A Parameter optimization strategy

Se reunieron 6 voluntarios sanos, los cuales debieron consumir su último alimento al menos 12 horas antes del inicio del ensayo. Se les pidió enjuagarse la boca con agua justo antes de masticar la muestra.

Los voluntarios masticaron 2.5 g de la muestra (Tortilla de mMaíz

nNixtamalizada, Tortilla de sSorgo nNixtamalizada, Harina cCruda de sSorgo y Tortilla de sSorgo eExtrudida con 60% Hum a 10 rpm) 15 veces, durante 15 segundos, descargando el contenido en un vaso. Inmediatamente después, cada sujeto se enjuagó la boca

por 60 segundos con otros 5 mL de agua destilada (Figura 30), siendo desechado ese líquido en una tarja. Posteriormente se mezclaron las suspensiones de cada muestra en un solo vaso. Además se preparó un blanco en el cual se utilizará

Con formato: Sangría: Primera línea: 1,25 cm

Con formato: Sangría: Sangría francesa: 1,27 cm

Con formato: Fuente: 12 pto, Resaltar

Con formato: Título 3, Izquierda, Sangría: Izquierda: 0 cm

Comentario [MG7]: formato Con formato: Fuente: (Predeterminado) +Cuerpo, Sin Negrita, Sin Expandido / Comprimido , Resaltar

Con formato: Fuente: 12 pto, Resaltar

Con formato: Fuente: (Predeterminado) Arial, 12 pto

Con formato: Sangría: Izquierda: 0,23 cm, Primera línea: 1,25 cm, Sin viñetas ni numeración

Con formato: Fuente: (Predeterminado) Arial, 12 pto

Con formato: Sangría: Izquierda: 0,48 cm, Sangría francesa: 1,27 cm

Con formato: Sangría: Primera línea: 1,25 cm

solamente agua destilada en lugar de muestra y se seguirá el procedimiento descrito anteriormente.

Figura 30. Material utilizado para depositar muestras.

1.18.33.13.4 Estómago in vitro

Posteriormente, 10 ml de la suspensión anterior, se les añadió una solución de HCl 2N en cantidad necesaria para bajar el pH a 2.0. La pepsina (Sigma) se disolvió en 0.94 ml de HCl 20mM y se añadió 0.055 g a cada muestra para después ser incubadas con agitación durante 2 horas a 37°C. Se realizaron tres experimentos independientes por triplicado. (Figura 31).

Figura 31.Tubos de ensayo en incubación.

1.18.43.13.5 Intestino Delgado ex vivo

Con formato: Fuente:

(Predeterminado) +Cuerpo, 11 pto, Cursiva

Con formato: Normal, Izquierda

Con formato: Punto de tabulación: No en 2,25 cm

Con formato: Sangría: Primera línea: 0,77 cm

Con formato: Espacio Antes: 0 pto, Después: 0 pto

Con formato: Espacio Después: 0 pto

Con formato: Punto de tabulación: No en 2,25 cm

Se preparó un extracto intestinal por disolución de 3 mg de hiel de Buey más 2.6 mg de pancreatina, los cuales fueron disueltos en 5 ml de solución tampón de Krebs-Ringer [conteniendo 118 mM NaCl, 4.7 mM KCl, 1.2 mM MgSO4, 1.2 mM KH2PO4, 25 mM NaHCO3, 11 mM glucosa y 2.5 mM CaCl2, pH 6.8 (se preparará 30 min antes de utilizarse)].

De esta solución (5 ml) se añadió a cada muestra y al blanco; la suspensión (15 ml) fue transferida a un recipiente que contenía un saco intestinal invertido, el cual se preparó siguiendo la metodología descrita por Patil et al., 2010. Se utilizaron 6 ratas (por cada tratamiento) macho de la cepa Wistar (250-300 g de peso) (Figura 34), que tenían un ayuno de 16 h con agua ad libitum. Para el sacrificio las ratas fueron anestesiadas (pentobarbital 60mg/kg) y el intestino fue expuesto por una incisión abdominal en la línea media, posteriormente un segmento de 20-30 cm del yeyuno proximal de cada rata fue escindido y se colocó en la solución tampón de Krebs-Ringer gasificado con CO2 a 37C (Figura 33a). El intestino fue lavado con la misma solución tampón para retirar residuos. El intestino se volteará suavemente sobre una varilla de vidrio, y se cortará un segmento de longitud de aproximadamente 10 cm y se ligarán de un extremo (este procedimiento se realizará con el intestino sumergido en el buffer para evitar la pérdida de viabilidad del tejido como se muestra en la figura 33b). El intestino fue llenado con 2 mL de la solución tampón de Krebs-Ringer. El otro extremo del intestino se ligó para crear un saco, el cual será inmediatamente incubado en un baño conteniendo los 15ml de la suspensión anterior, a 37oC por 2 horas, en agitación continua (80 ciclos por minuto) y en atmosfera anaerobia (CO2).

Con formato: Sangría: Primera línea: 1 cm

Con formato: Espacio Antes: 0 pto, Después: 0 pto

Figura 32.Incisión abdominal en la línea media para la extracción del intestino delgado. FunteFuente: http://www.biologycorner.com

Después del periodo de incubación, los sacos fueron retirados y la parte de las muestras contenida en el recipiente (posterior a retirar el saco intestinal), se denominó fracción no digerible (FND) se realizó un SDS-PAGE de la FND y se comparó con la muestra antes de la digestión. Se realizó tres experimentos independientes por triplicado.

Con formato: Izquierda

Con formato: Izquierda

Con formato: Sangría: Primera línea: 1,25 cm

Figura 33.a) Lado izquierdo: Peso del intestino de rata; b) Lado derecho: Intestionos delgados de rata sumergidos en suspesión tampón de Krebs-Ringer.

Para los métodos descritos anteriormente (estomago in vivo e intestino delgado ex vivo), se realizaron la cuantificación de proteínas por el Bradford a los 30, 60, 90 y 120 min, para boca solo se cuantifico la saliva y la muestra masticada.

1.18.53.13.6 Manejo de los animales después del sacrificio

Puesto que solo fue de interés para este estudio el intestino de los animales, los restos de las ratas no utilizados fueron destinados a desecho, se almacenaron en una bolsa grande color amarillo en un congelador (temperatura máxima 4°C), la bolsa se marcó con la leyenda “desechos biológicos”, éstas fueron almacenadas por un periodo de 15 días hasta su debido transporte e incineración (NOM-087-ECOL-SSA1-2002). El material quirúrgico utilizado se dejó remojar con cloro durante 12 h, posteriormente se lavó y esterilizó para su posterior almacenamiento.

Con formato: Sangría: Izquierda: 0,48 cm, Primera línea: 0,77 cm

Con formato: Sangría: Izquierda: 0,48 cm

Con formato: Sangría: Izquierda: 0,23 cm, Primera línea: 1,02 cm

Figura 34. Ratas macho cepa Wistar.