4.4 Estudio de la posible función de las endonucleasas en el desarrollo
de la retina.
La generación de roturas de la doble cadena del DNA en el sistema nervioso podría star dirigida por endonucleasas, de forma similar a lo que ocurre en el sistema
n de las endonucleasas/recombinasas RAG-1 y AG-2, que inician la recombinación somática en el sistema inmune.
Efectivamente, fuimos capaces de detectar los dos mRNAs correspondientes a dichas recombinasas en la retina, en todo el intervalo analizado. Como control positivo se empleó mRNA de timo y de bazo de ratones de P15, obteniendo el mismo resultado para ambos. Las condiciones de la reacción empleadas no permitieron detectar la presencia de estos transcritos en el músculo adulto (Fig. 4.40 A).
Los retrotransposones de la familia LINE-1 pueden contener dos marcos de lectura, ORF1 y ORF2, que codifican una partícula ribonucleoproteica y una proteína con actividad transcriptasa reversa respectivamente. La transciptasa reversa puede adicionalmente presentar actividad endonucleasa (Morrish et al., 2002). Por esta
encuentra en tejidos linfoides (Chun et al., 1991). Quisimos, por tanto, comprobar la identidad del e
inmune. Como primera aproximación para evaluar esta hipótesis, analizamos, mediante RT-PCR, la expresió
R
razón se buscó y detectó la presencia de un mRNA correspondiente a un retrotransposón LINE-1 que contenía los marcos de lectura ORF1 y ORF2 (Fig. 4.40 B).
La primera vez que se detectó la existencia de un trascrito de RAG-2 en el sistema observó que este era distinto, en tamaño, al que se
Resultados
A
Fig. 4.40- Expresión del mRNA de las endonucleasas RAG-1, RAG-2 y de un retrotransposón
se indican. Los cebadores empleados se indican en la tabla 3.I. C19-C20 para RAG-1; C21-C22 para RAG-2; C30-
resultados observados en 2-3 experimentos independientes.
amos. No encontramos diferencias en la secuencia de esta región
s que el mRNA de RAG-2 encontrado en la retina tiene la misma
B
LINE-1 en la retina de ratones silvestres C57Bl/6. Visualización en geles teñidos con bromuro de
etidio de los productos de la amplificación por RT-PCR de los mRNAs RAG-1, RAG-2 y de un mRNA de LINE-1 que comprende los dos marcos de lectura (ORF1 y ORF2). Las reacciones se llevaron a cabo con los tejidos y los estadios embrionarios y postnatales de ratones C57Bl/6 que
C31 para LINE-1; C38-C39 para GAPDH. Se realizaron controles –RT que fueron negativos en todos los casos (sólo se muestran algunos en la figura). La figura es un ejemplo representativo de los
mRNA de esta endonucleasa encontrado en la retina. Para ello amplificamos la región codificante completa de RAG-2, clonamos el producto de RT-PCR y lo secuenci
codificante entre el producto amplificado en la retina embrionaria y el presente en el bazo de ratones de P18 (Fig. 4.41 B). Por otro lado, las bases de datos indican la existencia de dos mRNAs alternativos de RAG-2. El canónico es aquel que mantiene el exón 2 en su región 5´ no traducida (Fig. 4.41 A). Comprobamos que el transcrito presente en la retina embrionaria era el que mayoritariamente se expresa en timo y bazo, el que contiene el exón 2 (Fig. 4.41 C). Por todo ello concluimo
identidad que el que se expresa en tejidos linfoides y, aunque no se detectó el producto proteico de este gen, nuestros resultados apoyan la hipótesis de que RAG-2 podría ejercer una función en la retina neural de ratón en desarrollo.
A
ón 2, incluido en la región 5´ no traducida ´UTR) (C). Las reacciones se llevaron a cabo con los tejidos y los estadios embrionarios y
representativo de los resultados observados en 2-3 experimentos independientes.
Fig. 4.41- Caracterización del mRNA de RAG-2 en la retina embrionario de ratones silvestres C57Bl/6. El panel superior (A) muestra una representación esquemática de los transcritos de RAG-2
existentes en las bases de datos, en la que se especifica la posición de la región codificante, así como la del resto de los exones. En los geles teñidos con bromuro de etidio se muestra la expresión de la región codificante completa de RAG-2 (B), así como la del ex
B
C
(5
postnatales de ratones C57Bl/6 que se indican. Los cebadores empleados se indican en la tabla 3.I. C23-C24 para cod RAG-2; C25-C26 para 5´UTR; C40-C41 para S16. Se realizaron controles –RT que fueron negativos en todos los casos y no se muestran en la figura. Los geles son un ejemplo
4.4.1 Estudio fenotípico del desarrollo de la retina de ratones
deficientes en RAG-2.
Para determinar la posible función de RAG-2 durante la neurogénesis temprana de la retina, analizamos el fenotipo de ratones mutantes nulos rag2-/-. Todos estos análisis se llevaron a cabo utilizando animales con bagaje genético C57Bl/10 (ver apartado 3.1 de la sección “Materiales y Métodos”).
Nos centramos en estudiar el fenotipo de los ratones deficientes en RAG-2 de estadio E13,5. Sólo se llevaron a cabo experimentos puntuales en otras etapas del desarrollo.
Resultados
4.4.1.1 Análisis de la expresión de γH2AX en la retina de ratones
deficientes en RAG-2.
Se llevó a cabo la inmunodetección de γH2AX en células disociadas de retina de estadio E13,5, procedentes de ratones mutantes y silvestres. La ausencia de RAG- 2 provocó una disminución significativa en el número de células γH2AX positivas, así como un descenso en el número de focos nucleares discretos (Fig. 4.42).
Fig. 4.42- Expresión de γH2AX en la retina de ratones C57Bl/10 silvestres y deficientes en RAG-
de retinas de estadio E13,5, procedentes de ratones silvestres (wt) y mutantes (ko). (A) Se representa
el caso de las células proliferativas γH2AX positivas. (C) Se representa la media ± SEM 100 células dos los casos se analizaron al menos