng có chứa B. longum như LACTIBIO (Công ty TNHH DP UNIVN), LAZEBIO (Công ty INTECHPHARM), LACCLEAN GOLD (Cell Biotech CO, Ltd), YBIOPLUS (Công ty Dược Hậu Giang), Safikid BIO (Học viện Quân Y), L-Bio-3D (Công ty Liên Doanh Dược phẩm Mebiphar Austrapharm)…

Tuy nhiên chưa có nghiên cứu nào về việc định lượng và phân lập riêng B. longum trong thuốc và thực phẩm chức năng. Việc định lượng chỉ dừng lại ở định lượng hỗn hợp vi sinh vật trong chế phẩm. Đồng thời việc định danh B. longum cũng chưa được nghiên cứu thấu đáo. Trong một số tiêu chuẩn cơ sở của các nhà sản xuất trong nước đã sử dụng kít Api 20A để định danh B. longum trong chế phẩm [1], [2]. Tuy nhiên, việc sử dụng kit Api 20A mới chỉ cho phép định danh đến chi Bifidobacterium, đồng thời các tiêu chuẩn này cũng chưa chỉ ra được cách phân

(29)

19

lập khuẩn lạc thuần khiết để tiến hành phản ứng sinh hóa. Điều này sẽ dễ gây ra sai số trong việc định danh. Chưa có công trình nghiên cứu nào ứng dụng kỹ thuật nhân gen và giải trình tự để định danh B. longum.

Do đó hướng nghiên cứu của đề tài này là nghiên cứu lựa chọn môi trường đặc hiệu để định lượng riêng được B. longum trong hỗn hợp, từ đó phân lập được khuẩn lạc thuần khiết để định tính bằng kít sinh hóa và định danh bằng kỹ thuật sinh học phân tử. Thẩm định qui trình đã thiết lập để áp dụng vào việc kiểm nghiệm B. longum trong một số chế phẩm thuốc và thực phẩm chức năng lưu hành trên thị trường Việt Nam.

(30)

20

CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG, NGUYÊN VẬT LIỆU,

TRANG THIẾT BỊ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1. PHƢƠNG TIỆN DÙNG TRONG NGHIÊN CỨU

2.1.1. Môi trƣờng, hoá chất, dung môi, thiết bị

2.1.1.1. Môi trường

- Môi trường BSM đặc (Fluka) lô BCBK6505V.

Hỗn hợp kháng sinh để thêm vào môi trường BSM đặc, lô BCBK 1651V - Môi trường MRS đặc (Merck)

Công thức

Pepton 10,0g

Cao thịt 8,0g Cao men bia 4,0g

Glucose 20,0g Dikali hydrophosphat 2,0g Tween 80 1,0g Amoni citrat 2,0g Natri acetat 5,0g Mangan sulfat 0,04g Magnesi sulfat 0,2g Thạch 14,0g Nước cất vừa đủ 1000ml pH sau khi tiệt trùng: 5,7 ± 0,2

- Môi trường MRS lỏng (Merck) có công thức giống môi trường MRS đặc chỉ khác là không có thạch.

(31)

21

- Môi trường API 20A (BioMérieux, Pháp): Ống 4ml. Số lô: 1002717340. Hạn dùng: 5/5/2015

Công thức

Trypticase 5,0g

Cao men bia 5,0g Natri clorid 2,5g L-tryptophan 0,2g L-cystine 0,4g Hemin 0,005g Vitamin K1 0,01g Natri sulfit 0,1g Nước cất vừa đủ 1000ml pH sau khi tiệt trùng: 6,9 – 7,3. - Môi trường thạch máu Công thức Pepton 10,0g Natri clorid 5,0g Cao thịt 2,5g Thạch 20,0g Nước cất vừa đủ 1000ml pH sau khi tiệt trùng: 7,4 – 7,6

(32)

22

2.1.1.2. Hoá chất, dung môi

- Hóa chất, dung môi được ghi ở Bảng 2.1 và Bảng 2.2 Bảng 2.1. Mồi đặc hiệu

Loài Tên mồi Số lô Hãng sản xuất

Đoạn 16S rDNA ID16R08F 208918A07 Invitrogen IDL16R09R 208918A08 B. longum BlonF 208918B05 Invitrogen BlonR 208918B05

VectorpGemT easy nguyên bản

Promega

Bảng 2.2. Hóa chất, dung môi

Tên Số lô Hãng sản xuất

Lysozym 061M13281V Sigma-Aldorich WizardR Genomic DNA

Purification Kit

297885 Promega

Taq DNA polymerase 1130853 Life technologies dNTPs (100mM) 1139131 Life technologies Thang DNA chuẩn 668361 Invitrogen DNA loading Dye (6X) 00056239 Fermentas Đệm PCR – MgCl2 (10X) 1113366 Invitrogen

Nước cất siêu tinh khiết 764952 Invitrogen Agarose siêu tinh khiết 0000144547 Invitrogen Tris siêu tinh khiết 90920S196 Biobasic Inc

EDTA, free acid 1004SHLS0125B0210J Biobasic Inc Kit API 20A 1002998430 BioMérieux Thuốc thử BCP 1003101450 BioMérieux

Thuốc thử XYL Merck

(33)

23

- Độ đục chuẩn McFarland số 2: Hút chính xác 2,0ml dung dịch bari clorid 1,0% vào bình định mức dung tích 100ml và pha loãng bằng dung dịch acid sulfuric 1,0% vừa đủ đến vạch, trộn đều.

- Độ đục chuẩn McFarland số 3: Hút chính xác 3,0ml dung dịch bari clorid 1,0% vào bình định mức dung tích 100ml và pha loãng bằng dung dịch acid sulfuric 1,0% vừa đủ đến vạch, trộn đều.

Đo độ hấp thụ của các độ đục chuẩn ở bước sóng 600nm, cốc đo dày 1cm, sử dụng dung dịch acid sulfuric 1,0% làm mẫu trắng thì độ hấp thụ của độ đục chuẩn số 2 khoảng 0,451, độ hấp thụ của độ đục chuẩn số 3 khoảng 0,582. Độ đục chuẩn chỉ dùng trong vòng 3 tháng kể từ ngày pha.

2.1.1.3. Thiết bị, dụng cụ

a. Thiết bị.

Được hiệu chuẩn theo ISO/IEC-17025 và GLP. - Buồng thổi khí sạch Kebo (Thuỵ Điển). - Tủ ấm CO2 T 305-F (Thuỵ Điển)

- Tủ sấy Memmert ULE 600 (Đức) - Nồi hấp Tomy SS-325 (Nhật)

- Cân kĩ thuật điện tử Sartorius TE 412, độ chính xác 0,01g (Đức) - Máy quang phổ tử ngoại khả kiến Shimadzu (Nhật Bản)

- Tủ lạnh sâu Kebo 2951 (Thuỵ Điển) - Máy li tâm lạnh Mikro-200R (Đức) - Máy điện di gel XL-ULTRA-V-2 (Mỹ) - Máy chụp ảnh gel UVDI- 312 (Đài Loan)

- Máy khuyếch đại gen RealTime Step one Plus (Singapore) - Máy lắc trộn Vortex Genie 2 (Mỹ)

- Đèn soi UV ở bước sóng 365nm b. Dụng cụ

Các dụng cụ thuỷ tinh như pipet, bình định mức, bình nón... Class A. Micropipet (Eppendorf - Đức) 10 l, 100 l 1000 l, 5ml và 10ml. Ống nhựa 1,5ml, 2,0ml; ống thủy tinh kích thước 16x120mm.

(34)

24

2.1.2. Phần mềm xử lý kết quả: Apiweb của hãng BioMérieux.

2.1.3. Chủng vi sinh vật chuẩn

Các chủng vi sinh vật chuẩn được sử dụng trong đề tài này được trình bày ở Bảng 2.3 Bảng 2.3. Các vi sinh vật chuẩn được sử dụng TT Tên chủng Kí hiệu TT Tên chủng Kí hiệu 1 Bacillus cereus ATCC 11778 11 Lactobacillus rhamnosus ATCC 9595 2 Bacillus pumilus ATCC 14884 12 Bifidobacterium breve ATCC 15700 3 Bacillus stearothermo philis ATCC 795 13 Bifidobacterium bifidum ATCC 11863 4 Bacillus subtilis ATCC 6333 14 Streptococcus faecalis ATCC 33186 5 Lactobacillus acidophilus ATCC 4356 15 Streptococcus pyogenes ATCC 19615 6 Lactobacillus leichmannii ATCC 7830 16 Pseudomonas aeruginosa ATCC 9027 7 Bacilus coagulans

ATCC 7050 17 Escherichia coli ATCC 8739 8 Lactobacillus casei ATCC 334 18 Staphylococcus aureus ATCC653 8 9 Lactobacillus fermentum ATCC 9338 19 Streptococcus thermophilus ATCC 19258 10 Lactobacillus plantarum ATCC 8014 20 Bifidobacterium longum JCM 1217

(35)

25

2.2. ĐỐI TƢỢNG NGHIÊN CỨU

Là một số chế phẩm probiotics trên thị trường - Gói bột SamubioTHYMO (kí hiệu mẫu A)

Công ty sản xuất: Công ty cổ phần Dược, vật tư y tế Hải Dương Số đăng kí: 12735/2011/YT-CNTC

Số lô: 010112. Hạn dùng: 300115 Công thức: Mỗi gói 3g bột chứa

+ Lactobacillus acidophilus ≥108CFU + Bifidobacterium longum ≥108CFU + Streptococcus faecalis ≥108CFU - Gói bột safikid BIO (kí hiệu mẫu B)

Công ty sản xuất: Trung tâm nghiên cứu ứng dụng sản xuất thực phẩm chức năng- Học viện Quân Y.

Số đăng kí: 1757/2010/YT-CNTC Số lô: 1113. Hạn dùng: 11/2015 Công thức: Mỗi gói 3g bột chứa

+ Lactobacillus acidophilus ≥108CFU + Bifidobacterium longum ≥108CFU + Streptococcus thermophilus ≥108CFU - Gói bột L-Bio-3D (ký hiệu mẫu C)

Công ty sản xuất: Công ty liên doanh dược phẩm MEBIPHAR-AUSTRAPHARM

Số đăng kí: QLSP -0746-13

Số lô: 061213. Hạn dùng: 25/12/2015

Công thức: Mỗi gói 1g bột chứa hỗn hợp các vi khuẩn sinh acid lactic ≥108

CFU

+ Lactobacillus acidophilus + Bifidobacterium longum + Lactobacillus rhamnosus - Gói bột Lackid (Ký hiệu mẫu D)

(36)

26 Công ty sản xuất: Novarex, Hàn Quốc Số đăng kí: 3056/2013/ATTP - XNCB Số lô: 4002. Hạn dùng: 08.04.2017

Công thức: Mỗi gói 3g bột chứa hỗn hợp các vi khuẩn sinh acid lactic ≥108CFU + Lactobacillus acidophilus + Lactobacillus rhamnosus + Lactobacillus plantarum + Bifidobacterium longum + Streptococcus faecalis

- Gói bột Probiotics Lactomin plus (ký hiệu mẫu E) Công ty sản xuất: Novarex, Hàn Quốc

Số đăng kí: 1160/2014/XNQC - ATTP Số lô: 4002. Hạn dùng: 04.02.2017

Công thức: Mỗi gói 3g bột chứa hỗn hợp các vi khuẩn sinh acid lactic ≥108 CFU + Lactobacillus acidophilus + Bifidobacterium longum + Streptococcus faecalis

2.3. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.3.1. Phƣơng pháp định lƣợng B. longum trong chế phẩm

Sử dụng phương pháp đếm trên đĩa thạch. Trên cơ sở tham khảo các công trình nghiên cứu có liên quan, chúng tôi lựa chọn môi trường BSM agar để định lượng B. longum trong hỗn hợp [19], [25].

Chuẩn bị hỗn dịch thử: Cân và xác định khối lượng trung bình của 20 gói chế phẩm. Cân chính xác khoảng 10,0g bột thuốc vào bình nón vô trùng, thêm dung môi pha loãng với thể tích tính theo mililit bằng 9 lần khối lượng bột thuốc đã cân và vài viên bi thuỷ tinh vô trùng. Lắc mạnh trong 30 phút để vi sinh vật phân tán đều trong dung dịch, thu được hỗn dịch có độ pha loãng 10-1. Lấy 1000 l hỗn dịch trên cho

(37)

27

vào ống nghiệm đã chứa sẵn 9,0ml dung môi pha loãng, lắc đều bằng máy lắc trộn Vortex được hỗn dịch có độ pha loãng 10-2. Tiếp tục pha loãng 10 lần như trên để

thu được hỗn dịch có có độ pha loãng 10-5, 10-6 và 10-7.

Tiến hành: Chuẩn bị ba đĩa petri vô trùng, chuyển vào mỗi đĩa chính xác 1000 l hỗn dịch có độ pha loãng 10-5. Tiếp tục làm như trên với hỗn dịch có độ pha loãng 10-6 và 10-7. Cấy trộn với môi trường BSM đặc (đã được tiệt trùng và để nguội xuống khoảng 45oC), để môi trường trong đĩa đông tự nhiên. Lật ngược đĩa petri và

ủ ở 37 1oC trong 48 - 72 giờ trong điều kiện kị khí. Sau thời gian ủ, đếm số lượng

khuẩn lạc trong các đĩa petri (chỉ đếm các đĩa petri có số khuẩn lạc nằm trong khoảng 25 - 250).

Tính kết quả: Số lượng vi sinh vật trong 1 gói chế phẩm được tính theo công thức:

A = nTB d MTB Trong đó:

A : số lượng vi sinh vật trong 1 gói chế phẩm (CFU/gói), nTB : số lượng khuẩn lạc trung bình trong 3 đĩa petri (CFU),

MTB : khối lượng trung bình của bột thuốc trong gói chế phẩm (g/gói),

d : hệ số pha loãng của hỗn dịch thử.

2.3.2. Phƣơng pháp định danh vi sinh vật bằng kit API 20A

2.3.2.1. Nguyên tắc chung

Kit API 20A là một hệ thống đã được tiêu chuẩn hóa của hãng BioMérieux (Pháp). Kit API 20A được dùng cùng với môi trường API 20A để định danh vi sinh vật kị khí, trong đó có chi Bifidobacterium.

Kit API 20A gồm 20 giếng chứa các chất nền khác nhau. Vi sinh vật cần xác định sẽ được cấy vào môi trường API 20A và nhỏ môi trường đã có vi sinh vật vào từng giếng, lúc này các chất nền trong giếng sẽ được hoà tan vào trong môi trường. Trong quá trình nuôi cấy sản phẩm chuyển hóa nếu có sẽ tự làm thay đổi màu môi trường hoặc thay đổi màu sau khi thêm thuốc thử. Tên của các chất nền sẽ được đề cập đến trong mục 2.3.2.2 13 .

(38)

28

2.3.2.2. Tiến hành

Sau khi nuôi cấy vi sinh vật như mô tả trong mục định lượng 2.3.1, lựa chọn một khuẩn lạc đặc trưng, tách biệt và cấy chuyển sang 5,0ml môi trường MRS lỏng, có bổ sung khoảng 0,5ml dầu khoáng ở lớp bề mặt và ủ trong điều kiện kị khí ở 37

1oC trong 24 giờ.

a. Nhuộm Gram: Tiến hành nhuộm tế bào theo phương pháp nhuộm Gram và soi dưới kính hiển vi với vật kính dầu có độ phóng đại 1000 lần.

Nếu vi sinh vật bắt màu tím, hình que, không có bào tử thì kết luận vi sinh vật là trực khuẩn Gram dương, không sinh bào tử.

b. Định danh vi sinh vật bằng kit API 20A:

Sau khi xác định vi sinh vật là trực khuẩn Gram dương, không sinh bào tử thì tiếp tục cấy một quai cấy canh chủng từ ống MRS lỏng ở trên lên môi trường thạch máu, ủ trong điều kiện kị khí ở 37 1oC trong 18-24 giờ. Gặt vi sinh vật trên bề mặt đĩa thạch và phân tán đều trong ống nghiệm có sẵn 1ml nước cất vô trùng thu được hỗn dịch gốc.

Nhỏ từ từ từng giọt hỗn dịch gốc ở trên vào một ống nghiệm đã chứa sẵn 4ml nước cất vô trùng đến khi độ đục trong ống tương đương với độ đục chuẩn McFarland số 3. Ghi lại số giọt hỗn dịch gốc đã cho vào ống nghiệm trên.

Cho vào 4ml môi trường API 20A số giọt hỗn dịch gốc bằng số giọt đã cho vào ống nghiệm trên và lắc đều. Như vậy, nồng độ vi sinh vật trong môi trường API 20A tương đương với độ đục chuẩn McFarland số 3 (so sánh độ đục bằng mắt thường).

Nhỏ môi trường API 20 đã cấy vi sinh vật vào các giếng của bộ kit API 20A bắt đầu từ giếng số 0 đến giếng 20, chú ý tránh tạo bọt khí trong giếng, chú ý chỉ nhỏ phần tube. Riêng đối với giếng IND nhỏ dung dịch dầu khoáng vô trùng lên trên bề mặt giếng để tạo điều kiện kị khí cho vi sinh vật phát triển. Đối với giếng GEL nhỏ cả phần tube và phần miệng giếng. Ủ ở 36 ± 2oC trong điều kiện kị khí trong vòng 24± 2h.

(39)

29

- Đối với giếng IND: Thêm 1 giọt thuốc thử XYL vào lớp dầu khoáng phía trên, trộn đều và để 2-3 phút. Sau đó thêm 1 giọt thuốc thử EHR. Đọc kết quả trong vòng 5 phút. Kết quả là dương tính nếu xuất hiện màu đỏ.

- Đối với các giếng có chứa các đường khác nhau: Thêm vào mỗi giếng một giọt thuốc thử BCP. Kết quả được ghi là dương tính nếu xuất hiện màu vàng hoặc vàng-xanh.

- Phản ứng CAT: Để kit tiếp xúc với không khí khoảng 30 phút, sau đó thêm 2 giọt thuốc thử H2O2 3% vào một giếng dương tính bất kỳ. Kết quả được ghi là dương tính nếu thấy xuất hiện bọt khí.

(40)

30

Bảng 2.4. Cách đọc kết quả kit Api 20A

Giếng Chất nền Hàm lượng(mg/gi ếng) Phản ứng Kết quả âm tính Dương tính

IND L-tryptophan 0,98 Sự hình thành indol

XYL-trộn đều /2-3 phút + HER/5 phút

Vàng Đỏ

URE Urea 0,648 Urease Vàng-cam Đỏ

GLU MAN LAC SAC MAL SAL XYL ARA D-glucose D-manitol D-lactose D-saccharose D-maltose Salicin D-xylose L-arabinose 1,96 1,96 1,96 1,86 1,96 1,64 1,64 1,64 Acid hóa Acid hóa Acid hóa Acid hóa Acid hóa Acid hóa Acid hóa Acid hóa BCP Tím Vàng/ vàng-xanh GEL gelatin 0,6 Sự thủy phân gelatin Không có sự khuếch tán chất màu Có sự khuếch tán chất màu đen ESC Esculin Sắt (III) citrat 0,36 0,11 Sự thủy phân Esculin Vàng Nâu-đen Soi dưới đèn UV 365nm Phát quang Không phát quang GLY CEL MNE MLZ RAF SOR RHA TRE Glycerol D-cellobiose D-mannose D-melezitose D-raffinose D-sorbitol L-rhamnose D-trehalose 1,82 1,86 1,96 1,96 2,18 2,18 1,96 1,96 Acid hóa Acid hóa Acid hóa Acid hóa Acid hóa Acid hóa Acid hóa Acid hóa BCP Tím Vàng/ Vàng-xanh

Sau khi tiếp xúc với không khí 30 phút, thêm H2O2 vào 1 giếng dương tính

CAT - Catalase Không có bọt khí Xuất hiện bọt khí

SPOR - Bào tử Không có Có

GRAM - Hồng Tím

(41)

31

Ghi kết quả vào phiếu theo dõi. Nhập số liệu vào phần mềm Apiweb để định danh chính xác vi sinh vật trong chế phẩm.

2.3.3. Định danh đến loài bằng kỹ thuật PCR và giải trình tự

2.3.3.1. Sơ đồ chung định tính B. longum trong các chế phẩm probiotics bằng kỹ thuật PCR và giải trình tự

Sau khi lựa chọn khuẩn lạc đặc trưng tách biệt, tiến hành tăng sinh trong môi trường MRS lỏng có bổ sung 0,5ml dầu khoáng và được định danh đến chi Bifidobacterium bằng kit API 20A như mô tả trong mục 2.3.2, tiếp tục cấy tăng sinh VSV từ phần sinh khối còn lại sang môi trường MRS lỏng, bổ sung thêm 0,5ml dầu khoáng vô khuẩn, ủ ở 37±10C trong điều kiện kỵ khí trong 24 giờ. Sau đó VSV trong ống môi trường MRS lỏng này sẽ được tách chiết DNA và định danh bằng kỹ thuật PCR và giải trình tự theo sơ đồ sau

Hình 2.1. Sơ đồ định tính B. longum bằng kỹ thuật PCR và giải trình tự VSV trong môi trường MRS lỏng Tách chiết DNA Kiểm tra sản phẩm tách Tiến hành phản ứng PCR với mồi đặc hiệu

Nhân dòng và giải trình tự

References

Related documents

Carolinas Medical Center Nurse Anesthesia Program/UNCC is fully accredited by the Council on Accreditation of Nurse Anesthesia Educational Programs until May, 25, 2014 and

Τσαλδάρη, και τον Νοέμβριο του 1935 διε- ξάγει διαβλητό δημοψήφισμα με σκοπό την πα- λινόρθωση της Βασιλείας και την επιστροφή του Γεωργίου

3 Predatory trading predicts large depth imbalances in the same direction as the order submission; when large depth imbalances build up on the bid side, predatory traders

The paper examined the relevance and impact of Jabi Lake on urban development and sustainable environmental management using a focused group discussion and field

Using the following table as a guide, write a program that asks t he user to enter an integer test score between 0

2.8 Layer 7 2.8.1 PFSense implementation 2.8.2 Defining Protocol Patterns 2.8.3 Using Layer 7 with a bridging firewall 2.9 Example Scenarios

Store and protect all materials to minimise saturation and contamination. Control the wetting of bricks in hot windy weather. Do not lay surface saturated bricks. Set out at

The EWS III module looks at the other inputs for correct status (e.g. Code function not active, Transmission in P or N or clutch depressed, engine speed below specified RPM)