Agronomy

Los estudios de inhibición fúngica se realizaron con hongos de la colección de la Cátedra de Microbiología-FCE-UNLP: Cepas de A.flavus aisladas de alimentos AFUNL1, AFUNL2, AFUNL3, AFUNL5 y AFUNQ6. Las cuatro primeras provienen de la Universidad Nacional del Litoral y AFUNQ6 fue facilitada por la Universidad Nacional de Quilmes. Se emplearon también cepas de A.parasiticus: APUNL1, APUNL2, APUNL3, A. parasiticus NRRL 2999 y APUNQ5. Las tres primeras fueron facilitadas por la Universidad Nacional del Litoral, mientras que A. flavus NRRL 2999 y APUNQ5 fueron cedidas por la Universidad Nacional de Quilmes.

También se emplearon hongos filamentosos aislados y clasificados en esta tesis, a partir de alimento balanceado para pollos Nutrisur®: Trichoderma longibrachiatum CMUNLP5, Aspergillus fumigatus CMUNLP2, Rhizopus macrosporus var. rhizopodiformis, Penicillium sumatrense CMUNLP3,

Penicillium crustosum CMUNLP4 y Aspergillus terreus CMUNLP1. Las cepas fúngicas se mantuvieron a 4°C en agar agua (agar 0,2% p/v).

4.2 Preparación del inóculo de hongos filamentosos.

Los hongos filamentosos se cultivaron en tubos con agar papa en pico de flauta (Merck®, Darmstadt, Alemania) a 30°C hasta su esporulación. El inóculo de esporas se preparó por lavado de la superficie del agar con una solución estéril de lauril sulfato de sodio (Merck®_{, Darmstadt, Alemania) al 0,01% (m/v) en}

solución de glucosa al 1% (m/v) (Carlo Erba®_{, Milán, Italia). Se adicionaron diez}

mililitros de esta solución sobre la superficie del tubo de agar inclinado y se aflojaron los conidios mediante raspado suave con ansa (Molina y Giannuzzi, 1999). El número de conidios se determinó por recuento en cámara de Neubauer y se prepararon soluciones de 1x104 conidios/ml.

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4.3 Gránulos de kefir.

Se emplearon los gránulos CIDCA AGK1 y AGK2, caracterizados en el CIDCA (Centro de Investigación y Desarrollo en Criotecnología de Alimentos), Universidad Nacional de La Plata (UNLP), Argentina (Garrote, 1999). Estos se conservaron congelados en leche a -20°C y se reactivaron mediante dos pasajes consecutivos de fermentación a 30°C en leche UHT (Sancor®_,

Argentina). Una vez reactivados se efectuaron las fermentaciones a diferentes concentraciones de gránulo y Temperatura para los estudios de inhibición. Las fermentaciones fueron realizadas en leche (capítulo 6.1) o en Permeado de Suero (capítulo 6.2).

4.4 Microorganismos aislados de gránulos de Kefir (MK).

Se emplearon microorganismos aislados de gránulos de kefiry caracterizadas en el CIDCA (Centro de Investigación y Desarrollo en Criotecnología de Alimentos) de la U.N.L.P: Lactobacillus kefir CIDCA 8348, 83111, 8325 Y L. kefir JCM5818; L. plantarum 83114, 8327, 8318 y 8316; Saccharomyces cerevisiae 81103 y 8116, Kluyveromyces marxianus 8154, S. lipolytica 8112,

Saccharomyces boulardii, K. lactis y el hongo filamentoso Geotrichum candidum (Garrote, 1999). Las cepas se conservan en leche y caldo MRS a - 20°C y para efectuar los experimentos se reactivaron mediante dos pasajes consecutivos cultivándolas por 24 horas a 30°C en caldo MRS (DIFCO®, Beauvais, Francia), antes de cultivarlas en Permeado de suero (PS).

4.5 Curvas de acidificación.

Para realizar la curva de acidificación de leche o PS el sustrato se inoculó con gránulo CIDCA AGK1 o AGK2 al 10% y se incubó a diferentes temperaturas (20°C, 30°C y 37 °C). Se tomaron lecturas periódicas del pH del producto durante la fermentación conun pHmetro ALTRONIX TPX-III (Altronix®, Taiwan)

31 hasta alcanzar pH final de 3,0 (leche) o de 3,7 (permeado de suero). Para realizar la curva de acidificación del PS fermentado con microorganismos aislados del kefir, éstos se activaron saliendo de -20°C, cultivándolos mediante dos pasajes consecutivos en caldo MRS (DIFCO®, Beauvais, Francia). Se inocularon 100 µl/5 ml de PS estéril; se incubaron a 30°C y se tomaron medidas de pH hasta alcanzar el pH final de 3,7. Las curvas de acidificación se construyeron graficando pH vs. Tiempo.

4.6 Obtención del producto fermentado con gránulos de kefir y con microorganismos aislados del gránulo de kefir (MK).

Los productos fermentados se prepararon como se describió en el apartado anterior. Para los productos fermentados con gránulo de kefir, al finalizar la fermentación, los gránulos se separaron del producto fermentado empleando un colador de malla de 1 mm2. Los microorganismos presentes en los productos

fermentados se precipitaron en ultracentrífuga Eppendorf 5415D (Eppendorf®, Alemania), 15 minutos a 13000 rpm, descartando el pellet y congelando el sobrenadante para su posterior filtración.

4.7 Obtención del sobrenadante libre de células (SLC) a partir de los productos fermentados con gránulos de kefir y con microorganismos aislados del gránulo de kefir.

El sobrenadante se esterilizó en filtros de 0,22 µm de poro (Sigma-Aldrich®, USA) y el SLC obtenido se almacenó a -20°C hasta la realización de los ensayos de actividad antifúngica.

4.8 Análisis por HPLC de los ácidos láctico y acético en los SLC y en los alimentos adicionados de productos fermentados.

La concentración de ácido láctico y ácido acético se determinó en el SLC del producto fermentado. Para determinar los ácidos de los alimentos adicionados

32 de producto fermentado, se diluyó 1/10 el alimento en agua bidestilada, se homogenizó en stomacher (Laboratory Blender Stomacher 400®, Inglaterra) y se filtró con filtros de 0,22 µm (Sigma-Aldrich®, USA). Los SLC se analizaron por HPLC (Agilent Technologies® series 1200, Santa Clara CA, USA), columna de intercambio iónico Aminex HPX-87H (Bio-Rad®_{, Hercules, USA). Se empleó}

fase móvil H2SO4 0,009N (Merck®, Darmstadt, Alemania) a un caudal de 0,6

ml/min, con detector ultravioleta a longitud de onda de 214 nm (Garrote, 1999). Se hicieron curvas patrón de ácido acético (Merck®_{, Darmstadt, Alemania) de}

25, 50, 100, 200, 700 y 1500 ppm y de ácido láctico (Carlo Erba®_{, Milán, Italia)}

de 500, 1000, 4000, 8000, 10.000 y 14.000 ppm.

4.9 Preparación de los SLC acidificados artificialmente con ácidos orgánicos puros y con HCl.

Para acidificar artificialmente la leche, los ácidos orgánicos se prepararon en dos solventes: agua destilada estéril y leche UHT (Sancor®, Argentina), con base en las concentraciones determinadas en esta tesis en leche fermentada con gránulos CIDCA AGK1 y AGK2. Las soluciones de ácidos en agua se prepararon con las siguientes concentraciones determinadas a diferentes valores de pH.

pH mezcla Ácido Láctico (AGK1) (%) Ácido Acético (AGK1) (%)

4,5 0,407 0,03 3,5 1,947 0,044 3,3 1,076 0,065

Tabla 4.1 Soluciones de ácidos en agua según las concentraciones determinadas en sobrenadantes obtenidos con gránulos CIDCA AGK1 y AGK2.

Las soluciones de ácidos orgánicos se hicieron agregando a la leche los ácidos en las concentraciones determinadas en leche fermentada con gránulos de kefir CIDCA AGK1 y AGK2 y se obtuvieron los SLC con las concentraciones indicadas en la tabla siguiente.

33 Leches acidificadas pH Ácido Láctico (%) Ácido Acético (%)