El Gráfico 7-5 presenta los perfiles cinéticos de la hidrólisis enzimática para Lenga y Eucalipto. En ellos se observa que a un mayor tiempo de hidrólisis, aumenta la cantidad de azúcares reductores obtenidos.
En el caso de Lenga, con 30 minutos de pretratamiento de hidrólisis ácida (caso A), a las 24 horas se ob- tienen entre el 10 y el 16% de los azúcares reductores totales a las 72 horas de sacarificación. Por otro lado, cuando se pretratan por 60 minutos de hidrólisis ácida (caso B), a las 24 horas se obtiene el 48% de los azúcares totales obtenidos a las 72 horas.
En el caso de Eucalipto, después de 30 minutos de hidrólisis ácida (caso C) se observa que entre 24 y 48 horas de reacción de hidrólisis enzimática no hay cambios en los azúcares liberados, dado que en pro- medio se tiene un aumento de los azúcares reductores de solo un 22%. De las 48 a las 72 horas de reac- ción se observa un aumento promedio de un 40% en los azúcares reductores liberados. Ahora bien, en el caso de 60 minutos de hidrólisis ácida (caso D) se tiene que desde las 24 a las 48 horas el aumento promedio de los azúcares reductores es de un 100% y de las 48 a las 72 horas es de solo un 15%, a ex- cepción del caso de la concentración de ácido sulfúrico del 0,75% v/v donde se tiene un aumento en la liberación de azúcares del 30%.
De los resultados descritos anteriormente y al comparar los tiempos de incubación con ácido sulfúrico, se tiene que para 30 minutos de pretratamiento existe una pendiente más pronunciada que para 60 minutos de pretratamiento, donde la curva a las 72 horas de operación se encuentra en un estado esta- cionario. Este hecho sugiere que la reacción de sacarificación hidrolizada por 30 minutos no ha termina- do a las 72 horas y por lo tanto, se podría seguir obteniendo azúcares desde los materiales.
Para explicar lo anterior se propone lo siguiente: para el caso de 60 minutos de hidrólisis ácida, se tiene que existe una mayor cantidad de celulosa disponible, dado que el pretratamiento actuó de mejor mane- ra en el caso de 60 minutos que para 30 minutos para las dos materias primas, liberando una mayor can- tidad de hemicelulosa del material. Al existir una mayor cantidad de celulosa, y dado que en todas las experiencias se utilizó la misma proporción de enzimas celulasas y celobiasa, (donde la celobiasa se en- carga de impedir la inhibición por exceso de celobiosa), es posible que en ese caso, la celobiasa no fue suficiente y ocurrió inhibición por producto.
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La literatura se refiere a la acción de cada una de las enzimas presentes en este coctel. Primero las endo- glucanasas hidrolizan el polímero de celulosa exponiendo extremos reductores y no reductores de un polímero lineal de glucosa, luego las exoglucanasas y celobiohidrolasas actúan sobre estos extremos y liberan dímeros de glucosa llamados celobiosa, y finalmente las glucosidasas (BGL) cortan estas uni- dades y generan glucosa, el producto final. El microorganismo que se utiliza en la producción comercial de estas enzimas produce muy bajas cantidades de BGL en comparación con las otras enzimas, y son inhibidas por su producto final celobiosa [52,53]. Producto de este control negativo la eficiencia de la hidrólisis enzimática no puede mejorarse significativamente por aumento de la carga, quedando parte de la enzima cargada inutilizada.
La hipótesis de la inhibición por producto se apoya en la comparación de los azúcares reductores libera- dos a las 24 horas de operación. Para Lenga se obtiene una mayor liberación de azúcares en 60 minutos de hidrólisis ácida que en 30 minutos de pretratamiento, es decir, existen una mayor cantidad de azúca- res disponibles en la fracción líquida del pretratamiento.
Otra explicación posible es que porque las enzimas celulolíticas degraden rápidamente las fracciones amorfas más accesibles del sustrato. Con el progreso de la hidrólisis, la celulosa se vuelve cada vez más resistente a la hidrólisis, como resultado de su creciente cristalinidad y por lo tanto no se siguen obte- niendo azúcares. Para comprobar la hipótesis del aumento de cristalinidad sería necesario realizar un análisis microscópico al material antes y después del tratamiento de hidrólisis enzimática [29].
Oros factores asociados a la naturaleza de la enzima y que influyen en la liberación de azúcares son la pureza, la inactivación térmica, la adsorción irreversible y la inhibición por producto; donde los factores más probables que pueden estar ocurriendo en este caso son la inhibición por producto y la adsorción irreversible.
De esta forma, la optimización de las condiciones de sacarificación para obtener una mayor cantidad de glucosa deberá ser estudiada en el futuro, dado que no se encuentra dentro de los alcances de este tra- bajo y constituye una etapa intermedia importante en la producción de etanol.
Por último, al modelar las curvas de la cinética de hidrólisis ácida (ver Anexo H) se desprende que en todos los casos se pudo seguir liberando azúcares posterior a las 72 horas de operación, siendo el caso de Lenga el más pronunciado. Este efecto se puede explicar dado que con Lenga el pretratamiento ácido funciona mejor, por lo tanto, existe una mayor cantidad de celulosa disponible para convertir en glucosa.
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Gráfico 7-5: Perfiles cinéticos de la hidrólisis enzimática de biomasa pretratada con distintas concentraciones de ácido sulfúrico
Caso (A) Lenga, 30 min de pretratamiento ácido, Caso (B) Lenga, 60 min de pretratamiento ácido, Caso (C): Eucalipto, 30 min de pretratamiento ácido, Caso (D): Eucalipto, 60 min de
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