APPENDIX J Executive Summary

El daño oxidativo al ADN mitocondrial se llevó a cabo mediante la valoración de los niveles del deoxinucleótido oxidado 8-oxo-7,8-dihidro-2´-deoxiguanosina (8-oxodG), en relación con su base no modificada deoxiguanosina (dG). Dicha valoración se realizó mediante técnicas de cromatografía líquida de alta resolución (HPLC) con detección culométrica en el caso de la 8-oxodG, y ultravioleta, en el de la dG.

Para el aislamiento y precipitación del ADN mitocondrial se siguió el método de Latorre et al. (1986) adaptado a mamíferos (de la Asunción et al., 1996; Barja y Herrero, 2000).

3.1. Aislamiento del ADN mitocondrial

Las muestras de tejido se conservaron congeladas a -80º C desde el sacrificio de los animales.

Se pesaron entre 400 y 500 mg de muestra en el caso del hígado y entre 150 y 200 mg en el de cerebro y riñón, y se homogeneizaron, a 4º C, a razón de 1,5 ml de tampón de homogeneización (TRIS 10 mM, NaCl 60 mM, sacarosa al 5% y EDTA-Na2 10 mM, pH 7,8) por

gramo de tejido. Posteriormente se mezclaron:

- 300 µl de dicho homogenado.

- 300 µl de tampón TRIS 300 mM con SDS al 1,25%, sacarosa al 5% y EDTA- Na2

10 mM, pH 9.

- 400 µl de cloroformo: alcohol isoamilo (49:1, v/v) para separar los lípidos.

Se centrifugó 10 minutos a 500g21_{. Se recogió la fase superior y se incubó durante 30}

minutos a 65º C. De este modo, conseguimos romper las membranas y liberar el contenido celular, a la vez que se desnaturalizan las proteínas con el SDS.

Tras esto se añadieron 0,12 ml de acetato potásico 3M, pH 4,8 a las muestras y se incubaron 10 minutos a -20º C. El descenso de pH junto con la alta concentración de sales provoca la precipitación del ADN de alto peso molecular, principalmente ADN nuclear. Además el potasio forma complejos con el SDS-proteína, facilitando su precipitación.

Materiales y Métodos

Las muestras se centrifugaron durante 10 minutos a 10000g y se recogió el sobrenadante (el sedimento contiene restos celulares, complejos SDS-proteína y ADN nuclear).

Se tomaron 700 μl de muestra en un tubo Eppendorff y se añadió idéntico volumen de isopropanol; en esta fase ya se puede apreciar el ADN.

A continuación se incubaron las muestras durante 5 minutos a temperatura ambiente y se centrifugaron a 10000g 10 minutos. En el sedimento queda ADN mitocondrial parcialmente purificado, por lo que se eliminó el sobrenadante y se añadieron 0,5 ml de etanol al 70% frío (mantenido a -20º C).

Las muestras se volvieron a centrifugar a 10000g durante 10 minutos. Se decantó el etanol y el remanente se eliminó con nitrógeno. Se añadieron entonces 150 μl (para cerebro y riñón) y 300 μl (para hígado) de tampón TE (TRIS-HCl 10 mM, EDTA-Na2 1 mM, pH 8), se

resuspendieron las muestras y se añadieron 10 μl de RNAsa.

Tras 6 minutos de incubación a temperatura ambiente, se añadieron 0,3 ml de SDS a 0,1%, pH 12,5. Se incubaron a 65º C otros 6 minutos, se añadieron 230 μl de acetato sódico 3 M, pH 4,8 y se volvieron a incubar a -20º C durante 20 minutos.

Cuando las muestras se descongelaron, se centrifugaron a 10000g 5 minutos, se recogió el sobrenadante y se añadió igual volumen de isoropanol. Se incubaron 5 minutos a temperatura ambiente.

Seguidamente se centrifugó a 10000g 10 minutos, se decantó el sobrenadante y se añadieron 0,5 ml de etanol al 70% frío, volviéndose a centrifugar durante 5 minutos. Se decantó el etanol y las muestras se secaron con nitrógeno22_{, resuspendiéndose entonces en 35 μl}

(cerebro y riñón) o 50 μl (hígado) de tampón TE, pH 8.

Las muestras se mantuvieron en frío (4º C) durante aproximadamente 30 minutos (o toda la noche) para permitir su completa disolución.

Una vez bien disuelto el ADN en el tampón TE, pH 8, y medida la concentración por espectrofotometría (Genequant, Biochrom), se añadieron a las muestras 40 μl de acetato sódico 3 M, pH 4,8, y 800 μl de etanol al 70% frío; se centrifugaron a 10000g 10 minutos y, al término de la centrifugación, se decantó el sobrenadante y se añadió de nuevo 1 ml de etanol al 70% frío, y se volvió a centrifugar. Se eliminó el etanol de las muestras y se secaron con nitrógeno. El ADN se resuspendió en 100 μl de acetato sódico 20 mM, pH 4,8 y, por último, se incubaron las muestras a 50º C durante 1 hora.

Materiales y Métodos

3.2. Digestión del ADN mitocondrial

Tras la hora de incubación a 50º C, se añadieron a las muestras 20 µl de nucleasa P1 (5 U / muestra) disuelta en acetato sódico 20 mM, pH 4,8, que contenía cloruro de zinc 10 mM y 15% de glicerol, y se incubaron a 50º C durante 30 minutos.

A continuación se añadieron 20 µl de fosfatasa alcalina (4 U / muestra), y se repitió la incubación durante 1 hora.

Por último se transfirieron las muestras a eppendorffs con filtro Whatman y se centrifugaron a 13000 rpm durante 20 minutos. De los filtrados se tomaron 100 µl para inyectar en HPLC.

3.3. Condiciones cromatográficas

La determinación de los niveles de 8-oxodG y de dG se realizó por HPLC, a través de detección electroquímica y ultravioleta, respectivamente.

La cuantificación de dG por el detector ultravioleta se realizó a 254 nm con una sensibilidad de 0,64 en todos los experimentos, mientras que las condiciones del detector electroquímico variaron de unos experimentos a otros: 400 mV / 20 nA (subobjetivo 1.1) y 225 mM / 10 nA (subobjetivos 1.2, 1.3 y objetivo 2).

La fase móvil utilizada (ácido fosfórico 50 mM, acetonitrilo al 2,5%, pH 5) se filtró a través de filtros de diámetro de poro 0,45 µm. El flujo de paso de fase móvil fue de 1 ml/min a una presión de 1000 PSI en los experimentos del subobjetivo 1.1 y del objetivo 2, y de 0,9 ml/min en los subobjetivos 1.2 y 1.3.

3.4. Cálculo de las concentraciones de dG y 8-oxodG

Para cuantificar los valores obtenidos, se inyectaron cada día estándares de dG y de 8- oxodG de concentraciones conocidas. Así, en el caso de la dG, se inyectó una solución estándar de dG pura 100 µM en acetato sódico 10 mM, pH 4,8 y TRIS 1 M, pH 8 (11:1). Para la 8-oxodG, la solución estándar inyectada fue de 20 nM en el mismo solvente.

Materiales y Métodos

A partir de las áreas obtenidas con los estándares se obtuvo un factor de calibración (F.C) para 8-oxodG y para dG:

- F.C. (8-oxodG) =

10

10

A

donde: A10: Área del estándar 10 nM de 8-oxodG.

- F.C. (dG) =

100

100

dG

A

donde: AdG100: Área del estándar de dG 100 µM.

La concentración de 8-oxodG se obtuvo mediante la siguiente expresión:

- [8-oxodG] = Area8oxodG ×· F.C (8oxodG)

donde: Area8oxodG: Área de 8-oxodG de la muestra.

La concentración de dG se obtuvo mediante la siguiente expresión:

- [dG]= AreadG × F.C (dG)

donde: AreadG: Área de dG de la muestra.

Finalmente, se obtuvo la razón 8-oxodG / 105 dG como indicador del daño oxidativo al ADN:

Materiales y Métodos

4. ANÁLISIS DE LA COMPOSICIÓN DE LOS ÁCIDOS GRASOS DE LOS LÍPIDOS