یسبیً بضزیلع
يف ُذکؽًاد ،یرٍبٌف تعیزذؼرا ضبٌؼربک یکؼسپ مَلػ ُبگؽًاد ،یکؼسپ يیًَ یبّ یرٍآ
ىاریا ،ىبگرگ ،ىبتعلگ
سزهازف ربغَّک
،یظبٌؼ لگًا یارتکد یَدؽًاد تبقیقحت سکره
مَلػ یّبگؽیبهزآ یکؼسپ مَلػ ُبگؽًاد ،
ىاریا ،ىبگرگ ،ىبتعلگ
زف یربفغ ِوطبف
،یکؼسپ ُذکؽًاد ،یکؼسپ یظبٌؼ لگًا ربیؽًاد ىاریا ،ىارْت ،ضرذه تیثرت ُبگؽًاد
یبیزج راشّ ییبیض زجبّ
لگًا ٍُرگ ،یکؼسپ یظبٌؼ لگًا ربیدبتظا ،یکؼسپ ُذکؽًاد ،یظبٌؼ ذربق ٍ یظبٌؼ ىاریا ،یربظ ،ىارذًزبه یکؼسپ مَلػ ُبگؽًاد
ىبیزگغه ِوطبف
ضبٌؼربک سکره ،یکؼسپ یظبٌؼ لگًا ذؼرا یکؼسپ مَلػ ُبگؽًاد ، ضٍٍبک ذجٌگ تؼاذْث
ىاریا ،ىبگرگ ،ىبتعلگ
یًبجزج سبیً لغٍا
،یکؼسپ یظبٌؼ لگًا ربیدبتظا تبقیقحت سکره
بگؽیبهزآ مَلػ یّ
یکؼسپ مَلػ ُبگؽًاد ، ىاریا ،ىبگرگ ،ىبتعلگ
لغٍا :لَئغه ُذٌغیًَ یًبجزج سبیً
:کیًٍزتکلا تغپ [email protected]
:يفلت
4436102 -0171
:طردآ
ه ــ کر ــ حت س ــ تبقیق یّبگؽیبهزآ مَلػ ُبگؽًاد ،
،ىبگرگ ،ىبتعلگ یکؼسپ مَلػ ىاریا
:تفبیرد 12 / 9 / 92
:یًبیبپ ؼیازیٍ 26
/ 9 / 92
:ػزیذپ 27 / 9 / 92 ُذیکچ
فذّ ٍ ٌِیهس :
یارث ییلاع دراذًبتظا غٍر ،تؽک بث ُاروّ یپَکظٍرکیه غٍر
غٍر ِلوخ زا یلَکله یبّ غٍر زا ُدبفتظا . تظا بیًبوؽیل لگًا صیخؽت
RT-PCR
غٍر بث ِعیبقه رد یربویث يیا صیخؽت یارث ٍ تیظبعح زا یپَکظٍرکیه یبّ
یگصیٍ
ٍ ىآ تاسیْدت یًارگ ِث ِخَت بث بها .تظا رادرَخرث یرتلابث ىآ مبدًا یارث ِک یًبهز
یه فرص ُدبفتظا .ددرگ یوً رارق ُدبفتظا درَه ُدرتعگ ترَص ِث دَؼ زا
رث یریثکت غٍر
کیئلکًَ ذیظا ی ِیبپ
( NASBA )
يیٌچوّ ٍ رلکیبظَهرت ُبگتظد ِث زبیً مذػ لیلد ِث
یاراد ،ُذًز لگًا ییبظبٌؼ غزرا
،ِؼلبغه يیا زا فذّ .تظا ییلابث یظررث
ٍ تیظبعح
صیٍ یگ
NASBA
.ذؼبث یه یذلخ طیزَیًبوؽیل لهبػ یلَکله صیخؽت یارث
ػٍر یعرزب :
زا 28 ،یذلخ طیزَیًبوؽیل ِث کَکؽه یتظَپ نخز ًَِوً
RNA
ی ِیحبً یارث ُذؼ یحارع یصبصتخا یبّرویارپ کوک ِث طپظ .ذؼ جارختظا لگًا
18srRNA
ث ِیحبً يیا ،بیًبوؽیل ِ
لبهرتٍسیا ػٌکاٍ ی ِلیظٍ
NASBA
رارق ریثکت درَه
ث یریثکت ػٌکاٍ لَصحه ،تیظبعح ػیاسفا تْخ رد ٍ تفرگ ِ
طًبظرَلف ةٍرپ ِلیظٍ
یلَکله
SYBER Gold
رفبث رد
TBE(1X)
زا ُدبفتظا بث يیٌچوّ .ذؼ زرَفٍرتکلا
ػٌکاٍ بّ ًَِوً یٍر رث ،یصبصتخا یبّرویارپ
RT-PCR
.ذؼ مبدًا سیً
بّ ِتفبی :
ِؼلبغه يیارد غٍر
NASBA
غٍر ٍ
RT-PCR
لگًا صیخؽت یارث
نخز رد بیًبوؽیل تیظبعح زا تیترت ِث
81 ذصرد ٍ 51 ٍ ذصرد یگصیٍ 100 ذصرد
رادرَخرث ذًدَث .
:یزیگ ِجیتً
لبهرتٍسیا غٍر
NASBA
ٍ تیظبعح بث یگصیٍ
ییبظبٌؼ رَظٌه ِث لابث
ؽیل ىاَت یه یذلخ زَیًبو .درک ُدبفتظا
یبّ ُصاٍ :یذیلک
یذلخ طیزَیًبوؽیل ،
NASBA
،
18S rRNA.
یاراد ِبتر یولع – یؾٍّضپ
سا ىَیغیوک مَلع تبیزؾً
یکؽشپ رَؾک
یببیسرا ٍ تیعبغح ذیعا ِیبپ زب یزیثکت ػٍر یگضیٍ
کیئلکًَ یذلج ظیسَیًبوؾیل لهبع صیخؾت یازب
:ِلبقه طردآ
یزبیً ،ع ربعَّک ،ف رف یربفغ ،ف یجیرخ راسّ ییبیض ،ُ
ىبیرگعه ،ف یًبخرخ ا " یثبیزرا ٍ تیظبعح یگصیٍ غٍر ذیظا ِیبپ رث یریثکت کیئلکًَ
یذلخ طیزَیًبوؽیل لهبػ صیخؽت یارث "
ىبتعثبت،یّبگؽیبهزآ مَلػ ِلده 1393
ُربوؼ(نتؽّ ُرٍد ، 2
:) 20 -26
ِهذقه ریبظ زا یتظَپ طیزَیًبوؽیل یقارتفا یبّ صیخؽت
یبّ نخز ٍ تظَپ ىبعرظ ،زٍرپل ذًٌبه ِثبؽه یبّ یربویث
تظا تیوّا لثبق کیهذًا قعبٌه رد طیزَلکرثَت (
1 .)
ث بیًبوؽیل لگًا صیخؽت ِ
ُاروّ یپَکظٍرکیه غٍر ِلیظٍ
ث ،تؽک بث ِ
لیلد یگصیٍ .تظا ییلاع دراذًبتظا لابث
ػیبهزآ یبّ یه مبدًا نخز ًَِوً يتفرگ بث یپَکظٍرکیه
یپَکظٍرکیه .دَؼ یه مبدًا یعپَیث تؽک یّبگ .دریگ صیخؽت یارث یؼٍر ىاٌَػ ِث کیهذًآ قعبٌه رد نّ زٌَّ
ا یذلخ طیزَیًبوؽیل یبّ غٍر اریز دَؼ یه ُدبفتظ
يیًَ
ٍ ىارگ ،ُذیچیپ ترذً ِث
غٍر .ذٌؼبث یه ضرتظد لثبق
اد یپَکظٍرکیه یظبعح یار
یگتعث ِک ،ذؼبث یه نک ت ِث
ٍ یریگ ًَِوً َُحً ،نخز ًَِوً رد لگًا یگذٌکارپ ٍ داذؼت (دراد ریگ ًَِوً صخؼ تربْه 1
، 2 .) یبّ غٍر ه
یلَکل
ربکث طیزبیًبوؽیل صیخؽت یارث یتٍبفته ،دٍر یه
یگزبت ِث
رث یٌتجه یبّ غٍر
PCR
ٍ
PCR-RFLP
صیخؽت رد
(ددرگ یه ُدبفتظا طیزبیًبوؽیل 3 -5 .) غٍر PCR رد
ىبهرد زا لجق بیًبوؽیل لگًا طٌخ ٍ ًَِگ یقارتفا صیخؽت
ٍ تیظبعح یاراد یگصیٍ
لابث ی .ذؼبث یه ی
PCR
ِک یًبهز
تؽک ٍ یپکظٍرکیه غٍر زا رتْث ،ذؼبث نک یلگًا ربث
( تظا 6 يیٌچوّ .) غٍر يیا
یدارفا رد بیًبوؽیل صیخؽت رد
بث کرتؽه تًَفػ ِک زذیا
( دٍر یه ربکث ذًراد 7
-10 )
گ ُزاذًا بث سیً ىبثسیه تفبث رد لگًا یری غٍر PCR مبدًا یه ( ددرگ 9 یه ِک یًبهز بها ) ٍ بٍّراد یؽخث رثا نیّاَخ
یثبیزرا درَه ُذًز لگًا ذیبث نیٌک یظررث ار ىبهرد حیبتً
ترَص يیا رد .دریگ رارق
RNA ِث DNA دراد تیحخرا اریز DNA ( یًلاَع تذه بت 24
بی ٍ ذؼث تػبظ سیً )رتؽیث
(تظا یزبظاذخ لثبق 11
). ،ریخا یبّ ِّد رد ییبظبٌؼ یارث
RNA
بیًبوؽیل لگًا غٍر
Time PCR
ٍ یحارع
( تظا ِتفبی ِؼظَت 12
بها .)
RT-PCR
ىارگ ُبگتظد ِث ِتعثاٍ
ٍ رَؽک قعبٌه ِوّ رد يیارثبٌث ،ذؼبث یه رلکیبظَهرت تویق
ث ــ ُصیٍ ِ ک یهَث قعبٌه ــ
یه رت فیؼض یدبصتقا ػبحل زا ِ
یزاذًا ُار ٍ ُبگتظد ذیرخ ىبکها ذٌؼبث
PCR
.دراذً دَخٍ
ث ــ نیقتعه ملا ذًٌبه ضبعحریغ یبّ غٍر زا نّ زٌَّ يیارثبٌ .دَؼ یه ُدبفتظا نعیًبگراٍرکیه يیا صیخؽت تْخ
لاَصا " غٍر ُذًز لگًا ییبظبٌؼ ِث ردبق ِک ییبّ ،ذٌتعّ
رٍآ یه دَخَث کؼسپ یارث ار ىبکها يیا ً
ِهبًرث ِک ذ
ّد رارق تربظً تحت یثَخ ِث ار بٍّراد رثا یثبیزرا ٌ
.ذ رد
ح لبح ــ يیث ِک یتبفلاتخا لیلد ِث بٍّراد یثبیزرا یارث ،رضب
خظبپ مذػ لیجق زا یتلاکؽه ،دراد دَخٍ بیًبوؽیل یبّ ًَِگ
یٌیلبث فلتخه لبکؼا ،ىبهرد ِث حیحص تهٍبقه بی یربویث
دَؼ یه ُذّبؽه ییٍراد .
یارث یدراذًبتظا رضبح لبح رد
غٍر کی يیارثبٌث ٍ دراذً دَخٍ ىاربویث یؼغق ىبهرد ذییبت
بث ٍ ضبعح ،غیرظ یصیخؽت یگصیٍ
ردبق ِک لابث ذؼبث
ضح ــ یث رد ار ُذًز یبّ لگًا رَ ــ
درَه ذّد صیخؽت ىاربو
( تظا زبیً 13
) . ث ریثکت غٍر ــ پ ر ــ ِیب ت ی ــ یبّذیظا یلاَ کیئلکًَ ( NASBA ) فٍرؼه زا یکی غٍر يیرت
یبّ
ىآ رد ِک ذؼبث یه یریثکت لبهرتٍسیا
RNA
کت ظیارؼ رد
هد ــ ً ىٍذث ٍ ب ــ
نیسًآ ِظ ظظَت ،رلکیبظَهرت ِث زبی
ؼه رادرث تؼًٍَر ــ ضَک ( RT ) ، RNaseH ٍ
T7 RNA
POL
.دَؼ یه ریثکت غٍر رد
NASBA
، کوک ِث اذتثا
تیلبؼف
DNA
ِث ِتعثاٍ یزارویلپ
RNA ، نیسًآ RT کی ٍ ،رویارپ ِتؼر کی DNA لوکه RNA
.دَؼ یه ِتخبظ َگلا
طپظ
RNA
ذیرجیّ رد دَخَه
DNA-RNA
ث ِ ِلیظٍ
RNaseH
دت درَه ـ ق ِیس ــ گ رار ــ کوک ِث ربث يیا ٍ ِتفر
تیلبؼف DNA عثاٍ یزارویلپ ــ ِث ِت DNA نیسًآ RT کی ٍ
رتَهٍرپ ِث لصته تظبٌه رویارپ
T7
یٍر زا ،
DNA
کت
که ِتؼر ،ِتؼر ــ
ظ ىآ لو ــ
خب ــ .دَؼ یه ِت ث
ا ِ تیترت يی
کی
DNA
ؼر ٍد ــ ىآ رظ کی ِث ِک دَؼ یه لصبح یا ِت
رتَهٍرپ T7 ه ــ ه لصت ــ ظ .ذؼبث ی ــ
یا یٍر زا طپ ــ
ي
DNA
ؼر ٍد ــ ت یا ِت ــ ًآ ظظَ ــ یس ــ ن T7 RNA ت زارویلپ ــ ؼ ــ داذ یز ــ یدب RNA ظ ــ خب ـــ ه ِت ــ ؼ ی ــ یا ٍ دَ ــ ظ ي ــ لکی ت ــ ک ــ ه رار ــ گ ی ــ (ددر 14 ّ .) ــ یا زا فذ ــ
ه ي ـ ــ ـ لبغ ـــ ،ِؼ ث ــ ــ یظرر یٍ ــ ــ گص ــ ی عح ٍ ــ یظب ــ ــ ت غٍر ٍد ت ــ ک ـ یریث NASBA (
nucleic acid sequence-based amplification
)
ٍ
RT-PCR
(
Reverse Transcriptase-PCR
) رد ٌؼ ــ ظب ــ ییب 18srRNA یل ــ ه بیًبوؽ ــ رٍشب دَــث .
ُرٍد ،یّبگؾیبهسآ مَلع ِلجه نتؾّ ُربوؽ( 2 ) ىبتغببت 93
زا لصبح یتظَپ یبّ ًَِوً 28
کَکؽه یتظَپ نخز
تؼاذْث سکره زا یذلخ طیزَیًبوؽیل ِث ذجٌگ ىبتظرْؼ
بث ُاروّ یپَکظٍرکیه یبّ غٍر ِث ٍ ذؼ یرٍآ غوخ
،تؽک
NASBA
،
RT-PCR
یظررث ذًذؼ . دراذًبتظا ًَِوً
(رٍشبه بیًبوؽیل
MRHO/IR/75/ER
) لرتٌک تخبظ یارث
ه ــ ث .ذؼ ِیْت ضرذه تیثرت ُبگؽًاد زا تجث مبدًا یار
ػٌکاٍ یریثکت یبّ
NASBA
،
RT-PCR
رویارپ ٍد ِث زبیً
Forward
ٍ
Reverse
یلجق تبؼلبغه کوک بث ،ذؼبث یه
یبّراسفا مرً کوک بث رَع يیوّ ٍ ُذؼ مبدًا
Primer3
ٍ
يیٌچوّ
Gene Runner
رویارپ ٍد ،
Forward
ٍ
Reverse
،ذؼ یحارع ِیحبً یاذتثا رد ٍ
' 5 رویارپ
Reverse
زبیًدرَه
ػٌکاٍ یارث
NASBA
یلاَت
T7
.تفرگ رارق رتَهٍرپ
يیارثبٌث
RNA
یبّ ث ُذؼ ذیلَت ِ
ػٌکاٍ ِلیظٍ
NASBA
،
لوکه
RNA
لٍذخ (.ذٌؼبث یه َگلا 1
) یتظَپ یبّ ًَِوً
خ ضحه ِث ــ
ىٍرد رد ىاربویث نخز زا یزبظاذ
RNA Later
stabilization reagent(QIAGEN)
ذٌتفرگ رارق .
جارختظا
RNA
زا ُدبفتظا بث ،بّ ًَِوً زا
RNeasy plus mini
kit(QIAGEN)
قجع رث ٍ ربک غٍر
ترَص ًِبخربک
تفرگ . اذتثا ،تیک تجثه لرتٌک تخبظ یارث
DNA
ًَِوً زا
غیبه ظیحه رد ُذؼ ُداد تؽک رٍشبه بیًبوؽیل دراذًبتظا
RPMI 1640
یاراد 10 بت 20 ذصرد
FBS
( 100 یٌپ ذحاٍ
رد يیلیظ
mL
ٍ 100 ذٌچ رد يیعیبهَتپرتظا مرگ ٍرکیه
ُدبفتظا بث طپظ ٍ ذؼ ِیْت) رتیل یلیه یٍر رث بّ رویارپ زا
ىآ
PCR
یهبوت تیترت يیذث .ذؼ مبدًا تلاَصحه
PCR
، یلاَت یاراد دَخ یبْتًا کی رد
T7 Promoter
یه
.ذٌؼبث زا ُدبفتظا بث طپظ ربک غٍر
ندح رد ریز
25µl
رث
ىآ یٍر
Invitro Transcription
.تفرگ ترَص
NTP mix (Fermentas) 25uM, Transcription buffer
(Fermentase) 10uM, DNA 1ug,T7 RNA
Polymerase(Fermentase) 30U
ٍ
RNase inhibitor 0.5U
،
تذه ِث داَه تیکرت زا طپ ِک 2
رد تػبظ 37
ِخرد
.ذؼ ِثَکًا
یارث ػٌکاٍ
NASBA
یٍر رث
RNA
زا ُذؼ جارختظا
قثبغه ،تجثه لرتٌک ٍ بّ ًَِوً ربک غٍر
ریز ندح رد
20µl
.تفرگ مبدًا
TRIS-HCL(PH 8.6) 50Mm,Mgcl2 6mM,KCL
70mM,RNase inhibitor 20U,DTT 10mM,DMSO
13%,NTP 0.5mM, dNTP 1mM,each primer
0.5mM,BSA 5mM,RT 10U,RNaseH 0.4U,T7 RNA POL 10U,sorbitol 1.7%,RNA 1uM.
طَلخه ِیْت زا طپ
تذه ِث ،ػٌکاٍ 5
رد ِقیقد 65 تذه ِث طپظ ٍ ِخرد 90
رد ِقیقد 41 زا طپ .دریگ مبدًا ػٌکاٍ بت ،ذؼ ِثَکًا ِخرد
لَصحه ،ػٌکاٍ مبدًا
RNA
لش یٍر رث ُذهآ تظذث
گآ ــ ب زٍر 2 ذصرد تکلا ـ ،ىآ مبدًا طپ ٍ ذؼ زرَفٍر ث
ِ
ذلگرجیبظ ی ِلیظٍ
Invitrogene)
) ذؼ یسیهآ گًر .
ػٌکاٍ
RT-PCR
تیک زا ُدبفتظا بث
cDNA synthesis
،زبتٌهرف تکرؼ یٍر زا
RNA
،بّ
cDNA
ٍ ذؼ ِتخبظ
تیک زا ُدبفتظا بث طپظ
SapphireAmp Fast PCR
یٍر رث ،اربکبت تکرؼ
cDNA
بّ ،
PCR
.ذؼ مبدًا
یلاَت مبً یلاَت
F primer NASBA/RT-PCR
5'-CCAAAGTGTGGAGATCGAAG-3'
R Primer RT-PCR 5'-AGGGCCGGTAAAGGCCGAATAG-3'
R primer NASBA
5'AATTCTAATACGACTCACTATAGGGAGAAGGGCCGGTAAAGGCCGAATAG-3' لٍذج
1 ؼٌکاٍ رد ُدبفتعا درَه یبّزویازپ NASBA
ٍ RT-PCR .
یعرزب ػٍر
ُرٍد ،یّبگؾیبهسآ مَلع ِلجه نتؾّ
ُربوؽ( 2 ) ىبتغببت 93
بّ ِتفبی زا ِک داد ىبؽً یظررث يیا حیبتً 28
ِث کَکؽه ًَِوً
،یذلخ طیزَیًبوؽیل نخز 27
یپَکظٍرکیه غٍر ِث درَه
ٍ تجثه تؽک بث ُاروّ 1
غٍر بث ٍ ذؼ یفٌه ًَِوً
RT-PCR
داذؼت 14 ذًذؼ غراسگ یفٌه ِیقث ٍ تجثه درَه
غٍر بث يیٌچوّ
NASBA
22 یفٌه ِیقث ٍ تجثه درَه
ِک داد ىبؽً حیبتً .ذًذؼ
NASBA
ٍ
RT-PCR
زا تیترت ِث
تیظبعح 81
ٍ ذصرد 51 تیصبصتخا ٍ ذصرد 100
ذصرد
ٍ تیصبصتخا ی ًِبؽً حیبتً يیا ِک.تظا رادرَخرث
لَجق لثبق تیظبعح
NASBA
ه رد بث ِعیبق
RT-PCR
.تظا
ثحب رث یٌتجه یذلخ طیزَیًبوؽیل صیخؽت ،لٍاذته رَع ِث
تظَپ یبّ ًَِوً زا بیًبوؽیل لگًا یپَکظٍرکیه یبّ غٍر ٍ ُدَث ضبعح ریغ بّ غٍر يیا .تظبّ نخز ُریپظآ بی
( تظا یًلاَع تقٍ فرص مسلتعه سیً لگًا تؽک 15
زا .)
غٍر زا زٌَّ ،رگید یَظ عحریغ یبّ
یپَکظٍرکیه ضب ٍ
ُدبفتظا رٍشبه بیًبوؽیل ییبظبٌؼ یارث ،تؽک تذه یًلاَع
.دَؼ یه یصیخؽت غٍر ِچرگا یپَکظٍرکیه غٍر
ظ ــ ه یؼیر ــ ٌییبپ ربیعث تیظبعح زا بها ،ذؼبث ی ــ
رادرَخرث ی ریوظا رد لگًا ىاسیه ِک یدراَه رد ٍ تظا
ِؼلبغه درَه
یفبک صصخت زا يیعٌکت ِک یدراَه رد بی ذؼبث نک
یفٌه بی ةربک تجثه ِث ردٌه ذًاَت یه ،ذؼبجً رادرَخرث
ث ،رگید یَظ زا .ددرگ غراسگ رد ةربک ِ
غٍر ِلیظٍ
تبیح یظررث ىَچوّ یدراَه یپَکظٍرکیه
ِؼلبغه لثبق ،ىبهرد ِث خظبپ ریظ یظررث ٍ نعیًبگراٍرکیه
ید فرع زا .تعیً تیظبعح زا تؽک غٍر ِچرگا ،رگ
ذؼ ِتفگ ِک رَغًبوّ یلٍ ،تظا رادرَخرث ییلابث ربیعث
رد .ذجلع یه نعیًبگراٍرکیه صیخؽت تْخ ار یدبیز ىبهز
یبّ غٍر ،ریخا یبّ ِّد
RT-PCR
لگًا ییبظبٌؼ یارث
ییبّرَؽک رد ٍ تظا ِتفبی ِؼظَت ٍ یحارع بیًبوؽیل
ِک
PCR
یخؽت راسثا ،تظا یظرتظد لثبق یوْه یص
(ذٌتعّ 16 -18 بها .)
RT-PCR
تویق ىارگ ُبگتظد ِث ِتعثاٍ
ٍ رَؽک قعبٌه ِوّ رد يیارثبٌث ،ذؼبث یه رلکیبظَهرت
بصَصخ " رت فیؼض یدبصتقا ػبحل زا ِک یهَث قعبٌه
یه یزاذًا ُار ٍ ُبگتظد ذیرخ ىبکها ذٌؼبث
PCR
دَخٍ
.دراذً غٍر بٌؼ ِث ردبق ِک ییبّ ،ذٌتعّ ُذًز لگًا ییبظ
ىبکها يیا ِهبًرث ِک درٍآ یه دَخَث کؼسپ یارث ار
یثبیزرا
لکؽ 1 -ػٍر NASBA زیثکت ٍ ییبعبٌؽ رد RNA
رٍصبه بیًبوؾیل .
ُربوؽ ًَِوً 1
ؼٌکاٍ یفٌه لزتٌک، NASBA
، ُربوؽ ًَِوً 2
، یلَکله ىسٍ صخبؽ RNA
100 بت
1000 ًَِوً ، 3 لَصحه ، NASBA ( 202bp ) 202bp
ُرٍد ،یّبگؾیبهسآ مَلع ِلجه نتؾّ
ُربوؽ( 2 ) ىبتغببت 93
.ذّد رارق تربظً تحت یثَخ ِث ار بٍّراد رثا
Mary
ٍ
ىاربکوّ لبظ رد
2004 ِث لاتجه ىاربویث یٍر یظررث رد
ِک ذًداد ىبؽً مَتًبفٌیا بیًبوؽیل تیظبعح
غٍر
PCR
real-time
تیوک يییؼت یارث مَتًبفٌیا بیًبوؽیل
0125 / 0 لگًا رد
رتیل یلیه تظا
غٍر يیا يیارثبٌث یارث
یظررث
کیشَلَیهذیپا فاذّا ٍ
یصیخؽت ، یارث ُصیٍ ِث زا فیرؼت
Parasitemia
حَغظ رد يییبپ
لَع رد یریگیپ
زا طپ
(ذؼبث یه ذیفه ربیعث ىبهرد 20
لبظ رد .) 2008
Van der
Meide
یٍر رث یظررث کی رد ىاربکوّ ٍ 85
بث( ربویث
يظ 16 بت 65 ذًدَث یذلخ طیزَیًبوؽیل ِث لاتجه ِک )لبظ
غٍر یبّ
RT-PCR
ٍ
PCR
صیخؽت یارث ار
ِک ذًداد ىبؽً ٍ ذًدرک ِعیبقه طیزَیًبوؽیل ٍ تیظبعح
یگصیٍ غٍر
PCR
( 62 بت % 71 زا رتوک صیخؽت یارث ) %
غٍر
RT-PCR
( 82 بت % 85 ؼبث یه )% ( ذ
21 )
Mugasa
ٍ
یٍر رث یظررث کی رد ىاربکوّ 50
ٍ یًَخ ًَِوً 75
غٍر ،ىاربویث تظَپ یعپَیث ًَِوً
NASBA
یارث ار
ِک ذًدرک غراسگ ٍ ذًدرک ُدبفتظا طیزَیًبوؽیل صیخؽت
رث غٍر يیا یگصیٍ ٍ تیظبعح یا
ىاربویث ىَخ یبّ ًِ َوً
تیترت ِث طیزَیًبوؽیل ِث لاتجه 3
/ 93 ذصرد ٍ 100 ذصرد ٍ
تیترت ِث لاتجه ىاربویث تظَپ یعپَیث یبّ ًَِوً یٍر رث
6 / 98 ذصرد ، 100 ذصرد ( ذؼبث یه 22
يیٌچوّ .)
Saad
ٍ
غٍر ىاربکوّ
NASBA
ىاربویث یبّ ًَِوً یٍر رث ار
ٍ یذلخ ،ییبؽحا طیزًَبوؽیل ِث ُذؼ ذییأت ٍ کَکؽه
PKDL(Post-kala-azar dermal leishmaniasis)
دارفا ٍ
یارث ار غٍر يیا یگصیٍ ٍ تیظبعح .ذًدرک یثبیزرا نلبظ
5. Singh S, Dey A, Sivakumar R. Applications of molecular methods for Leishmania control. Exp Rev Mol. Diagn. 2005; 5(2): 251–265.
6.Cruz I, Morales MA, Noguer I, Rodríguez A, Alvar J. Alvar. Leishmania in discarded syringes from intravenous drug users. Lancet. 2002; 359(1):1124-1125. 7. Garcia AL, Kindt A, Quispe-Tintaya KW, Bermudez H, Llanos A, Arevalo J, Bañuls AL, De Doncker S, Le Ray D, Dujardin JC. American tegumentary leishmaniasis: antigen-gene polymorphism, taxonomy and clinical pleomorphism. Infect Genet Evol. 2005; 5(2): 109-116.
8. De Doncker S, Hutse V, Abdellati S, Rijal S, Singh Karki BM, Decuypere S, et al. A new PCR-ELISA for diagnosis of visceral leishmaniasis in blood of HIV-negative subjects. Trans R Soc Trop Med Hyg. 2005; 99(6): 25–31 .
ٍ ىَخ ،فٌل یبّ ًَِوً یٍر رث طیزَیًبوؽیل صیخؽت
( ذًدرک غراسگ لابث ربیعث تفبث 23
سیً ِؼلبغه يیا حیبتً .)
غٍر ِک داد ىبؽً
NASBA
تیظبعح زا 81
ٍ ذصرد
یگصیٍ 100 .تظا رادرَخرث ذصرد زا یکبح حیبتً يیا
غٍر لَجق لثبق تیظبعح
NASBA
غٍر بث ِعیبقه رد
RT-PCR
.تظا ضبعح غٍر یریگربک ِث
NASBA
، یه
صیخؽت ٍ یًبهرد یبّ ِهبًرث ریثبت ٍ یثبیزرا یارث ذًاَت
ىبهرد ِیلٍا ،قفَهبً یبّ
.ذؼبث ِتؼاد یدبیز ریثبت دراذًبتظا بث
ِلوخ زا لبهرتٍسیا یبّ غٍر ىذؼ
NASBA
، صیخؽت رد
،ییبیرتکبث یبّ تًَفػ ِیلٍا ِلوخ زا یلگًا ٍ یظٍریٍ
اَت یه بیًبوؽیل غٍر يیسگیبخ ار غٍر يیا ى
یبّ
غٍر ِلوخ زا ضبعحریغ یبّ غٍر ٍ یپَکظٍرکیه یبّ
.دَؼ تؽک ِلوخ زا تذه یًلاَع
یزیگ ِجیتً لبهرتٍسیا غٍر
NASBA
ٍ تیظبعح بث یگصیٍ
ِث لابث
درث ربک ِث ىاَت یه یذلخ زَیًبوؽیل ییبظبٌؼ رَظٌه .
يیا
ُدبظ تبًبکها بث رَؽک قعبٌه ٍ بّ ُبگؽیبهزآ ِوّ رد غٍر
.تظا مبدًا لثبق ،یّبگؽیبهزآ
یًادرذق ٍ زکؾت ِلبقه يیا لصبح
حرع ةَصه ُربوؼ( 2631 / 35
خیربت 19 / 11 / 90 ُبگؽًاد یرٍبٌف ٍ تبقیقحت تًٍبؼه رد)
ذؼرا یظبٌؼربک ِهبً ىبیبپ يیٌچوّ ٍ ىبتعلگ یکؼسپ مَلػ
یرٍبٌف تعیز ِتؼر یکؼسپ
ذؼبث یه . نًبخ زا بدٌیا رد
سکره ٍ یرٍبٌف تعیز ُبگؽیبهزآ ضبٌؼربک ذًش ُربظ
دَؼ یه رکؽت ٍ ریذقت ذجٌگ ىبتظرْؼ تؼاذْث .
References
1.Faber WR, Oskam L, Gool T, Kroon NCM, Knegt-Junk KJ, Hofwegen H, et al. Value of diagnostic techniques for coetaneous Leishmaniasis. J Am Acad Dermatol. 2003;49(1):70-4.
2. Mendonça MG, Brito MEF, Rodrigues EHG, Bandeira V, Jardim ML, Abath FGC. Persistence of Leishmania parasites in scars after clinical cure of American coetaneous Leishmaniasis: Is there a sterile cure? J Infect Dis. 2004;189:1018-23.
3. Schallig HD, Oskam L. Molecular biological
applications in the diagnosis and control of
Leishmaniasis and parasite identification. Trop Med Int. 2002;7(8):641-51.
4. Aransay AM, Scoulica E, Tselentis Y. Detection and identification of Leishmania DNA within naturally infected flies. Appl Environ Microbiol. 2002; 66(5): 1933-8.
ُرٍد ،یّبگؾیبهسآ مَلع ِلجه نتؾّ
ُربوؽ( 2 ) ىبتغببت 93
17. Faber WR, Oskam L, Gool T, Kroon NCM, Knegt-Junk KJ, Hofwegen H, et al. Value of diagnostic techniques for coetaneous Leishmaniasis. J Am Acad Dermatol. 2003; 49(1):70-4.
18. Mary C, Faraut F, Lascombe L, Dumon H.
Quantification of Leishmania infantum DNA by a real-time PCR assay with high sensitivity. J Clin Microbiol. 2004; 42(7): 5249–5255.
19. Khosravi S, Hejazi SH, Hashemzadeh M, Eslami G, Darani HY. Molecular diagnosis of Old World leishmaniasis: real-time PCR based on tryparedoxin peroxidase gene for the detection and identification of Leishmania spp. J Vector Borne Dis. 2012; 49(1): 15-8. 20. Mary C, Faraut F, Lascombe L, Dumon H.
Quantification of Leishmania infantum DNA by a real-time PCR assay with high sensitivity. J Clin Microbiol. 2004; 42: 5249-5255.
21. Van der Meide W, Guerra J, Schoone G, Farenhorst M, Coelho L, Faber W, et al. Comparison between quantitative nucleic acid sequence-based amplification, real-time reverse transcriptase PCR, and real-time PCR for quantification of Leishmania parasites. J Clin Microbiol. 2008; 46(1): 73-8.
22. Mugasa CM, Laurent T, Schoone GJ, Basiye FL, Saad AA, El Safi S, et al. Simplified molecular detection of Leishmania parasites in various clinical samples from patients with leishmaniasis. Parasit Vectors. 2010; 3(1): 1-6.
23. Saad AA, Ahmed NG, Osman OS, Al-Basheer AA, Hamad A, Deborggraeve S, et al. Diagnostic Accuracy of
the Leishmania OligoC-TesT and
NASBAOligochromatography for Diagnosis of
Leishmaniasis in Sudan. PLoS Negl Trop Dis. 2010; 4(8):1-5.
9. Bossolasco S, Gaiera G, Olchini D, Gulletta M, Martello L, Bestetti A, et al. Real-time PCR assay for clinical management of human immunodeficiency virus-infected patients with visceral leishmaniasis. J Clin Microbiol. 2003; 41(2): 5080–5084.
10. Schubach A, Haddad F, Oliveira-Neto MP, Degrave W, Pirmez C, Grimaldi G Jr, et al. Detection of Leishmania DNA by polymerase chain reaction in scars of treated human patients. J Infect Dis. 1998; 178(3): 911-914.
11. Laskay T, Mikó TL, Negesse Y, Solbach W, Röllinghoff M, Frommel D. Detection of cutaneous Leishmania infection in paraffinembedded skin biopsies using the polymerase chain reaction. Trans R Soc Trop Med Hyg. 1995; 89(1): 273-275.
12. Faber WR, Oskam L, Gool T, Kroon NCM, Knegt-Junk KJ, Hofwegen H, et al. Value of diagnostic techniques for coetaneous Leishmaniasis. J Am Acad Dermatol. 2003; 49(1): 70-4.
13.Croft SL. Monitoring drug resistance in Leishmaniasis. Trop Med Int Health. 2001; 6(11): 899-905.
14.Gill P, Ghaemi A. Nucleic Acid Isothermal Amplification Technologies - a Review. Nucleosids, Nucleotides & Nucleic Acids. 2008; 27(3): 224-243. 15.Schallig HD, Oskam L. Molecular biological applications in the diagnosis and control of Leishmaniasis and parasite identification. Trop Med Int. 2002; 7(8): 641-51.
16.Mendonça MG, Brito MEF, Rodrigues EHG, Bandeira V, Jardim ML, Abath FGC. Persistence of Leishmania parasites in scars after clinical cure of American coetaneous Leishmaniasis: Is there a sterile cure? J Infect Dis. 2004; 189: 1018-23.
ُرٍد ،یّبگؾیبهسآ مَلع ِلجه نتؾّ
ُربوؽ( 2 ) ىبتغببت 93
Sensitivity and Specificity of Nucleic Acid Sequence-Based Amplification Method for Diagnosis of Cutaneous Leishmaniasis
Abstract
Background and Objective: Culture, microscopic method is a gold standard method for identification of Lishmania parasite. The use of Molecular methods such as RT- PCR compared to microscopic methods has a higher sensitivity and specificity; however, it is not widely used due to its expensive equipment and the time requested. The use of nucleic acid sequence based amplification (NASBA) method is highly valuable for diagnosis of live parasite because there is no need for to use Thermo cycler. We aimed to assess sensitivity and specificity of NASBA for molecular detection of cutaneous Leishmaniasis.
Material and Methods: First, the RNA was extracted from 28 skin biopsies suspected cutaneous Leishmaniasis. Then, by means of specific primers designed for 18srRNA region, this region was amplified using NASBA isothemal amplification. To increase the sensitivity, the product was electroforesed in TBE (IX) buffer, using Syber Gold Flourecent probes. Using specific primers, RT- PCR was conducted on the samples too.
Result: For diagnosis of Leishmania parasites, NASBA and RT-PCR had the sensitivity of 81% and 51%, respectively, and specificity of 100%.
Conclusion: NASBA isothermal method with high sensitivity and specificity can be applied for identification of cutaneous leishmaniasis.
Keywords: Cutaneous Leishmanisis, NASBA, 18S rRNA
Niazi, A. (MSc)
MSc of Medical Biotechnology, Faculty of Advanced Medical Technologies,
Golestan University of Medical Sciences, Gorgan, Iran
PhD Student of Parasitology, Laboratory Science Research Center, Golestan University of Medical Sciences, Gorgan,
Iran
Ghaffarifar, F. (PhD)
Associate Professor of Parasitology, Faculty of Medical Sciences, Tarbiat Modares University, Tehran, Iran
Ziaei-Hezarjaribi, H. (PhD)
Assistant Professor of Parasitology, Deo of Parasitology, School of Medicine,
Mazandaran University of Medical Sciences, Sari, Iran
Mesgarian, F. (MSc)
MSc of Parasitology, Gonbad Health Center, Golestan University of Medical
Sciences, Gorgan, Iran
Jorjani, O. (PhD)
Assistant Professor of Parasitology, Laboratory Science Research Center,
Golestan University of Medical Sciences, Gorgan, Iran
Corresponding Author: Jorjani, O.
Email: [email protected]
Received: 3 Dec 2013 Revised: 17 Dec 2013 Accepted: 18 Dec 2013
This paper should be cited as: Niazi A, Koohsar F, Ghaffarifar F, Ziaei-Hezarjaribi H, Mesgarian F, Jorjani O. [Sensitivity and Specificity of Nucleic Acid Sequence-Based Amplification Method for Diagnosis of Cutaneous Leishmaniasis]. MLJ. 2014; 8(2):20-26 [Article in Persian]