Epilepsy and Morita-Baylis-Hillman : a synthetic approach to antiepileptic

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(1)UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS INSTITUTO DE QUÍMICA. NATHÁLIA CHRISTINA GONÇALVES YAMAKAWA. EPILEPSIA E MORITA-BAYLIS-HILLMAN: UMA ABORDAGEM SINTÉTICA PARA CERAMIDAS ANTIEPILÉPTICAS DISSERTAÇÃO DE MESTRADO APRESENTADA AO INSTITUTO DE QUÍMICA DA UNICAMP PARA OBTENÇÃO DO TÍTULO DE MESTRE EM QUÍMICA NA ÁREA DE QUÍMICA ORGÂNICA.. ORIENTADOR: PROF. DR. FERNANDO ANTONIO SANTOS COELHO. ESTE EXEMPLAR CORRESPONDE À VERSÃO FINAL DA DISSERTAÇÃO DEFENDIDA POR NATHÁLIA CHRISTINA GONÇALVES YAMAKAWA E ORIENTADA PELO PROF. DR. FERNANDO ANTONIO SANTOS COELHO.. _______________________ Assinatura do Orientador. CAMPINAS, 2012. i.

(2) FICHA CATALOGRÁFICA ELABORADA POR SIMONE LUCAS - CRB8/8144 BIBLIOTECA DO INSTITUTO DE QUÍMICA DA UNICAMP. Y14e. Yamakawa, Nathália Christina Gonçalves (1986-). Epilepsia e Morita-Baylis-Hillman: uma abordagem sintética para ceramidas antiepilépticas / Nathália Christina Gonçalves Yamakawa. – Campinas, SP: [s.n.], 2011. Orientador: Fernando Antônio Santos Coelho. Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Química. 1. Morita-Baylis-Hillman. 2. Epilepsia. 3. Ceramidas. I. Coelho, Fernando Antônio Santos. II. Universidade Estadual de Campinas. Instituto de Química. III. Título.. Informações para Biblioteca Digital Título em inglês: Epilepsy and Morita-Baylis-Hillman: a synthetic approach to antiepileptic ceramides Palavras-chave em inglês: Morita-Baylis-Hillman Epilepsy Ceramides Área de concentração: Química Orgânica Titulação: Mestre em Química na área de Química Orgânica Banca examinadora: Fernando Antônio Santos Coelho [Orientador] Cláudio Francisco Tormena Rodrigo Octavio Mendonça Alves de Souza Data de defesa: 19/12/2011 Programa de pós-graduação: Química. ii. ii.

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(4) Aos que me apoiaram para que eu não caísse, aos que me levantaram quando desabei, aos que continuam caminhando ao meu lado hoje e para sempre, dedico esta dissertação com todo meu amor e carinho: Fabiano, Felipe, Marina, Oscar, Claudinei, Irani e Sebastiana.. v.

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(6) The higher we soar, the smaller we appear to those who cannot fly! - "The dawn of day" - Friedrich Wilhelm Nietzsche. vii.

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(8) AGRADECIMENTOS Aos meus pais e meu irmão pela confiança, incentivo, carinho e todo apoio, serei eternamente grata à vocês. Ao Fabiano, não apenas o companheiro da minha vida, mas também parte fundamental para que o eu ∃ (∞). Àquela que encheu minha vida de alegrias e boas lembranças, Menina, obrigada por todo carinho, e pelas lambidas e brincadeiras. Ao Prof. Fernando Coelho, o meu muito obrigada pela oportunidade de aprendizado em um dos melhores grupos de química orgânica do país, pela confiança no trabalho realizado e pelo apoio em todos os momentos. Aos amigos e colegas, André, Daniara, Emilie, Giovanni, Hamid, Hugo, João Paulo, Joel, Leandra, Lucimara, Manuel, Marília, Nayanne, Paty, Paulo Paioti, Robert, Rodrigo, Wilson (Fastioso) pelas conversas, pelos momentos de descontração, diversas ajudas e ensinamentos. Ao Bruno pelas correções, chás da tarde, repertório musical e toda amizade. Ao amigo José Tiago (Joseph) com quem aprendi muita química e dei muitas risadas, obrigada pelas correções e ensinamentos. A Ju pelo companheirismo e pelo 212. Ao Kristerson, que não apenas me ensinou muito profissionalmente, sendo um dos grandes responsáveis pelo acontecimento deste trabalho, mas também pela amizade, piadas e enquetes. Ao compadre Luís Gustavo (Louis), pelos chás da tarde, conversas e paciência. Ao Edson Avansini, por todo suporte e auxílio em diversos aspectos do laboratório que permitiu a finalização deste trabalho.. ix.

(9) Aos demais colegas do laboratório do Prof. Carlos Roque, Ronaldo Pilli e Luiz Carlos Dias. Ao professor Paulo Cesar Muniz de Lacerda Miranda pelas contribuições no exame de qualificação deste trabalho. Ao professor Cláudio Tormena pelas contribuições no exame de qualificação deste trabalho, bem como pelas análises de RMN realizadas e pelo fim de semana investido em meu trabalho e em minha formação profissional, foi um grande aprendizado. Ao professor Ricardo Aparício pelos ensinamentos referentes a cristalografia de raios-X e pelas análises realizadas juntamente com o Fábio Oliveira. Aos técnicos: Sônia, Paula, Anderson, Ricardo, Micheli, José, Daniel, Rinaldo e Rita por toda ajuda com os equipamentos institucionais, todo aprendizado e carinho com que me receberam. Aos demais técnicos e funcionários do IQ-UNICAMP. À estrutura e ao suporte fornecidos pelo IQ-UNICAMP. À FAPESP pela bolsa de mestrado (Processo: 2009/03718-4 ) e pelas considerações em relatórios científicos.. x.

(10) Nathalia Christina Gonçalves Yamakawa (nathalia@wundo.net) Formação Acadêmica 2009 - 2011. Mestrado em Química Orgânica Instituto de Química – Universidade Estadual de Campinas, IQ/UNICAMP, Brasil. 2004 - 2007. Bacharelado em Química Instituto de Química de São Carlos – Universidade de São Paulo, IQSC/USP, São Carlos, Brasil ______________________________________________________________________________________. Formação complementar 2010. Programa de Estágio Docente – Química Orgânica Farmácia/UNICAMP (Carga horária: 8h/semana – 4 meses). Experimental. -. curso. de. 2009. General English – KAPLAN ASPECT – Nova York/NY - Midtown (Carga horária: 100h). 2007 - 2007. Curso de Sistemas de Qualidade em Química na Saúde Pública (Carga horária: 60h) Citando: RDC-210; BPF; RDC-216; NBR-ISO/IEC-17025; NIT-DICLA-028 (BPL); RE-899. Instituto de Química de São Carlos - USP, IQSC, Brasil. 2007 - 2007. Curso de Gestão Ambiental e Normatização (Carga horária: 60h) Citando: NBR-ISO-14001; NBR-ISO-19011. Instituto de Química de São Carlos - USP, IQSC, Brasil ______________________________________________________________________________________. Atuação profissional 1. Instituto de Química - UNICAMP - IQ/UNICAMP ____________________________________________________________________________ 03/2009 – 12/2011. Mestrado em Síntese Orgânica Vínculo: Bolsista FAPESP - Processo: 2009/03718-4 ____________________________________________________________________________. 2. Laboratório de Resíduos - UNICAMP – CPQBA ____________________________________________________________________________ 03/2008 – 12/2008 Vínculo: Bolsista - Facilitador de Qualidade ____________________________________________________________________________. 3. Instituto de Química de São Carlos - USP - IQSC/USP ____________________________________________________________________________ 10/2005 – 12/2007. Projetos de pesquisa em Química Medicinal Vínculo: Bolsista CNPq. xi.

(11) Nathalia Christina Gonçalves Yamakawa (nathalia@wundo.net) Projetos 2009 - 2011. Epilepsia e Morita-Baylis-Hillman: uma abordagem sintética para ceramidas antiepilépticas.. Descrição: Desenvolvimento de uma estratégia de síntese com controle estereoquímico do fragmento polar de ceramidas que apresentaram atividade antiepiléptica. Foram aplicadas diferentes técnicas de caracterização e também para confirmação das estereoquímicas (IV, RMN, cristalografia de raio-X, HPLC, CG, polarimetria).. 2005 - 2007 Descrição:. Determinação do Coeficiente Cromatográfico de Partição, log kw, e modelo HQSAR de Flavonóides Naturais Trabalho. realizado. utilizando-se. cromatógrafo. a. líquido. Shimadzu. e. métodos. quimiométricos (HQSAR, PCA, PLS) para desenvolvimento de um modelo de absorção de uma classe de produtos naturais, flavonóides. Financiador(es): Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico - CNPq, Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo - FAPESP ___________________________________________________________________________________. Idiomas Inglês. Fluente. Francês Básico _____________________________________________________________________________________. Participação em eventos e Produções Bibliográficas 1. 34ª Reunião Anual da Sociedade Brasileira de Química, 2011, Florianópolis. (ORG368 / EST34) 2. 33ª Reunião Anual da Sociedade Brasileira de Química, 2010, Águas de Lindóia. (QO-258) 3. COLACRO-XII Congresso Latino-Americano de Cromatografia e Técnicas Relacionadas, 2008, Florianópolis. 4. CIFARP - 6th International Congress of Pharmaceutical Sciences, 2007, Ribeirão Preto. 5. 30ª Reunião Anual Sociedade Brasileira de Química, 2007, Águas de São Pedro. (MD-052). 6. YAMAKAWA, N. C. G., SILVA, F. C. S. A gripe não é a única vilã na criação de aves. Revista Eletrônica de Ciências. , 2006. Meio de divulgação digital: http://www.cdcc.sc.usp.br/ciencia/artigos/art_32/aprendendo5.html. xii.

(12) RESUMO A epilepsia é uma das principais doenças do sistema nervoso central, caracterizada por uma alteração na atividade elétrica do cérebro, que leva à perdas de memória e convulsões. Essa doença afeta cerca de 50 milhões de pessoas no mundo, que são discriminadas e isoladas da sociedade. Existem vários medicamentos que podem ser utilizados, no entanto, muitas vezes é necessário a administração de associações desses que apresentam severos efeitos colaterais. Esse quadro justifica a necessidade da busca por substâncias mais eficientes para o tratamento dessa doença. Em 2008, Ahmed e cols. isolaram da esponja marinha Negombata corticata duas ceramidas que apresentaram importante atividade anti-convulsiva. Assim, este trabalho teve por objetivo estabelecer uma estratégia sintética para a preparação do fragmento polar de tais ceramidas. A rota foi baseada em um aduto de Morita-Baylis-Hillman (MBH), obtido com elevada diastereosseletividade a partir de uma reação entre o aldeído de Garner e o acrilato de etila. Uma reação de ozonólise na dupla ligação do aduto de MBH fornece um α-cetoéster, cuja carbonila cetônica é reduzida conduzindo a um único produto. A proteção das hidroxilas, permitiu a confirmação da estereoquímica relativa através de análise por difração de raios-X, que também evidenciou a ocorrência de racemização na reação de MBH. O diol também foi utilizado na preparação de um aza-açúcar, potencial inibidor de glicosidase, sendo esta síntese em apenas 4 etapas com 32% de rendimento global. A fração apolar da ceramida foi sintetizada a partir de uma reação de Grignard, e a junção dos fragmentos pode ser realizada utilizando-se uma reação de Wittig. Desta maneira, foi descrita uma nova estratégia sintética que pode ser aplicada na preparação de diversos análogos das ceramidas, desenvolvendo um antiepiléptico mais potente.. xiii.

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(14) ABSTRACT Epilepsy is a chronic brain disorder that affects around 50 million people all over the world. It is characterized by recurrent seizures - which are physical reactions to sudden excessive electrical discharges in a group of brain cells. The discrimination and social stigma that surround epilepsy worldwide are often more difficult to overcome than the seizures themselves. Because of this fact and the economical impacts of the disease, the research for new biologically active compounds is still necessary. In 2008, Ahmed et al. isolated from the Red Sea sponge Negombata corticata two ceramides, which exhibit in vivo anticonvulsant activity. This work is focused on establishing of a synthetic sequence to prepare the polar fragment present in both ceramides. The strategy was based on a Morita-Baylis-Hillman reaction between a Garner’s aldehyde and. ethyl. acrylate. that. provided. a. functionalized. intermediate. in. good. diastereoselectivity. The major diastereoisomer was employed as substrate in an ozonolysis reaction, followed by a stereoselective reduction that afforded 1,2-diol as a single isomer. The acetonide derived from this 1,2-diol allowed us to determine through X-Ray diffraction analysis the relative stereochemistry of this compound as being 1,2anti. To finish the synthesis of the polar fragment, the ester group present in the acetonide was reduced to the corresponding aldehyde. The diol also was applied in a high diastereoselective preparation of an azasugar in 4 steps and 32% yield overall. In this work we also describe the synthesis of a carbon chain of the ceramide, our route includes an approach to the apolar fragment obtained by a Grignard reaction; then a Wittig reaction can couple both fragments toward the finalization of the sphingosine’s synthesis. Our synthetic route can also be used in the preparation of several analogues of the antiepiletic ceramides.. xv.

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(16) ÍNDICE LISTA DE FIGURAS .......................................................................................................................... xix LISTA DE ESQUEMAS .................................................................................................................... xxiii 1. INTRODUÇÃO ................................................................................................................................ 1 1.1. Epilepsia – Aspectos Gerais ...................................................................................................... 1 1.1.1. Breve histórico .................................................................................................................... 2 1.1.2. A epilepsia nos dias de hoje ............................................................................................... 5 1.2. Ceramidas – Aspectos Gerais .................................................................................................... 8 1.3. Precedentes de Pesquisa .......................................................................................................... 11 1.3.1. Primeira Síntese Convergente – Ceramida isolada: Negombata corticata ....................... 11 1.3.2. Propostas Sintéticas .......................................................................................................... 14 1.4. Reação de Morita-Baylis-Hillman (MBH) .............................................................................. 16 1.4.1. Mecanismo da reação de MBH......................................................................................... 18 2. OBJETIVO ..................................................................................................................................... 21 3. RESULTADOS E DISCUSSÃO.................................................................................................... 23 3.1. Método Sintético Preliminar .................................................................................................... 24 3.1.1. Preparação do aldeído de Garner (22) .............................................................................. 24 3.1.1.1 Preparação do éster (26) ................................................................................................ 26 3.1.1.2 Proteção do nitrogênio com dicarbonato de di-terc-butila (27) ..................................... 27 3.1.1.3 Preparação da oxazolidina (28) ..................................................................................... 29 3.1.1.4 Preparação do álcool – serinol (29) ............................................................................... 30 3.1.1.5 Preparação do aldeído de Garner - oxidação de Swern (22) ......................................... 32 3.1.2. Preparação do aldeído de Garner (22) – Rota alternativa ................................................. 36 3.1.2.1 Prepação da L-serina protegida (30) .............................................................................. 36 3.1.2.2 Preparação da amida de Weinreb (31) ........................................................................... 38 3.1.2.3 Proteção – formação da oxazolidina (32) ...................................................................... 40 3.1.2.4 Redução da amida de Weinreb – aldeído de Garner (22) .............................................. 42 3.2. Método Sintético – Fração Polar ............................................................................................. 44 3.2.1. Preparação dos adutos de MBH........................................................................................ 44 3.2.2. Reação de Ozonólise – Preparação do α-ceto-éster (34) .................................................. 47 3.2.3. Reação de redução do α-ceto-éster – Preparação do 1,2 diol (35) ................................... 49 3.2.4. Determinação da Estereoquímica ..................................................................................... 53 3.2.4.1 Preparação do aza-açúcar (36) ....................................................................................... 53 3.2.4.2 Preparação do acetonídeo (37)....................................................................................... 58 3.2.4.2.1 Análise por difração de raios-‐X – acetonídeo (37) ................................................. 59 3.2.5. Verificação de Pureza Ótica ............................................................................................. 62 3.2.6. Tentativas de Síntese Assimétrica .................................................................................... 68 3.2.6.1 Literatura – MBH assimétrica ....................................................................................... 71 3.2.6.1.1 Preparação do catalisador -‐ β-‐isocupreidina (β-‐ICD) ............................................. 75 3.2.6.1.2 Reação de MBH – Catálise Assimétrica................................................................. 78 3.2.6.1.3 Transesterificação – Confirmação das Estereoquímicas ........................................ 82 . xvii.

(17) 3.2.7. Preparação do Aldeído (49) ............................................................................................. 86 3.3. Síntese – Fragmento Apolar .................................................................................................... 88 3.3.1. Preparação dos brometos - Reagente de Grignard ............................................................ 90 3.3.2. Reação de proteção dos bromo álcoois............................................................................. 92 3.3.3. Reação de Grignard .......................................................................................................... 95 4. CONSIDERAÇÕES FINAIS ......................................................................................................... 99 5. PARTE EXPERIMENTAL .......................................................................................................... 101 5.1. Considerações Gerais............................................................................................................. 101 5.1.1. Reagentes e Solventes .................................................................................................... 101 5.1.2. Métodos de Identificação e Purificação.......................................................................... 101 5.1.2.1 Cromatografia .............................................................................................................. 101 5.1.2.2 Espectrometria, polarimetria e ponto de fusão ............................................................ 102 5.2. Procedimentos e Espectros .................................................................................................... 104 . xviii.

(18) LISTA DE FIGURAS Figura 1. Documentos que comprovam a ocorrência da epilepsia antigamente. ............. 3 Figura 2. Substâncias utilizadas no tratamento de epilepsia ............................................ 6 Figura 3. Ceramidas isoladas da esponja Negombata corticata ...................................... 7 Figura 4. Vias biossintéticas de ceramidas ...................................................................... 9 Figura 5. Alguns exemplos de classes de ceramidas naturais ........................................ 10 Figura 6. Formas de ressonância - carbamato ................................................................ 35 Figura 7. Modelo de ataque nucleofílico - produto Felkin preferencial ........................ 46 Figura 8. Modelo para indução 1,2 - isômero anti preferencial ..................................... 52 Figura 9. Espectro de NOESY (400 MHz, D2O, d8 = 1,2 ms) do composto 36 ............ 57 Figura 10. Representação Ortep do intermediário 37 .................................................... 60 Figura 11. Cromatogramas: aldeídos de Garner - A: configuração S (93% e.e.); B: configurações S e R; C: configuração R (98% e.e.). ............................................... 63 Figura 12. Cromatograma - HPLC: aduto 33b (syn) ..................................................... 65 Figura 13. Cromatograma - HPLC: aduto 33a (anti) ..................................................... 66 Figura 14. Cromatograma - HPLC: adutos 33a/b .......................................................... 67 Figura 15. Bases testadas por Hatakeyama e cols.......................................................... 72 Figura 16. Cromatograma do aduto 48a (anti) – método de Hatakeyama ..................... 80 Figura 17. Cromatograma do aduto 49b (syn) – método de Hatakeyama ..................... 81 Figura 18. Cromatograma do aduto 33a (anti) – método de Hatakeyama ..................... 84 Figura 19. Cromatograma do aduto 33b (syn) – método de Hatakeyama ..................... 85 Figura 20. Ceramidas: I) Isoladas de tunicados - apresentam uma elevada atividade inibitória sobre fosfolipase A2 (antiinflamatório). II) Isoladas de mexilhões apresentam potencial atividade anti-câncer. ......................................................... 100 Figura 21. Espectro na região do IV do éster etílico – serina (26) .............................. 105 Figura 22. Espectro de 1H RMN (250 MHz, D2O/CCl4) do éster etílico (26) ............. 106 Figura 23. Espectro de 13C RMN (62,5 MHz, D2O/CCl4) do éster etílico (26) ........... 106 Figura 24. Espectro 2D- HSQC (400 MHz-100 MHz, C6D6) do éster etílico (26) ..... 107 Figura 25. Espectro na região do IV do N-Boc éster - serina (27) .............................. 109 Figura 26. Espectro de 1H RMN (250 MHz, C6D6, 70 ºC) do N-Boc éster - serina (27) ............................................................................................................................... 109 Figura 27. Espectro de 13C RMN (62,5 MHz, C6D6) do N-Boc éster - serina (27) ..... 110 Figura 28. Espectro 2D- HSQC (400 MHz-100 MHz, C6D6) do N-Boc éster - serina (27) ........................................................................................................................ 110 Figura 29. Espectro na região do IV da oxazolidina (28) ............................................ 112 Figura 30. Espectro de 1H RMN (250 MHz, DMSO, 90 ºC) da oxazolidina (28) ....... 112 Figura 31. Espectro de 13C RMN (62,5 MHz, DMSO, 90 ºC) da oxazolidina (28)..... 113. xix.

(19) Figura 32. Espectro DEPT-135 (62,5 MHz, DMSO, 90 ºC) da oxazolidina (28) ....... 113 Figura 33. Espectro 2D- HSQC (400 MHz-100 MHz, DMSO) da oxazolidina (28) .. 114 Figura 34. Espectro na região do IV do serinol (29).................................................... 116 Figura 35. Espectro de 1H RMN (250 MHz, DMSO+D2O) do serinol (29) ................ 116 Figura 36. Espectro de 13C RMN (62,5 MHz, DMSO, 90 ºC) do serinol (29) ........... 117 Figura 37. Espectro 2D - HSQC (400 MHz-100 MHz, DMSO) do serinol (29) ......... 117 Figura 38. Espectro na região do IV do aldeído de Garner (22) .................................. 119 Figura 39. Espectro de 1H RMN (250 MHz, C6D6, 70 ºC) do aldeído de Garner (22) 120 Figura 40. Espectro de 13C RMN (62,5 MHz, C6D6) do aldeído de Garner (22) ......... 120 Figura 41. Espectro de DEPT-135 (62,5 MHz, C6D6) do aldeído de Garner (22) ...... 121 Figura 42. Espectro na região do IV - serina-boc (30) ................................................ 123 Figura 43. Espectro de 1H RMN (250 MHz, DMSO, 90 ºC) - serina-boc (30) ........... 123 Figura 44. Espectro de 13C RMN (62,5 MHz, DMSO, 90 ºC) - serina-boc (30) ......... 124 Figura 45. Espectro na região do IV - amida de Weinreb (31) .................................... 126 Figura 46. Espectro de 1H RMN (250 MHz, DMSO,90 ºC) - amida de Weinreb (31) 126 Figura 47. Espectro de 13C RMN (62,5 MHz,DMSO,90ºC) - amida de Weinreb (31) 127 Figura 48. Espectro de DEPT-135 (62,5 MHz, DMSO) - amida de Weinreb (31) ..... 127 Figura 49. Espectro na região do IV – amida protegida (32)....................................... 129 Figura 50. Espectro de 1H RMN (250 MHz, DMSO, 90 ºC) – amida protegida (32) . 129 Figura 51. Espectro de 13C RMN (62,5 MHz, DMSO, 90 ºC) – amida protegida (32) 130 Figura 52. Espectro 2D-HSQC (400 MHz-100MHz,DMSO) – amida protegida (32) 130 Figura 53. Espectro de 1H RMN (250 MHz, CDCl3) - aldeído de Garner (22) ........... 132 Figura 54. Espectro na região do IV do aduto de MBH (33a) ..................................... 134 Figura 55. Espectro de 1H RMN do aduto de MBH (33a) ........................................... 135 Figura 56. Espectro de 13C RMN (250 MHz, DMO, 90 ºC) do aduto de MBH (33a) . 135 Figura 57. Espectro 2D - HSQC (400 MHz-100 MHz, DMSO, 90 ºC) do aduto de MBH (33a) ............................................................................................................ 136 Figura 58. Espectro de DEPT-135 (62,5 MHz, DMSO, 90 ºC) do aduto de MBH (33a) ............................................................................................................................... 136 Figura 59. Espectro na região do IV do aduto de MBH (33b) ..................................... 138 Figura 60. Espectro de 1H RMN (250 MHz, DMSO, 90 ºC) do aduto de MBH (33b) 138 Figura 61. Espectro de 13C RMN (62,5 MHz, DMSO, 90 ºC) do aduto de MBH (33b) ............................................................................................................................... 139 Figura 62. Espectro na região do IV do ceto-éster (34) ............................................... 141 Figura 63. Espectro de 1H RMN (250 MHz, DMSO, 90 ºC) do ceto-éster (34).......... 142 Figura 64. Espectro de 13C RMN (62,5 MHz, CDCl3) do ceto-éster (34) ................... 142 Figura 65. Espectro na região do IV do 1,2 diol (35) .................................................. 144 Figura 66. Espectro de 1H RMN (250 MHz, CDCl3, 50 ºC) do 1,2 diol (35) .............. 144. xx.

(20) Figura 67. Espectro de 13C RMN (62,5 MHz, CDCl3) do 1,2 diol (35) ....................... 145 Figura 68. Espectro de DEPT-135 (62,5 MHz, CDCl3) do 1,2 diol (35) ..................... 145 Figura 69. Espectro na região do IV do aza-açucar (36) ............................................. 147 Figura 70. Espectro de 1H RMN (400 MHz, D2O/CCl4) do aza-açucar (36)............... 147 Figura 71. Espectro de 13C RMN (100 MHz, D2O/CCl4) do aza-açúcar (36) ............. 148 Figura 72. Espectro de DEPT-135 (62,5 MHz, D2O/CCl4) do aza-açúcar (36) .......... 148 Figura 73. Espectro 2D - HSQC (400 MHz-100 MHz, D2O/CCl4) aza-açúcar (36) ... 149 Figura 74. Espectro na região do IV do acetonídeo (37) ............................................. 151 Figura 75. Espectro de 1H RMN (400 MHz, DMSO, 90 ºC) do acetonídeo (37) ....... 151 Figura 76. Espectro de 13C RMN (62,5 MHz, CDCl3) do acetonídeo (37).................. 152 Figura 77. Interpolação dos espectro de 13C, DEPT-135/90 (62,5 MHz, CDCl3) do acetonídeo (37) ...................................................................................................... 152 Figura 78. Espectro 2D – COSY (400 MHz, DMSO, 90 ºC) do acetonídeo (37) ....... 153 Figura 79. Espectro 2D – HSQC (400 MHz-100 MHz, DMSO, 90 ºC) do acetonídeo (37) ........................................................................................................................ 153 Figura 80. Espectro de 1H RMN (250 MHz, CDCl3) - β-ICD (42) ............................. 156 Figura 81. Espectro de 13C RMN (62,5 MHz, CDCl3) - β-ICD (42) ........................... 156 Figura 82. Espectro de 1H RMN (250MHz, DMSO, 90 °C) - aduto de MBH (48a) ... 158 Figura 83. Espectro de 1H RMN (250MHz, DMSO, 90 ºC) - aduto de MBH (48b) ... 159 Figura 84. Espectro de 1H RMN (250 MHz, CDCl3) - aduto de MBH (33a) .............. 161 Figura 85. Espectro de 1H RMN (250 MHz, CDCl3) - aduto de MBH (33b) .............. 162 Figura 86. Espectro na região do IV – aldeído (49) ..................................................... 164 Figura 87. Espectro de 1H RMN (250 MHz, DMSO, 90 ºC) - aldeído (49) ................ 165 Figura 88. Espectro de 13C RMN (62,5 MHz, CDCl3) - aldeído (49)........................ 165 Figura 89. Espectro de 1H RMN (250 MHz, CDCl3) do composto 59 ........................ 167 Figura 90. Espectro de 13C RMN (62,5 MHz, CDCl3) do composto 59 ..................... 167 Figura 91. Espectro de 1H RMN (250 MHz, CDCl3) do composto 60 ........................ 168 Figura 92. Espectro de 13C RMN (62,5 MHz, CDCl3) do composto 60 ..................... 169 Figura 93. Espectro de 1H RMN (250 MHz, CDCl3) do composto 63 ........................ 171 Figura 94. Espectro de 13C RMN (62,5 MHz, CDCl3) do composto 63 ..................... 171 Figura 95. Espectro de COSY (250 MHz, CDCl3) do composto 63 ............................ 172 Figura 96. Espectro de 1H RMN (250 MHz, CDCl3) do composto 64 ....................... 173 Figura 97. Espectro de 13C RMN (62,5 MHz, CDCl3) do composto 64 ..................... 174 Figura 98. Espectro de 1H RMN (250 MHz, CDCl3) do composto 65 ....................... 176 Figura 99. Espectro de 13C RMN (100 MHz, CDCl3) do composto 65 ...................... 177 Figura 100. Espectro de DEPT-135 (100 MHz, CDCl3) do composto 65 ................... 177. xxi.

(21) xxii.

(22) LISTA DE ESQUEMAS Esquema 1. Síntese do fragmento polar da ceramida 1b por Ghosal e cols. ................. 12 Esquema 2. Síntese da cadeia longa da ceramida 1b por Ghosal e cols. ....................... 13 Esquema 3. Síntese convergente da ceramida 1b por Ghosal e cols.............................. 14 Esquema 4. Proposta de Drewes baseada nos resultados do Koskinen e Krische ......... 15 Esquema 5. Reação de MBH ......................................................................................... 16 Esquema 6. Propostas para o mecanismo da reação de MBH ....................................... 20 Esquema 7. Análise retrossintética para a preparação das ceramidas 1a e 1b ............... 23 Esquema 8. Preparação do aldeído de Garner ............................................................... 25 Esquema 9. Síntese do éster 26 ...................................................................................... 26 Esquema 10. Mecanismo de esterificação da L-serina 26 ............................................. 26 Esquema 11. Síntese do N-Boc 27 ................................................................................. 28 Esquema 12. Mecanismo de proteção do nitrogênio com Boc ...................................... 28 Esquema 13. Síntese da oxazolidina 28 ......................................................................... 29 Esquema 14. Mecanismo de formação da oxazolidina 28 ............................................. 30 Esquema 15. Síntese do serinol 29 ................................................................................ 31 Esquema 16. Mecanismo proposto para redução ........................................................... 31 Esquema 17. Síntese do Aldeído 22 .............................................................................. 33 Esquema 18. Mecanismo de oxidação de Swern ........................................................... 34 Esquema 19. Rota alternativa - preparação do aldeído de Garner ................................. 36 Esquema 20. Reação de proteção da L-serina................................................................ 37 Esquema 21. Mecanismo proposto para proteção do nitrogênio com Boc .................... 37 Esquema 22. Preparação da amida de Weinreb ............................................................. 38 Esquema 23. Mecanismo proposto para formação da amida de Weinreb ..................... 39 Esquema 24. Reação de proteção N,O-acetal ................................................................ 40 Esquema 25. Mecanismo proposto para formação da oxazolidina ................................ 41 Esquema 26. Reação de redução da amida de Weinreb ................................................. 42 Esquema 27. Mecanismo proposto para redução da amida de Weinreb ........................ 43 Esquema 28. Preparação dos adutos de MBH ............................................................... 44 Esquema 29. Cromatograma dos adutos de MBH (bruto da reação) ............................. 45 Esquema 30. Preparação do α-ceto-éster 34 .................................................................. 47 Esquema 31. Mecanismo da reação de ozonólise .......................................................... 48 Esquema 32. Síntese do 1,2 diol 35 ............................................................................... 49 Esquema 33. Proposta para ocorrência de over reduction ............................................. 51 Esquema 34. Síntese do aza-açúcar 36 .......................................................................... 53 Esquema 35. Preparação do acetonídeo 37 .................................................................... 58 Esquema 36. Reação de MBH ....................................................................................... 68. xxiii.

(23) Esquema 37. Mecanismo proposto por Hatakeyama e cols. para a MBH assimétrica catalizada pela β-isocupreidina. .............................................................................. 74 Esquema 38. Preparação do catalisador – β-ICD .......................................................... 76 Esquema 39. Mecanismo proposto para formação da β-ICD ........................................ 76 Esquema 40. Preparação do catalisador – enantiocomplementar da β-ICD .................. 77 Esquema 41. Reação de MBH utilizando como catalisador a β-ICD - condições modificadas ............................................................................................................. 78 Esquema 42. Reação de transesterificação .................................................................... 83 Esquema 43. Mecanismo proposto para reação de transesterificação ........................... 83 Esquema 44. Preparação do Aldeído 49 ........................................................................ 86 Esquema 45. Mecanismo de redução com DIBAL-H ................................................... 87 Esquema 46. Rota inicial proposta para preparação da cadeia C17............................... 88 Esquema 47. Rota sintética inicial – preparação do sal de fosfônio .............................. 89 Esquema 48. Proposta alternativa para preparação do fragmento apolar ...................... 90 Esquema 49. Preparação dos alquil brometos ................................................................ 91 Esquema 50. Mecanismo proposto para formação do alquil brometo ........................... 91 Esquema 51. Proteção dos bromo-álcoois ..................................................................... 93 Esquema 52. Mecanismo para a reação de proteção com TBSCl .................................. 94 Esquema 53: Preparação da cadeia C17 ........................................................................ 97 Esquema 54: Mecanismo da reação de Grignard ........................................................... 97 Esquema 55. Síntese da base esfingóide ........................................................................ 99. xxiv.

(24) 1. INTRODUÇÃO 1.1.. Epilepsia – Aspectos Gerais. A epilepsia é uma deficiência neurológica proveniente de alterações, temporárias e reversíveis, na atividade elétrica do cérebro, que não tenham sido provenientes de febre ou distúrbios metabólicos. Ela é caracterizada por convulsões e perdas de memória repetidas, no entanto, existem mais de 30 tipos de epilepsia. Às vezes, a pessoa com epilepsia perde a consciência, mas também pode experimentar apenas pequenos movimentos corporais ou sentimentos estranhos. Porém, sintomas menores não significam que a crise seja de menor importância.1 Se as alterações epilépticas ficam restritas a uma parte do cérebro, a crise chamase parcial; se o cérebro inteiro está envolvido, chama-se generalizada. Crises parciais simples não ocasionam a perda da consciência e caracterizam-se por distorções na percepção auditiva ou visual, desconforto estomacal, sensação súbita de medo e/ou movimentos estranhos de uma parte do corpo. Se uma crise parcial complexa ocorre a seguir, essas sensações são denominadas "aura". Crises parciais complexas são crises que, assim como as parciais simples, iniciam-se em um foco determinado no cérebro, mas espalham-se para outras áreas, causando perturbação da consciência. A pessoa aparenta estar confusa e pode caminhar sem rumo, falar sem coerência, salivar em excesso, morder a língua e realizar automatismos, como puxar a roupa ou virar a cabeça de um lado para outro repetidas vezes. Crises de ausência constituem-se por lapsos de consciência que, em geral, duram de cinco a 15 segundos. O paciente fica olhando para o nada e pode virar os olhos, embora seja capaz de retomar normalmente sua atividade depois do episódio. Essas crises não são tipicamente precedidas por aura e costumam 1. Fisher, R. S.; Boas, W. E.; Blume, W.; Elger, C.; Genton, P.; Lee, P.; Jr., J. E. Epilepsia 2005, 46, 470-472.. 1.

(25) ocorrer na infância, desaparecendo por volta da adolescência. Crises tônico-clônicas são convulsões generalizadas, com perda de consciência, que envolvem duas fases: na fase tônica, o corpo da pessoa torna-se rígido e ela cai. Na fase clônica, as extremidades do corpo podem contrair-se e tremer. A consciência é recuperada aos poucos. Apesar de ser o tipo mais óbvio e aparente de epilepsia, não é o mais comum. Existem, ainda, várias outras manifestações de epilepsia.2 A incidência da epilepsia varia de acordo com a localização geográfica. Ela ocorre com maior freqüência nos países em desenvolvimento, onde há mais desnutrição, doenças infecciosas e deficiência no atendimento médico. Em países mais desenvolvidos, a incidência é de aproximadamente 1%, subindo para 2% em nações menos desenvolvidas. A epilepsia é mais comum na infância, quando aumenta a vulnerabilidade à infecções do sistema nervoso central (meningite), acidentes (traumatismos do crânio) e doenças como sarampo, varicela e caxumba, cujas complicações podem causar as crises. O problema também poderá se manifestar com o envelhecimento e suas complicações vasculares. Há também o fator genético que descreve sua ocorrência e, até mesmo, o abuso de álcool e drogas.3 1.1.1. Breve histórico4 A epilepsia foi vista em animais filogeneticamente mais antigos que o homem, sugerindo que já haviam animais epilépticos antes que o homem surgisse. As mais remotas descrições da epilepsia, porém, são dos egípcios e dos sumérios e datam de 3500 a.C. Por volta de 1.700 a.C., o principal documento que trata de neurologia no Egito Antigo, o Papiro de Smith, cita possíveis crises convulsivas nos trechos que. 2. http://www.epilepsia.org.br/site/epilepsia.php, http://www.epilepsyfoundation.org, acessado em 05/08/2011. http://www.who.int/mediacentre/factsheets/fs999/en/index.html, acessado em 05/08/2011. 4 Gomes, M. M. J. Epilepsy Clin. Neurophysiol. 2006, 12, 161-167. 3. 2.

(26) descrevem ferimentos na cabeça. Na Suméria (Mesopotâmia), nessa mesma época, vários documentos registram muito bem as crises epilépticas.. Figura 1. Documentos que comprovam a ocorrência da epilepsia antigamente - Papiro de Smith; tábua de madeira pintada na crença cristã com pedido de libertação do demônio de pessoas com epilepsia (século XVIII); pintura do hospital francês Salpêtrière, por Tony Robert-Fleuryem, lotado de pacientes com problemas mentais (século XIX).5. Todas as idéias relacionadas à medicina vinculavam-se a fenômenos sobrenaturais, magia e maldições. Por volta de 400 a.C., Hipócrates, o pai da medicina, afirmou que a causa da epilepsia não estava em espíritos malignos, e sim no cérebro, tentando desfazer mitos sobrenaturais. Os escritos da época foram os primeiros a atribuir causas físicas para as doenças e afecções neurológicas, e identificaram o cérebro como o local chave para o entendimento do comportamento humano. Remédios, dieta e hábitos saudáveis - e não sacrifícios aos deuses, rezas ou magias poderiam tratar os epilépticos. Para fazer o diagnóstico, baseavam-se na observação 5. http://www.epilepsiemuseum.de/, acessado em 15/10/2011.. 3.

(27) cuidadosa dos sinais e sintomas do doente. Há descrições, por exemplo, de auras visuais, auditivas e vegetativas. O termo "aura" (que em grego significa "brisa") designa a sensação que ocorre no início da crise e se originou na história de um professor de Galeno, Pelops. Ao perguntar a um epiléptico o que ele havia sentido durante a crise, este não soube responder, mas um amigo, que presenciara o acontecimento, disse que era como se uma "brisa" tivesse passado por ele (referia-se possivelmente ao olhar de surpresa e à expressão facial que com freqüência está presente no início das crises). No final do século XIX e no início do século XX, o estudo das auras se mostrou importante para a localização da região do cérebro geradora de crises. Diversos pesquisadores estudaram a epilepsia, destacando-se Areteus da Capadocia, Galeno de Pergamo (a maior autoridade médica juntamente com Hipócrates durante o domínio do Império Romano no século II d.C.) e Celso Aureliano. Na Alexandria, Erasistrato e Herófilo fizeram dissecções humanas para estudo. Na Renascença e com a Revolução Científica, a anatomia fundamental para o conhecimento do corpo humano passou a ser realmente estudada, com dissecções e observações meticulosas das estruturas. Foi René Descartes quem abriu as portas para a pesquisa neurofisiológica experimental, fez vários estudos fisiológicos e anatômicos com animais, investigando exaustivamente o sistema nervoso. Ele afirmava que a epilepsia originava-se no cérebro. Na Idade Média, a epilepsia foi relacionada com doença mental e contagiosa – tabus, que persistem até hoje, devido à falta de divulgação de informações e, acima de tudo, divulgações corretas. Naquela época, freqüentemente tentava-se curar o mal por meios religiosos. Foi no século XVIII, que o neurologista, John Hughlings Jackson, afirmou que a disfunção era causada por uma descarga anormal das células nervosas.. 4.

(28) 1.1.2. A epilepsia nos dias de hoje As substâncias mais usadas para tratar a epilepsia são: carbamazepina, clobazam, clonazepam, fenitoína, fenobarbital, primidona e valproato de sódio (ácido valpróico). Medicamentos mais novos incluem a lamotrigina, a oxcarbazepina, o topiramato e a vigabatrina (Figura 2).6 Apesar de eficientes, muitos desses causam vários efeitos colaterais aos pacientes, inclusive danos graves ao fígado, principalmente devido ao uso prolongado. Diversas vezes os medicamentos necessitam ser combinados de forma que os pacientes obtenham resposta ao tratamento.7 Geralmente, a crise epiléptica ocorre quando há um desequilíbrio entre o mecanismo de excitação e o de inibição no cérebro. Baseado em diversos fatores que controlam esses mecanismos, as principais formas de atuação dos medicamentos antiepilépticos ocorre nos canais de sódio e cálcio ou promovendo a inibição dos efeitos mediado pelo receptor GABAA (ácido γ–aminobutírico, tipo A), controlando as descargas elétricas e a propagação das crises.6 Estes fármacos também afetam as propriedades dos neurônios reduzindo a sincronização, inibindo assim dispersões sinápticas a longa distância. A maneira como os anticonvulsivantes previnem a ocorrência de descargas elétricas anormais de fato, ainda não é completamente conhecida, sendo bastante complexa e ocorrendo muitas vezes pela combinação de vários mecanismos.8. 6. Rogawashi, M. A.; Löscher, W. Nature Rev. Neurosci. 2004, 5, 553-564. a) Korkmazer, N.; Vurucu, S.; Demirkaya, E.; Unay, B.; Kul, M.; Akin, R.; Gokcay, E. Brain Develop. 2006, 28, 515520; b) Björnsson, E. Acta Neurol. Scand. 2008, 118, 281-290; c) Santos, N. A. G.; Medina, W. S. G.; Martins, N. M.; Mingatto, F. E.; Curti, C.; Santos, A. C. Toxicol. In Vitro 2008, 22, 1143-1152. 8 a) Silva, A. V.; Cabral, F. R. J. Epilepsy Clin. Neurophysiol. 2008, 14, 39-45; b) Cognato, G. P.; Bruno, A. N.; Silva, R. S.; Bogo, M. R.; Sarkis, J. J. F.; Bonan, C. D. Neurochem. Res. 2007, 32, 1046-1055. 7. 5.

(29) O. N Cl. N. O. N O. H N. O. O. O. OH. NH. N. O 2N. H N. O. O. Cl NH 2 Clobazam. Carbamazepina Cl. O Cl N. H2 N. N. N. NH 2. Lamotrigina. O. O. H O. N NH 2. Oxcarbazepina. Fenobarbital. Clonazepam. Ácido Valpróico. O O S O NH 2. NH2 O. O. OH. OH H O Topiramato. Vigabatrina. Figura 2. Substâncias utilizadas no tratamento de epilepsia. Apesar do arsenal terapêutico disponível para o tratamento de epilepsia, existe ainda muitos esforços para encontrar substâncias que sejam mais eficientes e de menor toxicidade que as utilizadas na atualidade. Assim, a busca por novos compostos que possam servir de protótipo para o desenho de agentes antiepilépticos continua sendo necessária. Recentemente, Ahmed e cols.9 isolaram da esponja Negombata corticata, encontrada no Mar Vermelho, duas novas ceramidas (1a e 1b, Figura 3), que apresentaram considerável atividade anticonvulsiva.. 9. Ahmed, S. A.; Khalifa, S. I.; Hamann, M. T. J. Nat. Prod. 2008, 71, 513-515.. 6.

(30) Negombata corticata. Figura 3. Ceramidas isoladas da esponja Negombata corticata. O efeito anticonvulsivo observado foi semelhante ao grupo controle, no qual foi administrado diazepam, com ocorrência de um prolongamento da latência e redução da duração das convulsões. Os testes de toxicidade, realizados in vivo, mostraram que a mistura das ceramidas não acarretou em óbito dos ratos, em concentrações de até 1 mg/Kg, frente ao diazepam. Em uma população de seis indivíduos, essa mesma dosagem de diazepam levou a dois óbitos (Tabela 1).. Tabela 1. Teste de Toxicidade das Ceramidas isoladas por Ahmed. Entrada. nº de ratos. óbitos. Controle (pentilenotetrazol). 6. 6. Referência (Diazepam – 1 mg/Kg). 6. 2. Mistura - Ceramidas 1a/b (1 mg/Kg). 6. 0. 7.

(31) 1.2.. Ceramidas – Aspectos Gerais. N-acil esfingosinas são substâncias de origem natural, resultantes da biossíntese de esfingolipídeos e de glicoesfingolipídeos, que estão associadas na regulação de diferentes eventos celulares, tais como envelhecimento celular, diferenciação e apoptose (morte celular programada).10 As ceramidas, além de serem responsáveis pela difusão de substâncias no corpo, estando presente na estrutura da membrana celular, também podem agir como reguladoras de muitos processos bioquímicos: na resposta celular ao stress, oriundo da exposição ao calor, a radiação, as condições oxidantes e aos tratamento com quimioterápicos; e inclusive, estas desempenham importante papel na sinalização de processos intracelulares.11 A biossíntese de ceramidas é dependente dos indutores e ocorre em diferentes locais (retículos endoplasmático, lisossomos, membranas associadas do retículo e da mitocôndria), e, por múltiplas vias metabólicas. Dentre as diversas vias (Figura 4), a via de novo ocorre através de reações enzimáticas sequenciais: condensação da serina com o ácido graxo palmitoil-CoA, seguido de redução, acilação e, por fim, uma desaturação pela ação de desnaturases. Na via esfingomielinase, a ceramida é proveniente da hidrólise da esfingomielina promovida pela enzima. Alternativamente, existem as vias de recuperação e reciclagem que apresentam mecanismos muito mais complexos de acúmulo de ceramidas a partir de catabolismo de esfingolipídeos, envolvendo a participação de várias enzimas.. 10. a) Dickson, R. C. Annu. Rev. Biochem. 1988, 67, 27-48; b) Koroniak, K.; Haufe, G. Synthesis 2010, 19, 3309-3314. Dobrowsky, R. T.; Kolesnick, R. N. Methods Cell. Biol. 2001, 66, 135-165. Futerman, A. H.; Riezman, H. Trends Cell Biol. 2005, 15, 312-318. 11. 8.

(32) Via De novo (retículo endoplasmático) O HO. O O. NH3. Serina + Palmitoil-CoA. 13. S. Via Esfingomielinase. CoA. Reciclagem da Ceramida Exógena C6-ceramida. Esfingomielina. Serina palmitoil-CoA aciltransferase. ceramidase. O. 3-cetoesfinganina. 13. 3-cetoesfinganina redutase Diidroesfingosina (esfinganina). OH. OH NH 2. Esfingomielina sintase. Esfingomielinase. OH. 12. NH 2. Esfingosina. OH 13. OH NH 2. Diidroceramida sintase Diidroceramida Diidroceramida desaturase Glucosilceramida. Ác. β-g lu. cosida s. Via de Recuperação (endossomos/lisossomos) e. e Ác. c. Esfingosina. ase ramid. OH 12. OH NH 2. Ceramida Ác. es. fing om ielin. Esfingolipídeos complexos. ase. Esfingomielina. Figura 4. Vias biossintéticas de ceramidas. Quimicamente, ceramidas pertencem a classe de esfingolipídeos, caracterizam-se por apresentar uma cadeia esfingosina (também conhecida como base esfingóide), constituída de uma longa cadeia carbônica e uma extremidade polar, na qual se encontram grupamentos hidroxilas e amina, de configuração relativa e absoluta bem determinadas. Normalmente, o grupamento amino está acilado com um ácido graxo de cadeia longa, formando uma função amida (Figura 5). Existem diversas subclasses de ceramidas que consistem na variação da posição dos substituintes, na quantidade de insaturações e de grupos hidroxilas, há ainda, na diferenças de comprimento das. 9.

(33) cadeias carbônicas e da porção acila (Figura 5). Essas características afetam sua capacidade de interação principalmente no fator de permeabilidade, visto que as ceramidas estão entre os lipídeos mais hidrofóbicos, porém sua cabeça polar tem a habilidade de formar uma rede de ligações de hidrogênio conferindo a esta um carácter anfipático. Comumente, o tamanho da cadeia do ácido graxo é especificado no nome, sendo este precedido pelo número de átomos de carbono.12 OH. OH HO. HO. C 13H 27 Base Esfingóide. HN. C2-esfingosina O. C15H31 HN C16-diidro-esfingosina. O. OH. OH C14H29. HO NH O. C12H25. HO. OH. C6-fitoesfingosina. NH O. OH C8-6-hidroxi-esfingosina. Figura 5. Alguns exemplos de classes de ceramidas naturais. Visto que, ceramidas são conhecidas como mediadores de apoptose em muitos modelos e, considerando que o estado epiléptico induz uma série de eventos que levam. 12. a) Hannun, Y.A.; Obeid, L.M. Nature Rev. Mol. Cell Biol. 2008, 9, 139-150; b) Kitatani, K.; Idkowiak-Baldys, J.; Hannun, Y. A. Cellular Signalling 2008, 20, 1010-1018; c) Zhang, Y.; Li, X.; Becker, K. A.; Gulbins, E. Biochim. Biophys. Acta 2009, 1788, 178-183; d) Zheng, W.; Kollmeyer, J.; Symolon, H.; Momin, A.; Munter, E.; Wang, E.; Kelly, S.; Allegood, J.C.; Liu, Y.; Peng, Q.; Ramaraju, H.; Sullards, M.C.; Cabot, M.; Merrill, A. H. Biochim. Biophys. Acta 2006, 1758, 1864-1884.. 10.

(34) a morte celular programada, seu estudo e suas sínteses tornam-se extremamente relevantes para a compreensão dos mecanismos da epilepsia.13. 1.3.. Precedentes de Pesquisa. 1.3.1. Primeira Síntese Convergente – Ceramida isolada: Negombata corticata Em setembro de 2010, Ghosal e cols.14 descreveram a primeira síntese total para a ceramida 1b baseada em duas importantes reações de formação de ligação C-C, a reação de Wittig e a reação de metátese cruzada de olefinas. Uma estratégia de pool quiral, partindo do 3,4,6-tri-O-benzil-D-galactal, após uma reação de hidratação seguida de uma metilação de Wittig, conduziu ao álcool derivado 4. Este, por sua vez, através de uma reação de Mitsunobu (SN2), gerou a funcionalidade amino para a subsequente desproteção e acilação, obtendo-se assim o fragmento polar da ceramida (7). Sua preparação deu-se em 5 etapas, com 47% de rendimento global (Esquema 1).. 13. Mikati, M. A.; Zeinieh, M.; Habib, R. A.; El Hokayem, J.; Rahmeh, A.; El Sabban, M.; Usta, J.; Dbaibo, G. Epilepsy Res. 2008, 81, 161-166. 14 Ghosal, P.; Kumar, V.; Shaw, A. K. Tetrahedron 2010, 66, 7504-7509.. 11.

(35) Esquema 1. Síntese do fragmento polar da ceramida 1b por Ghosal e cols.. Para o fragmento apolar, eles partiram do 1,12-dodecanodiol 8 foi monoprotegido e em seguida oxidado ao respectivo aldeído 10. Esse foi empregado como substrato em uma reação de Wittig na presença de um fosfonato adequado para formar o alceno 11. Esse último foi desprotegido, submetido a uma reação de hidrogenação da ligação dupla e oxidação da hidroxila primária para fornecer o aldeído 14, que foi utilizado como substrato para uma outra reação de olefinação de Wittig, fornecendo a olefina 15. A cadeia alquílica foi obtida em um total de 7 etapas com rendimento global de 36% (Esquema 2).. 12.

(36) Esquema 2. Síntese da cadeia longa da ceramida 1b por Ghosal e cols.. Por fim, utilizando o catalisador de Grubbs de segunda geração (5 mol %), os fragmentos 7 e 15 foram reunidos por meio da reação de metátese cruzada, seguida de hidrogenação, formando a ceramida 1b em 4% de rendimento global (Esquema 6). Problemas de solubilidade foram encontrados na hidrogenação e, principalmente, na purificação. Para contornar esses problemas a ceramida 1b foi acetilada. O derivado triacetil 17 foi obtido em 7% de rendimento global.. 13.

(37) Esquema 3. Síntese convergente da ceramida 1b por Ghosal e cols.. 1.3.2. Propostas Sintéticas. Devido à importância biológica das ceramidas, apresentando variadas atividades biológicas tais como, antifúngica, antitumoral, antiviral, propriedades citotóxicas, entre outras, existem diversas abordagens sintéticas para a preparação de esfingosídeos e derivados descritas na literatura.15 Há exemplos que utilizam-se de reações aldólicas, reações de Grignard, enzimas, entre outros.16 Em 1990, Koskinen e Krische17 apresentaram a síntese do esqueleto de um esfingosídeo, partindo de um derivado da serina, através da reação de Horner-. 15. a) Cheng, S.; Wen, Z.: Chiou, S.; Tsai, C.; Wang, S.; Hsu, C.; Dai, C.; Chiang, M. Y.; Wang, W.; Duh, C. J. Nat. Prod. 2009, 72, 465-468; b) Rives, A.; Ladeira, S.; Levade, T.; Andrieu-Abadie, N.; Génisson, Y. J. Org. Chem. 2010, 75, 79207923; c) Ceccarelli, S.M.; Chomienne, O.; Gubler, M.; Arduini, A. J. Med. Chem. 2011, 54, 3109-3152; d) Jervis, P. J.; Cox, L. R.; Besra, G.S. J. Org. Chem. 2011, 76, 320-323. 16 a) Bakke, M.; Takizawa, M.; Sugai, T.; Ohta, H. J. Org. Chem. 1998, 63, 6929-6938 e referências citadas; b) Enders, D.; Paleček, J.; Grondal, C. Chem. Commun. 2006, 655-657 e referências citadas; c) Ghosal, P.; Shaw, A. K. Tetrahedron Lett. 2010, 51, 4140-4142. d) Yoshimitsu, Y.; Inuki, S.; Oishi, S.; Fujii, N.;Ohno, H. J. Org. Chem. 2010, 75, 3843-3846; e) O’Reilly, C.; Murphy, P. V. Org. Lett. 2011, 13, 5168-5171; f) Moreno, M.; Murruzzu, C.; Riera, A. Org. Lett. 2011, 13, 5184-5187. 17 Koskinen, A. M.; Krische, M. J. Synlett 1990, 665-666.. 14.

(38) Wadsworth-Emmons. Assim, baseado em seus trabalhos, Drewes e cols.18 propuseram uma estratégia para a preparação de precursores de esfingosídeos utilizando também um derivado da serina, mas agora tendo como base a reação de Morita-Baylis-Hillman (MBH). Koskinen e Krische O. O O O. a O. NBoc. Drewes e cols. O P OMe OMe. HO H. O. NBoc. O. NBoc. O. R. O. NBoc 23. 22. b. O. a. 19. 18. HO. O. Aduto MBH. R. c O. NBoc. O. NBoc. OH 20. HO. 21. 24. R= n-Pr, 70% R= n-C13H27, 80% Reagentes e condições: a) (MeO)2P=OCH2 Li , THF, 83% b) RCHO, K2CO3, CH3CN; c) L-Selectride, THF, -78 0C. NH2 CO2Me. Precursor de esfingosídeos Reagentes e condições: a) Acrilato de metila, DABCO. Esquema 4. Proposta de Drewes baseada nos resultados do Koskinen e Krische. O grupo de Drewes teve como intenção estudar a reatividade de amino aldeídos cíclicos quirais frente a reação de MBH, e observar a pureza enantiomérica dos produtos. Apesar de interessante, a proposta apresentada nunca foi utilizada para a síntese total de esfingosídeos, ceramidas e quaisquer outros derivados dessas moléculas. Na reação, a conversão completa era observada apenas após 7 dias, obtendose 72 % de rendimento. No entanto, o valor de rotação ótica específica, do diastereoisômero majoritário (anti) foi baixo, [α]D20 -1,9 (c 0,54; CHCl3), indicando a 18. Drewes, S. E.; Khan, A. A.; Rowland, K. Synth. Commun. 1993, 23, 183-188.. 15.

(39) ocorrência de racemização no carbono α do aldeído. Ele examinou o produto com reagente de deslocamento quiral, [Eu(hFc)3], e comprovou por estes estudos com análise por ressonância magnética nuclear (RMN) utilizando európio, que o aduto não estava enantiomericamente puro.. 1.4.. Reação de Morita-Baylis-Hillman (MBH). A reação de Morita-Baylis-Hillman vem sendo alvo de interesse científico há alguns anos, principalmente dado à alta funcionalidade dos produtos formados e a sua praticidade experimental. A reação de MBH, conhecida desde o início da década de 7019 pode ser definida basicamente como uma reação de condensação entre carbonos eletrofílicos sp2 de um aldeído ou de uma imina e a posição α de uma olefina contendo grupo retirador de elétrons (derivado acrílico), ativada por um catalisador (amina ou fosfina terciária), levando à formação de uma nova ligação C-C σ (Esquema 5).20. Esquema 5. Reação de MBH. 19. a) Baylis, A. B.; Hillman, M. E. D. German Patent 2155113, 1972 (C.A.. 1972, 77, 34174q). Para revisão da reação de MBH: a) Almeida, W. P.; Coelho, F. Quím. Nova 2000, 23, 98-103; b) Basavaiah, D.; Rao, A. J.; Satyanarayana, T. Chem. Rev. 2003, 103, 811-891; c) Basavaiah, D.; Reddy, B.S.; Badsara, S. S. Chem. Rev. 2010, 110, 5447-5674; d) Basavaiah, D.; Veeraraghavaiah, G. Chem. Soc. Rev. 2011, DOI: 10.1039/C1CS15174F. 20. 16.

(40) Em 1963, Rauhut e Currier21 descreveram, em uma patente, uma reação de dimerização de alcenos ativados, catalisada por fosfinas. Esse processo se inicia com uma reação de adição 1,4 seguida por uma nova adição de Michael do enolato formado a uma segunda molécula de olefina. O produto de dimerização é formado após uma etapa de transferência de próton, seguida de eliminação. Então, baseado nessa observação, em 1968, Morita publicou os primeiros resultados de um processo envolvendo sistemas acrílicos e adiçao aldólica sobre um aldeído, utilizando uma fosfina como catalisador (tricicloexilfosfina). Embora, atualmente, essa reação seja mais conhecida por Baylis-Hillman (aminas terciárias como catalisador), deve-se, no entanto, creditar os méritos dessa reação também a Morita, que fez o primeiro relato dessa reação. 22 A reação de MBH apresenta características que evidenciam sua vantagem como método sintético, tais como: ser régio- e quimiosseletiva; apresentar uma economia de átomos, melhorada ainda mais pela recuperação do acrilato utilizado em excesso, e do ponto de vista estrutural, providencia moléculas polifuncionalizadas de grande interesse sintético. Experimentalmente, esta também é bastante viável pois requer condições reacionais brandas. Essa reação vem sendo alvo de vários estudos a fim de se estabelecer condições ainda mais favoráveis para o seu manuseio, otimizar e ampliar o escopo, e desenvolver versões assimétricas, visto que um novo centro estereogênico é formado no processo.. 21. Rauhut, M.; Currier, H. U. S. Patent 3,074,999, 1963. Revisão sobre essa reação, ver: Aroyan, C. E.; Dermenci, A.; Miller, S. J. Tetrahedron. 2009, 65, 4069-4084. 22 Morita, K.; Suzuki, Z,; Hirose, H. Bull. Chem. Soc. Jpn. 1968, 41, 2815.. 17.

(41) 1.4.1. Mecanismo da reação de MBH Em estudos independentes, Aggarwal e colaboradores,23 e o grupo de McQuade,24 propuseram versões para orientar a ocorrência da reação de MBH (Esquema 6). O mecanismo consiste basicamente em uma primeira etapa de adição de Michael do catalisador (amina terciária (I) ou fosfina) ao sistema α,β-insaturado II, gerando o zwitterion III. Em seguida, uma adição aldólica entre III e o aldeído IV gera o alcóxido V, o que leva a etapa seguinte, transferência de próton e eliminação. McQuade e cols. encontraram um efeito isotópico cinético (EIC) primário máximo de 5,2 ± 0,6 para o próton α-carbonila do sistema acrílico para a reação feita em DMSO (dimetilsulfóxido). Esse trabalho ainda demonstrou que a reação de MBH era de segunda ordem em relação ao aldeído e que a etapa de transferência de próton era a etapa determinante da velocidade da reação, explicando também a formação de dioxanonas, produtos cíclicos obtidos quando bons grupos abandonadores, estavam presentes no sistema acrílico. Visto que ocorre a formação de um hemiacetal VIII que pode agora sofrer uma transferência de próton por um estado de transição cíclico de seis membros, de menor energia se comparado ao estado de transição de 4 membros proposto por Hoffmann,25 e corroborado por Hill e Isaacs.26 O arranjo estrutural representado pelo estado de transição VIII (Esquema 6) decompõe-se para a formação do intermediário IX, que perde uma molécula de aldeído para fornecer o aduto de MBH VI ou faz um ataque nucleofílico ao grupo carbonílico conduzindo a dioxanona, isolada 23. a) Aggarwal, V. K.; Dean, D. K.; Mereu, A.; Williams R. J. Org. Chem. 2002, 67, 510-514. b) Aggarwal, V. K.; Emme, I.; Fulford, S. Y. J. Org. Chem. 2003, 68, 692-700. c) Aggarwal, V. K.; Fulford, S. Y.; Lloyd-Jones, G. C. Angew. Chem. Int. Ed. 2005, 44, 1706-1708. 24 a) Price, K. E.; Broadwater S. J.; Walker, B. J.; McQuade, D. T. J. Org. Chem. 2005, 70, 3980-3987; b) Price, K. E.; Broadwater, S. J.; Jung, H. M.; McQuade, D. T. Org. Lett. 2005, 7, 147-150. 25 Hoffmann, H. M R.; Rabe, J. Angew. Chem. Int. Ed. 1983, 22, 795-796. 26 Hill, J. S.; Isaacs, N. S. J. Phys. Org. Chem. 1990, 3, 285-290.. 18.

(42) como subproduto. Esse ataque é dependente da eficiência do grupo de saída ligado ao éster. No entanto, ainda era preciso explicar como a reação perdia esse efeito cinético isotópico em conversões mais altas ou tempos maiores de reação. Em trabalho independente, o grupo de Aggarwal, através de novos experimentos cinéticos suportados por cálculos teóricos, propuseram que a reação era autocatalítica a partir de 20% de conversão, ou seja, sabendo que fontes de próton aceleravam as reações, foi proposto que o próprio aduto de MBH (VII, Esquema 6), ou qualquer outra fonte de próton seria capaz de assistir a etapa de transferência de próton via um intermediário cíclico de seis membros. Esta constatação explica o efeito de aceleração na reação de MBH em presença de solventes próticos e como estes atuam na etapa lenta da reação. Nosso grupo de pesquisa vem realizando uma série de contribuições para melhor compreender o mecanismo da reação de MBH.27 Através de experimentos de espectrometria de massas sequencial, todos os intermediários mais importantes propostos por McQuade e Aggarwal puderam ser devidamente caracterizados.. 27. a) Amarante, G. W.; Milagre, H. M. S.; Vaz, B. G.; Ferreira, B. R. V.; Eberlin, M. N.; Coelho, F. J. Org. Chem. 2009, 74, 3031-3037; b) Amarante, G. W.; Benassi, M.; Milagre, H. M. S.; Braga, A. A. C.; Maseras, F.; Eberlin, M. N.; Coelho, F. Chem. Eur. J. 2009, 15, 12460-12469; c) Santos, L. S.; Pavam, C. H.; Almeida, W. P.; Coelho, F.; Eberlin, M. N. Angew. Chem. Int. Ed. 2004, 43, 4330-4333.. 19.

(43) Esquema 6. Propostas para o mecanismo da reação de MBH. Mais recentemente, Cantillo e Kappe28 sugeriram, a partir de cálculos teóricos (M06-2X), que na presença de bons doadores de prótons, como, por exemplo, fenol, a reação poderia ter a etapa de condensação aldólica como determinante da velocidade da reação. 28. Cantillo, D.; Kappe, O. J. Org. Chem. 2010, 75, 8615-8626.. 20.

(44) Algumas questões vem sendo respondidas, como por exemplo, que a reação passa por um mecanismo “dualístico”, ou seja, a transferência de prótons pode ocorrer com a participação de doadores de prótons ou de uma segunda molécula de aldeído, dependendo das condições reacionais. Sugere-se que em baixas conversões a transferência de próton seja feita com uma segunda molécula de aldeído, e em altas conversões com fontes de próton, que poderia ser o próprio aduto de MBH. Em contrapartida, ainda não se sabe quando cessa um mecanismo e se inicia o outro, e a hipótese mais aceita é que os dois podem ocorrer concomitantemente em determinado estágio. Outra questão que deve ser considerada é de que ainda existe muita discussão acerca da etapa determinante de velocidade da reação, e não se pode descartar a hipótese de que a condensação aldólica seja-a, em alguns momentos da reação. Importante também ressaltar que a elucidação completa do mecanismo de reação, e de como direcioná-lo alterando-se suas condições reacionais, são passos muito importantes na busca de uma versão geral assimétrica para a reação, aumentando ainda mais o seu escopo como metodologia sintética. Contudo, fica claro que conclusões acerca do mecanismo desta reação ainda estão em aberto na literatura, sendo de grande interesse da comunidade científica estabelecê-las.. 2. OBJETIVO O relato de Drewes18 é o único disponível na literatura que relaciona adutos de Morita-Baylis-Hillman a essa importante classe de moléculas naturais. A relevância das ceramidas em geral e, especificamente daquelas isoladas por Ahmed e cols.,9 nos levaram a reconsiderar o uso de um aduto de Morita-Baylis-Hillman como substrato para a sua síntese. Haja vista que foi desenvolvido em nosso laboratório um método de. 21.

(45) preparação desses adutos.29 Neste não fora observada racemização devido ao estabelecimento de um protocolo reacional que utiliza ultrassom para a aceleração das reações de MBH, o que diminui consideravelmente o tempo de exposição desses aldeídos quirais com a base catalisadora. Assim, esse trabalho tem por objetivo a síntese, inicialmente, da fração polar comum às duas ceramidas com atividade antiepiléptica, isoladas por Ahmed e cols., a partir de modificações em um aduto de Morita-Baylis-Hillman. E, em um segundo momento, preparar uma cadeia de carbono presente nas moléculas naturais, através de uma reação de Grignard. Esta será passível de um acoplamento de Wittig com o fragmento polar, conduzindo a base esfingóide.. 29. a) Almeida, W. P.; Coelho, F. Tetrahedron Lett. 2003, 44, 937-940; b) Coelho, F.; Diaz, G.; Abella, C. A. M.; Almeida, W. P. Synlett 2006, 3, 435-439.. 22.

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