Tanto SIRT1 (Dominy et al., 2012; Rodgers and Puigserver, 2007; Rodgers et al., 2005) como PCK1 (Yang et al., 2009a) están involucradas en la gluconeogénesis. Los resultados de MS (Tabla 3.8 y Tabla 3.9), los experimentos de cinética (Tabla 3.12 y Figura 3.24) y los ensayos de producción de glucosa (Figura 3.25) indican un posible papel de SIRT1 en la regulación de la actividad de PCK1. Para determinar la capacidad de SIRT1 de deacetilar Pck1 se utilizaron distintas aproximaciones. En primer lugar, se incubaron las muestras de proteína (Pck1-10mM y Pck1-15mM) con SIRT1 o SIRT2 independientemente, en un ensayo in vitro, igual al que se realizó para el análisis por MS y se detectó el nivel de acetilación por western blot. En la Figura 3.34 se observa que la incubación con SIRT1 disminuye los niveles de acetilación de Pck1.
Con el fin de confirmar esta interacción en células, Pck1 se sobreexpresó en células HEK293T en ausencia o en presencia de SIRT1 humana marcada con el epítopo Flag (Flag-SIRT1), también sobreexpresada. Como control se utilizó el mutante inactivo de SIRT1 p.H363Y. Pck1 fue inmunoprecipitada utilizando el epítopo HA y el nivel de acetilación se determinó por western blot. La presencia de SIRT1 disminuyó los niveles de acetilación de Pck1 (Figura 3.35).
Figura 3.34. Deacetilación de Pck1 purificada a partir de células HEK293T. Las muestras de Pck1
(α-PCK1) que se obtuvieron para los ensayos de MS (Pck1-10mM y Pck1-15mM) se incubaron con una de las dos sirtuinas recombinantes humanas, SIRT1 (α-SIRT1) o SIRT2 (α-SIRT2) a 30˚C durante 1 hora en presencia de NAD+. Las muestras se analizaron por western blot determinando el nivel
de acetil-lisina (α-AcK). Los números a la izquierda indican el peso molecular. 1.- Pck1 en presencia de 0.5 mM NAD+. 2.- Pck1 en presencia de 0.5 mM NAD+ y SIRT1. 3.- Pck1 en presencia de 0.5 mM
NAD+ y SIRT2.
Glucosa (mM) 10 15 1 2 3 1 2 3
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En contraposición al experimento anterior, se diseñaron sondas de RNA de interferencia dirigidas específicamente contra SIRT1 o bien SIRT2 con el objetivo de silenciar la expresión de estas proteínas y comprobar si, en este caso, los niveles de acetilación de PCK1 se modificaban. Se incluyó el silenciamiento de SIRT2 en este experimento con fines comparativos. Para aumentar la potencia del experimento, se trabajó con células HEK293T y HepG2. Inicialmente el experimento se planteó trabajando con la PCK1 endógena, pero fue imposible ya que en ningún caso se consiguió la inmunoprecipitación de la misma utilizando dos anticuerpos distintos. Lo único que se pudo comprobar es que, a diferencia de lo que sucedió en las células HEK293T, el nivel de PCK1 en células HepG2 disminuyó al silenciar la expresión de SIRT1 (Figura 3.36), como ya han descrito otros autores (Lin et al., 2009).
Figura 3.35. Deacetilación de Pck1 en células HEK293T en presencia de SIRT1. Se
sobreexpresaron tanto Pck1 (α-HA) como SIRT1 o el mutante inactivo SIRT1 p.H363Y (α-Flag). Pck1 fue inmunoprecipitada y el nivel de acetilación (α-AcK) determinado por western blot. Los números a la izquierda indican el peso molecular. El western blot mostrado es representativo de tres experimentos independientes.
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La imposibilidad de inmunoprecipitar la PCK1 endógena llevó a sobreexpresar la construcción HA-Pck1-6xHis de nuevo al mismo tiempo que se silenciaban SIRT1 o SIRT2. En la Figura 3.37 se observa que, en células HEK293T, los niveles de acetilación de Pck1 aumentan al silenciar tanto SIRT1 como SIRT2, pero en el caso de las células HepG2 estos niveles sólo aumentan al silenciar SIRT1.
Además, se analizó la actividad en condiciones de Vmax de esta Pck1 purificada. El
silenciamiento de SIRT1 redujo la velocidad de la reacción gluconeogénica un 40% en
Figura 3.36. Efecto del silenciamiento de SIRT1 o SIRT2 sobre los niveles de PCK1 endógena en células HEK293T y HepG2. Se determinaron los niveles endógenos de PCK1 (α-PCK1) al silenciar
SIRT1 (SiSIRT1) o SIRT2 (SiSIRT2) y se comparó con los RNA control (-). Como control de carga se usó tubulina. Los números a la izquierda indican el peso molecular. El western blot mostrado es representativo de dos experimentos independientes.
Figura 3.37. Efecto del silenciamiento de SIRT1 o SIRT2 sobre los niveles de acetilación de Pck1 en células HEK293T y HepG2. Se
determinaron los niveles de acetilación (α- AcK) de Pck1 sobreexpresada (α-HA) al silenciar SIRT1 (SiSIRT1) o SIRT2 (SiSIRT2) y se comparó con los RNA control. Los números a la izquierda indican el peso molecular. El western blot mostrado es representativo de dos experimentos independientes. SIRT2 endógena presenta dos bandas debido a la existencia de dos isoformas. IB = Inmunoblot. A la derecha aparece la cuantificación del nivel relativo de acetilación en ambas líneas celulares expresando la media y desviación estándar. Por medio de un test-t se compararon las medias (n=2) que en algunos casos fueron significativas. * p<0.05, ** p< 0.01, n.s. = no significativo.
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células HEK293T y un 70% en células HepG2 mientras que la velocidad en el sentido contrario permaneció prácticamente invariable (Figura 3.38).
Finalmente, se analizaron los efectos de la acetilación de Pck1 in vivo. Inicialmente, la Pck1 se purificó parcialmente de tejidos gluconeogénicos de ratones salvajes Sirt1+/+ y
ratones Sirt1-/- (Figura 3.39) utilizando columnas de intercambio iónico. La purificación
a partir de muestras de riñón rindió Pck1 con menos proteínas contaminantes.
Figura 3.38. Efecto del silenciamiento de SIRT1 en células HEK293T y HepG2 sobre la actividad de Pck1. La Pck1 se sobreexpresó al mismo tiempo que se silenció SIRT1 en las dos líneas celulares
gluconeogénicas. La velocidad se midió en condiciones de Vmax en ambos sentidos de la reacción. En
los gráficos se representa la media y desviación estándar de dos experimentos independientes. La velocidad de los dos sentidos de la reacción catalizada por la Pck1 proveniente de células con silenciamiento de SIRT1 (SiSIRT1) se comparó con la de las células control (Control RNA).
170- 130- 95- 70- 55- 40- 35- 25- 95- 70- 55- 40- 35- 25-
Hígado
Riñón
Sirt1+/+ Sirt1-/- Sirt1+/+ Sirt1-/-
Figura 3.39. Purificación parcial de Pck1 a partir de tejidos de ratón. Geles del 10% poliacrilamida
mostrando el resultado de la purificación en diversas muestras. En rojo aparece enmarcada la banda correspondiente a Pck1. Sirt1+/+ = Muestras provenientes de animales no modificados.
Sirt1-/- = Muestras provenientes de animales que no expresaron Sirt1. Cada carril representa una
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Se midió la actividad en condiciones de Vmax tanto de las muestras de Pck1 purificadas
de animales no modificados como de aquellos que tenían la expresión de Sirt1 abolida y también se analizaron los parámetros cinéticos para los sustratos PEP y GDP (Figura 3.40).
Como se puede observar en la Figura 3.40A y en la Tabla 3.15, las muestras de proteína procedentes de animales deficientes en Sirt1 mostraron un descenso del 30-40% en la actividad en el sentido gluconeogénico (de OAA a PEP) de la reacción y un 30-35% superior en el glicolítico (de PEP a OAA) tanto en Pck1 purificada de hígado como de riñón.
B
A
Figura 3.40. Efecto de la abolición de Sirt1 sobre la actividad Pck1 de ratón. (A)La actividad se midió en condiciones de Vmax en ambos sentidos de la reacción en muestras de Pck1 purificadas a partir de hígado y de riñón. (B) Representación de Michaelis-Menten
comparando las muestras de Pck1 de animales no modificados (Sirt1+/+) y de
aquellos deficientes en Sirt1 (SIRT1-/-) para los sustratos
PEP y GDP utilizando Pck1 purificada de riñón. Sirt1+/+ Sirt1-/- Sirt1+/+ Sirt1-/- Sirt1+/+ Sirt1-/-
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Tabla 3.15. Actividad de Pck1 purificada a partir de animales no modificados (Sirt1+/+) y deficientes en Sirt1 (Sirt1-/-). La velocidad aparece representada en µmol/min/mg. Aparecen reflejadas la media y desviación estándar de las tres muestras analizadas por duplicado.
Reacción Hígado Riñón
Sirt1+/+ Sirt1-/- Sirt1+/+ Sirt1-/- OAA to PEP 4.7±1 2.9±0.6 33±4.7 22±4.8
PEP to OAA 1.9±0.1 2.6±0.4 12±1.6 18±2.3
También se determinaron los parámetros cinéticos para los sustratos PEP y GDP, sustratos para los que a lo largo de los experimentos se modificaron las propiedades cinéticas como consecuencia de la acetilación. En este caso sólo se utilizaron las muestras de Pck1 purificada a partir de riñón. En la Tabla 3.16 se puede observar que los valores de Km tanto para PEP como GDP fueron 2.6 y 2.8 veces inferiores,
respectivamente. Esto último sumado a un incremento de la velocidad (kcat) de la
reacción un 25% en el caso del PEP y un 20% en el caso del GDP dieron como resultado un incremento de 3.5 veces en la eficiencia catalítica.
Tabla 3.16. Constantes de Michaelis-Menten para los sustratos PEP y GDP a partir de las muestras de Pck1 purificadas a partir de riñón de animales no modificados (Sirt1+/+) y deficientes en Sirt1 (Sirt1-/-).
Muestra PEP GDP
Km (µM) kcat (s-1) kcat/Km (M-1s-1) Km (µM) kcat (s-1) kcat/Km (M-1s-1)
Sirt1+/+ 471±33 17±0.4 3.6 x 104 101±16 12±0.7 1.2 x 105
Sirt1-/- 166±13 21±0.4 1.3 x 105 38±4 16±0.5 4.2 x 105
Para concluir, se analizaron los niveles de acetilación a partir de muestras de hígado y de riñón por medio de western blot. En primer lugar, se determinó la presencia de Pck1 en los extractos totales tras resuspender las muestras de tejido en el correspondiente tampón. En hígado, se observó que los animales deficientes en Sirt1 tenían incrementados los niveles de Pck1 (Figura 3.41A).
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Después se determinó el nivel de acetilación de la proteína ya purificada. En la Figura 3.41B se observa que las muestras de animales deficientes en Sirt1 presentan niveles más altos de Pck1 acetilada tanto en hígado como en riñón. En conjunto, los resultados muestran que SIRT1 es una deacetilasa de Pck1 capaz de regular su actividad gluconeogénica.
3.3.5. Efecto de la fosforilación sobre la estabilidad de Pck1 y su interacción con la