Chapter 6. Conclusion
6.2 Acknowledgement of Limitations of the Study and Suggestions for Future Research
2.1. Las CCAP-INs se generan en todos los segmentos y no re-
quieren de ningún gen homeótico para su especificación
El patrón de expresión de las neuronas CCAP/Bursicón presenta variaciones a lo largo el eje antero- posterior. Mientras las CCAP-INs están presentes en todos los segmentos del CNV, desde el S1 al A7, las CCAP-NEs solo aparecen en los segmentos T3-A4 en larva de primer estadio y T3-A7 en pupa. En este trabajo mostramos que las CCAP-INs no se alteran ante la falta de función de ningún gen homeótico. Estas neuronas muestran también un patrón de expresión silvestre cuando elimina- mos conjuntamente varios genes homeóticos o los expresamos ectópicamente. Concluimos por tanto que las CCAP-INs no requieren la expresión de ningún gen homeótico para su especificación.
La mayoría de los neuropéptidos presentan un patrón restringido en el eje antero-posterior. Ejemplos de ello son la expresión de Leucoquinina la cual se da en los segmentos A1-7, la expresión de FMRFamida en los segmentos T1-3, o la expresión de Capability en los segmentos A2-4 (revisado por (Nassel and Winther, 2010)). Existen sin embargo algunas excepciones como son el Neuropepti- de-like precursor 1, presente en la mayoría de segmentos y el neuropéptido Proctolin expresado por unas 400 células de la CNV (Nassel and Winther, 2010). La presencia de las CCAP-INs en todos los segmentos del la CNV sugiere que estas células participan en circuitos neurales repetidos de manera segmental. Aunque se desconoce las células con las cuales realizan conexiones, se ha descrito que en larva de tercer estadio las CCAP-INs emiten dos proyecciones, una proyección longitudinal a lo largo de los fascículos mediales dorsales y ventrales que acaba uniéndose con el resto de proyecciones longitudinales en los segmentos A8/9; y una proyección medial que forma extensas arborizaciones en alrededor de la línea media, entre los fascículos mediales dorsales y ventrales (Vomel and Wege- ner, 2007). Además, se conoce que el receptor del CCAP es un receptor acoplado a la proteína G y codificado por el gen CG6111 (Cazzamali et al., 2003; Park et al., 2002). Sería interesante estudiar el patrón de expresión de este receptor y conocer cuáles son las células que requieren de su función.
En este trabajo y utilizando no encontramos diferencias entre las CCAP-INs de los distintos hemisegmentos. Teniendo en cuenta que utilizamos únicamente la expresión de CCAP y Bursicón para indentificar estas neuronas, es posible que si pudieramos analizar otras caracterísitcas como la axonación o la expresión de otros marcadores, encontraramos diferencias entre ellas. De hecho, se
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han descrito singularidades para alguna de ellas en estadios más avandos del desarrollo. Luan et al. observaron que únicamente las CCAP-INs del segmento S3 mantienen la expresión de Bursicón en el estadio de pupa (Luan et al., 2006a) y producen terminales axónicas que se expanden por toda la CNV. Paralelamente, Kim et al. describieron que el péptido mioinhibitorio (MIP) se expresa exclusi- vamente en las CCAP-INs del T3 al A4 (Kim et al., 2006). Es probable que los genes Scr y Ubx, que se expresan en los segmentos S2-S3 y T2-A7 respectivamente realicen una función en la especifica- ción de estos dos grupos de neuronas CCAP-INs que no hemos identificado en este estudio.
2.2. Ubx y abd-A evitan la apoptosis de las CCAP-NEs en los seg-
mentos T3-A7
En este trabajo mostramos que la expresión de Ubx en la neurona es suficiente para evitar la apoptosis de las CCAP-NEs. Por una parte, su expresión ectópica provoca la aparición de CCAP-NEs en los segmentos anteriores, mientras que su falta de función conlleva la pérdida de las CCAP-NEs de los segmentos T3 y A1. Asimismo, dobles mutantes para Ubx y abd-A no presentan ninguna CCAP- NEs por lo que concluimos que la falta de función de Ubx es rescatada por la expresión abd-A en los segmentos A2-A4. Este mismo modelo de redundancia tiene lugar en la especificación de las neuro- nas ABLKs (Estacio-Gomez et al., 2013). Nuestos resultados indican que Ubx y abd-A también ase- guran la supervivencia de las CCAP-ENs de los segmenots A5-A7 dado que en mutantes para Ubx,
abd-A y Abd-B no observamos ninguna CCAP-ENs en la CNV. Además Ubx se expresa tanto en el
linaje temprano como en el NB 3-5 de los segmentos T3-A7 y en mutantes Ubx, Abd-B en los que la expresión de abd-A no está afectada pudimos indentificar CCAP-ENs en los segmentos A2-A7. En larva de tercer estadio no observamos expresión de Ubx en la CCAP-ENs del segmento T3. Este dato sugiere que Ubx y abd-A realizan su función anti-apoptótica en un momento concreto del desarrollo y que no se requiere su expresión de forma constante para la activación de los neuropéptidos CCAP y Bursicón. Contrariamente a las neuronas CCAP/Bursicón, se ha descrito que en las neuronas ABLKs, la expresión de Ubx y abd-A debe mantenerse para asegurar la expresión de Leucoquinina (Estacio-Gomez, 2013).
Resulta sorprendente que la expresión ectópica de Abd-A impida la especificación de las neu- ronas CCAP/Bursicón. Es posibles que los niveles de expresión de Abd-A ectópicos, mucho más altos que endógenos, interfieran en la especificación de estas neuronas. Otra alternativa es que la expresión de Abd-A se requiera en un momento preciso del desarrollo y que la expresión permanente en la neurona comprometa su especificación. Se ha demostrado que la expresión de los genes homeóticos genera distintos efectos dependiendo del momento en el que se produzca. Los NBs abdominales postembrionarios, entre los que se encuentra el NB 5-5 (Estacio-Gomez et al., 2013), mueren por apoptosis tras un pulso de expresión de Abd-A (Bello et al., 2003). Sin embargo, la expresión ectó- pica de Abd-A durante la embriogénesis evita la entrada en quiescencia del NB 5-5 (Estacio-Gomez et al. 2013). Otro ejemplo son las neuronas GW del NB 7-3. En una situación silvestre, un pulso de expresión tardío de Ubx provoca su muerte por apoptosis mientras que, un pulso temprano de ex-
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presión ectópica de Ubx no tiene ningún efecto en su especificación (Rogulja-Ortmann et al., 2008). Cabe señalar que el papel que juega Ubx en la especificación de las motoneuronas GW regulando la apoptosis es contrario al que realiza en las neuronas CCAP/Bursicón. Sería por tanto interesante estudiar si los genes homeóticos contralan directa o indirectamente la activación de los genes proa- poptóticos, así como qué factores están modulando de la respuesta de estos últimos.