AN ASSESSMENT OF DECENTRALIZATION CONCEPTS

Nuestra hipótesis de trabajo es que la determinación de los niveles de mRNA, junto con los niveles proteicos y los funcionales, así como la localización de diversos componentes de los sistemas fibrinolítico y de las MMPs, podrían proporcionar más información acerca de la regulación de la expresión y del papel de estos sistemas en el cáncer de mama.

Como hemos indicado, los estudios previos en relación al cáncer de mama se basan fundamentalmente en la determinación antigénica de los componentes de los sistemas fibrinolítico, y de las MMPs, existiendo escasos estudios acerca de su expresión génica. Sin embargo, los niveles de proteína representan sólo un aspecto de la expresión alterada de las células tumorales, por lo tanto, la relación entre niveles de proteína y de mRNA es un elemento fundamental para entender los cambios en la expresión génica, especialmente en el desarrollo del proceso tumoral.

Por otra parte, los métodos convencionales para la evaluación de los niveles de mRNA son laboriosos, requieren gran cantidad de tejido y tienen bajos límites de detección y, en la práctica, se dispone cada vez de menor cantidad de tejido tumoral. La técnica de la RT-PCR cuantitativa en tiempo real, que se desarrolla en la presente tesis doctoral, combina la técnica de RT-PCR con las de fluorescencia, permitiendo partir de una menor cantidad de tejido y realizar una cuantificación más sensible, específica y reproducible. Además, los estudios realizados hasta la actualidad se han centrado fundamentalmente en el uPA, uPAR, PAI-1 y TIMP-1. Sin embargo, existen muy pocos estudios acerca de otros componentes, como el PAI-2 y la MMP-3, y no se conocen investigaciones sobre la expresión y el posible papel del PAI-3 en el cáncer de mama.

Los estudios antigénicos, realizados sobre los componentes de estos sistemas en el cáncer de mama no distinguen entre las formas activas, inactivas y complejos. Sin embargo, los niveles de las formas activas podrían estar más relacionados con el cáncer. Por ello, sería importante poder cuantificar los niveles funcionales de las proteínas y, si ello no es posible, cuantificar específicamente los complejos formado entre enzima e inhibidor, ya que ésta sería una forma indirecta de valorar el nivel de los componentes activos que lo forman, pues solamente las moléculas activas de los enzimas e inhibidores son capaces de generar complejos. Por otra parte, en la mayoría de estudios de los componentes del sistema fibrinolítico en tejido de cáncer de mama, las proteínas se han valorado únicamente en la fracción citosólica, y sería importante poder valorar el

Cáncer de mama : Fibrinolisis y Metaloproteasas.

extracto de la fracción de membrana en donde queda parte de las proteínas. En cuanto al sistema de las metaloproteasas, sus niveles se han determinado fundamentalmente mediante la técnica de inmunohistoquimia, por lo que sería interesante valorar sus niveles con una técnica más cuantitativa como el ELISA.

A pesar del papel pronóstico que se ha atribuido a diversos componentes del sistema de activación del plasminógeno en el cáncer de mama, su localización precisa a nivel tisular es aún especulativa, no habiendo unanimidad en las células que expresan dichas moléculas en el tejido neoplásico. Sería de gran interés determinar que células están implicadas en su producción y así aportar más datos acerca de la biología del tumor.

Por lo tanto, para averiguar el papel de los genes en una patología, como el cáncer, es necesario analizar no sólo su presencia antigénica, sino también expresión génica y su localización tisular. Existe, por tanto, una base razonable sobre la que se sustenta nuestra hipótesis y que proporciona un fuerte argumento para estudiar no sólo los niveles proteicos, sino también los funcionales y los de mRNA, así como la localización tisular de diversos componentes de los sistemas fibrinolítico y de las MMPs. Todo ello aportaría importante información acerca de la implicación de estos sistemas, especialmente la del PAI-3 del cual no existen estudios, en el cáncer de mama.

2.2. OBJETIVOS

La finalidad última es determinar la implicación de diversos componentes de los sistemas fibrinolítico y de las metaloproteasas en el desarrollo del cáncer de mama. Para ello se fijaron los siguientes objetivos:

1.- Puesta a punto de las técnicas de la RT-PCR cuantitativa en tiempo real con el fin de valorar los niveles de mRNA de los componentes de los sistemas fibrinolítico (uPA, PAI-1 y PAI-3) y de las MMPs (MMP-3 y TIMP-1), en el cáncer de mama.

2.- Cuantificar, en los extractos de tejido de carcinoma mamario, los niveles antigénicos y funcionales de los activadores del plasminógeno (uPA, tPA), así como de los inhibidores de los activadores del plasminógeno (PAI-1, PAI-2 y PAI-3) y complejos enzima-inhibidor. Dentro del sistema de las MMPs se determinarán los niveles antigénicos de la MMP-3 y del TIMP-1.

Remedios Castelló Cros. Hipótesis y Objetivos

3.- Estudiar la variación en los componentes del sistema fibrinolítico y de las metaloproteasas en función del estadio de la enfermedad. Se prestará una especial atención a la evolución de las pacientes, con el objeto de identificar los casos de recidiva y valorar en las mismas la posible existencia de niveles diferentes en los componentes de ambos sistemas.

4.- Determinar las correlaciones existentes entre el nivel de mRNA y de proteína en los componentes de estos sistemas, para determinar el nivel de regulación de su expresión en el cáncer de mama. Analizar las relaciones existentes entre la expresión de los componentes dentro de un mismo y entre ambos sistemas, para poder determinar las posibles interacciones de estos sistemas en el cáncer de mama.

5.- Optimizar las condiciones para la localización inmunológica de diversos componentes del sistema fibrinolítico mediante técnicas de inmunohistoquimia y determinar su expresión según el estadio del tumor.

6.- Determinar los componentes celulares responsables de la síntesis de mRNA del PAI-1 y uPA mediante técnicas de hibridación in situ y compararlos con los implicados en su localización antigénica.

3. MATERIAL Y MÉTODOS