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Appendix 3: Additional Estimation and Robustness Results
VIP ejerce funciones inmunomoduladoras actuando fundamentalmente como un potente factor antiinflamatorio (Delgado et al., 2004). Se ha demostrado que VIP protege de la neurodegeneración inducida por inflamación (Delgado y Ganea, 2003). En la encefalomielitis experimental autoinmune, enfermedad inflamatoria caracterizada por una desmielinización del cerebro, VIP ejerce un efecto protector de la mielina a través de mecanismos antiinflamatorios (Fernández-Martín et al., 2006; Abad et al., 2010; Abad y Waschek, 2011). Dado que el envejecimiento está asociado con un cierto grado de inflamación cerebral, la acción remielinizante de VIP que hemos observado en el cerebro de rata vieja podría estar relacionada con sus efectos antiinflamatorios.
Para dilucidar esta hipótesis, estudiamos el efecto del tratamiento con VIP en la expresión de citoquinas en el cerebro de ratas viejas midiendo la expresión de los ARNms de la IL-1ß, la IL-6, el TNF-α y el TGF-ß mediante PCR a tiempo real. Además, analizamos si el BDNF y/o el IGF-I modificaban el efecto de VIP sobre la expresión de citoquinas en el cerebro envejecido.
Para ello un grupo de ratas viejas de 24 meses de edad se trataron con VIP s.c. (3 nmol/día) en días alternos durante 15 días. El papel del BDNF se estudió mediante el bloqueo de sus receptores TrkB y P75NTR con sus respectivos inhibidores K
252a (10-4M y 10-5M)
y PEP5 (100 ng y 500 ng) inyectados 30 minutos antes de la administración de VIP. El bloqueo del receptor del IGF-I se llevó a cabo con el antagonista del IGF-I, JB-1 (15 µg), administrado 30 minutos previos a VIP. Finalizado el tratamiento se determinó la expresión de los ARNms de las citoquinas en la corteza cerebral anterior e hipocampo mediante PCR a tiempo real.
4.1.- Expresión del ARNm de la IL-1ß en el cerebro de ratas viejas: efecto del tratamiento con VIP
Como se observa en la Figura 43 las ratas de 24 meses de edad presentan niveles del ARNm de la IL-1ß en la corteza cerebral anterior significativamente superiores a los de las ratas jóvenes controles. Los niveles del ARNm de la IL-1ß en el hipocampo de las ratas viejas están también elevados aunque no se observan diferencias significativas. El tratamiento con VIP no produjo ningún cambio significativo en los niveles del ARNm de la IL-1ß ni en la corteza cerebral anterior ni en el hipocampo de las ratas viejas.
Figura 43.Expresión del ARNm de la IL-1ß en el cerebro. Cuantificación de los niveles del ARNm de la IL-1ß en la corteza cerebral anterior e hipocampo mediante PCR a tiempo real en ratas adultas jóvenes (3m) y viejas (24m) controles y tratadas con VIP s.c. (3 nmol/día / días alternos / 15 días). Los resultados se expresan como la media ± EE y en porcentaje respecto al grupo de 3 meses. **, p < 0,01; ns, no significativo.
4.2.- Expresión del ARNm de la IL-6 en el cerebro de ratas viejas: efecto del tratamiento con VIP
Como se muestra en la Figura 44, el envejecimiento se acompaña de un incremento de los niveles del ARNm de la citoquina proinflamatoria IL-6 tanto en la corteza cerebral anterior como en el hipocampo. El tratamiento con VIP aumentó aún más los niveles del ARNm de la IL-6 en la corteza cerebral anterior de las ratas viejas. En el hipocampo se observa una tendencia similar que no llega a ser significativo. Los inhibidores de BDNF e IGF-I abolen el efecto de VIP sobre la expresión de la IL-6 en la corteza cerebral anterior y el aumento en la expresión basal de la IL-6 observado en la corteza cerebral anterior e hipocampo de las ratas viejas.
Estos resultados muestran un incremento de la IL-1ß e IL-6 en el cerebro de la rata vieja. Además, sugieren un papel modulador de VIP en la expresión de la IL-6 al menos en la corteza cerebral anterior. Los efectos observados tras el bloqueo de los receptores de BDNF e IGF-I apoyan un papel mediador de BDNF e IGF-I en los efectos de VIP en la expresión de la IL-6, así como en el patrón inflamatorio cerebral.
0 100 200 300 400 0 100 200 300 400 3 meses 24 meses C C VIP 3 meses 24 meses C C VIP ns ns ns
**
Figura 44.Expresión del ARNm de la IL-6 en el cerebro. Efecto de la inhibición de BDNF e IGF-I. Cuantificación de los niveles del ARNm de la IL-6 en la corteza cerebral anterior e hipocampo mediante PCR a tiempo real en ratas adultas jóvenes (3m) y viejas (24m) controles y tratadas con VIP s.c. (3 nmol/día), VIP+PEP5(100 ng y 500 ng), VIP+K252a (10-4 M y 10-5 M) o VIP+JB-1(15 µg) en días alternos durante 15 días. Los resultados se expresan como la media ± EE y en porcentaje respecto al grupo de 3 meses. *, p < 0,05; **, p < 0,01;***, p < 0,001; ns, no significativo.
4.3.- Expresión del ARNm de TNF-α en el cerebro de ratas viejas: efecto del tratamiento con VIP
Como se muestra en la Figura 45, en el envejecimiento no se alteran los niveles del ARNm de la citoquina TNF-α en ninguna de las áreas cerebrales estudiadas. El tratamiento con VIP produjo un aumento significativo en los niveles del ARNm de TNF-α tanto en la corteza cerebral anterior como en el hipocampo de las ratas viejas. En la corteza cerebral anterior y en el hipocampo el efecto del VIP sobre la expresión de TNF-α es abolido cuando se bloquean los receptores de BDNF, P75NTR y TrkB, con los inhibidores PEP5 y K
252a. El bloqueo del receptor
de IGF-I con JB-1 solo bloquea el efecto de VIP en la corteza cerebral anterior pero no en el hipocampo.
Estos resultados sugieren un papel estimulador de VIP de la expresión de TNF-α
en todas las áreas cerebrales estudiadas. Los efectos observados tras el bloqueo de los receptores de BDNF e IGF-I apoyan un papel modulador de BDNF e IGF-I en los efectos de VIP. 0 50 100 150 200 250 PEP5 K250a JB-1 (100 ng) (500 ng)(10-5M)(10-4 M) (15 µg) C CV VIP 3 meses 24 meses
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0 50 100 150 200 PEP5 K250a JB-1 (100 ng) (500 ng)(10-5M)(10-4 M) (15 µg) C CV VIP 3 meses 24 meses**
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ns nsns nsnsFigura 45.Expresión del ARNm de TNF-α en el cerebro. Efecto de la inhibición de BDNF e IGF-I. Cuantificación
de los niveles del ARNm de TNF-α en la corteza cerebral anterior e hipocampo mediante PCR a tiempo real en ratas adultas jóvenes (3m) y viejas (24m) controles y tratadas con VIP s.c. (3 nmol/día / días alternos / 15 días), VIP+PEP5(100 ng y 500 ng), VIP+K252a (10-4M y 10-5M) o VIP+JB-1(15 µg). Los resultados se expresan como la media ± EE y en porcentaje respecto al grupo de 3 meses. *, p<0,05; **, p<0,01; ***, p < 0,001; ns, no significativo.
4.4.- Expresión del ARNm de TGF-ß en el cerebro de ratas viejas: efecto del tratamiento con VIP
Como se muestra en la Figura 46, el envejecimiento va acompañado de un aumento significativo de los niveles del ARNm de la citoquina TGF-ß tanto en la corteza cerebral anterior como en el hipocampo. El tratamiento con VIP no produjo ningún cambio significativo en los niveles del ARNm de esta citoquina ni en la corteza cerebral anterior ni en el hipocampo. Tampoco se observó ningún cambio significativo al bloquear los receptores de BDNF e IGF-I.
Estos resultados sugieren que existe un aumento de la expresión de TGF-ß en el cerebro de las ratas viejas. VIP no ejerce ningún efecto en la expresión de TGF-ß ni en la corteza cerebral anterior ni en el hipocampo de las ratas viejas.
0 50 100 150 200 PEP5 K250a JB-1 (100 ng) (500 ng)(10-5M)(10-4 M) (15 µg) C CV VIP 3 meses 24 meses
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ns***
ns*****
0 50 100 150 200 PEP5 K250a JB-1 (100 ng) (500 ng)(10-5M)(10-4 M) (15 µg) C CV VIP 3 meses 24 meses*
ns ns**
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Figura 46. Expresión del ARNm de TGF-ß en el cerebro. Efecto de la inhibición de BDNF e IGF-I. Cuantificación de los niveles del ARNm de TGF-ß en la corteza cerebral anterior e hipocampo mediante PCR a tiempo real en ratas adultas jóvenes (3m) y viejas (24m) controles y tratadas con VIP s.c. (3 nmol/día/ días alternos/ 15 días), VIP+PEP5 (100 ng y 500 ng), VIP+K252a (10-4 M y 10-5 M) o VIP+JB-1(15 µg). Los resultados se expresan como la media ± EE y en porcentaje respecto al grupo de 3 meses. *, p<0,05; ns, no significativo.
4.5.- Expresión del ARNm de CXCL12 en el cerebro de ratas viejas: efecto del tratamiento con VIP
Como se muestra en la Figura 47, en el envejecimiento no se alteran los niveles del ARNm de CXCL12 ni en la corteza cerebral anterior ni en el hipocampo. Tampoco el tratamiento con VIP produjo cambios significativos en los niveles del ARNm de CXCL12 en dichas áreas cerebrales.
Figura 47.Expresión del ARNm de CXCL12 en el cerebro. Cuantificación de los niveles del ARNm de CXCL12 en la corteza cerebral anterior e hipocampo mediante PCR a tiempo real en ratas adultas jóvenes (3m) y viejas (24m) controles y tratadas con VIP s.c. (3 nmol/día/ días alternos/ 15 días). Los resultados se expresan como la media ± EE y en porcentaje respecto al grupo de 3 meses. ns, no significativo.
0 50 100 150 PEP5 K250a JB-1 (100 ng) (500 ng)(10-5M)(10-4 M) (15 µg) C CV VIP 3 meses 24 meses
*
ns ns nsns nsns 0 50 100 150 200 PEP5 K250a JB-1 (100 ng) (500 ng)(10-5M)(10-4 M) (15 µg) C CV VIP 3 meses 24 meses*
ns nsns nsns ns 0 50 100 150 0 50 100 150 3 meses 24 meses C C VIP 3 meses 24 meses C C VIP ns ns ns nsEl tratamiento con VIP no produce ningún cambio en los niveles de CXCL12, lo que sugiere que CXCL12 no participa en la remielinización observada al tratar a las ratas viejas con VIP.
La secreción de GH disminuye gradualmente durante el envejecimiento fisiológico debido fundamentalmente a alteraciones asociadas a la edad de los reguladores hipotalámicos de la GH. Como consecuencia, se produce un declinar paralelo en los niveles del IGF-I. Se puede considerar al envejecimiento como un modelo fisiológico de déficit parcial de GH.
Muchos de los cambios que acompañan al envejecimiento son similares a los existentes en el síndrome de deficiencia de GH. La falta de concentración, la baja energía, las alteraciones de la memoria, la irritabilidad y la falta de bienestar generalizado propios de los individuos con deficiencia de GH son rasgos característicos del envejecimiento.
Esta similitud en la sintomatología que presentan los individuos con deficiencia de GH y los ancianos, ha llevado a sugerir una relación causa-efecto entre los cambios del envejecimiento y la deficiencia de GH, especulándose que la administración de GH puede retardar el deterioro geriátrico.
Estudios realizados en ratas y en humanos han confirmado la reversibilidad de determinados síntomas relacionados con el envejecimiento tras la administración de GH o de sus secretagogos.
En este estudio hemos investigado si las alteraciones cerebrales que ocurren en el envejecimiento en la mielinización, la inflamación y la memoria pueden ser revertidas tras la activación del eje GH/IGF-I con GH y GHRP-6.
Entre los numerosos factores que actúan como mediadores de las acciones de la GH, hemos investigado el papel de BDNF y de VIP en los efectos de GH sobre la remielinización e inflamación en el cerebro de la rata vieja.
A.- SISTEMA GH/IGF-I EN EL ENVEJECIMIENTO
1.- ALTERACIONES HIPOFISARIAS DEL SISTEMA GH/IGF-I EN RATAS VIEJAS