Appendix F: Model Verification - Module 6: Air Quality Local Assessment

40 Figura 3. Muestras con presencia de STEC según tipo de corte

Al ajustar por las dos variables independientes, mediante la prueba de Hosmer-Lemeshow, persisten las diferencias encontradas en el modelo de regresión logística binaria y éstas aumentan su riesgo (Tabla 12).

41 Tabla 12. Modelo de regresión logística para la presencia de STEC ajustado por el tipo de corte y país de origen.

Prueba de bondad de ajuste Hosmer-Lemeshow (p=0,395)

Detección genotípica de shigatoxinas e intimina por PCR múltiple: Al realizar

el PCR desde la zona de confluente de crecimiento bacteriano, se observó que de las 20 muestras de carne bovina con presencia de STEC, el 55% presentó sólo el gen stx2, seguido por un 35% que presentó los genes stx1/stx2 y un 10% sólo el gen stx1. Una vez aisladas las cepas, ninguna presentó el gen eae, que codifica para la producción de la proteína intimina (Tabla 13).

Tabla 13. Detección de los genes stx1 y stx2 desde carne bovina

Gen N° de muestras con STEC

stx1 – stx2 7/20(35%) stx1 2/20(10%) stx2 11/20 (55%) País de origen OR 95% IC p Cuarto Posterior 7,738 2,291 -26,141 0,001 Argentina 7,628 1,885 -30,864 0,004 Australia 1,252 0,198 -7,899 0,811 Brasil 0,899 0,144 -5,633 0,910 EEUU 0,000 0,000 -0,000 0,999 Uruguay 18,245 3,117 -106,809 0,001

42 Caracterización genotípica de las cepas aisladas de STEC: A partir de las 20

muestras positivas a shigatoxina por PCR múltiple, se logró aislar 20 cepas de STEC con distinto perfil toxigénico, a las cuales se les caracterizó genotípicamente, de acuerdo a los factores de virulencia.

Detección genotípica de las variantes de shigatoxinas: Los genotipos de Stxs

detectados en las cepas aisladas de carne, fueron: Stx1a, Stx2a, Stx2b, Stx2c, y Stx2d. Estas variantes se presentaron solas o en combinación de dos o más genes (Tabla 14).

Tabla 14. Presencia de las variantes de Stx aisladas desde carne bovina

Detección genotípica de E. coli O157: Los resultados arrojados por el PCR

stx

_2b

stx

_2c

1/20 (5%)

stx

_2c

3/20 (15%)

43 Detección de los genes efa1, ent, saa, hlyA, iha, lpf y efa1 no-O157: Del total

de cepas aisladas, en el 65% se detectó por PCR los genes hlyA y saa, y en el 60% el gen iha. No hubo presencia del resto de los genes de virulencia (Tabla 15).

Tabla 15. Presencia de los factores de virulencia: hlya, saa y iha en cepas STEC aisladas desde carne bovina

Determinación de serogrupos de STEC: El 50% de las cepas fueron

consideradas no tipificables (NT). De los serogrupos que se logró identificar, el más prevalente fue el O113, correspondiendo al 30% del total de las cepas aisladas. Con una frecuencia más baja fueron identificados los serogrupos O174, O141 y O8 correspondiendo al 10 y 5% respectivamente. (Tabla 16).

Tabla 16. Determinación de los serogrupos de STEC en cepas aisladas desde carne bovina

Factores de virulencia Cepas STEC aisladas de carne bovina

hlyA 13/20 (65%)

saa 13/20 (65%)

iha 12/20 (60%)

Serogrupo Número de cepas Porcentajes

O113 6/20 30%

O174 2/20 10%

O141 1/20 5%

O8 1/20 5%

44 Electroforesis de campo pulsado: El análisis de los productos de restricción

obtenidos al digerir el genoma de las cepas STEC aisladas desde carne bovina, permitió identificar dieciocho patrones de bandas diferentes. El grado de semejanza entre las cepas se representó gráficamente como un dendrograma de homología (Fig. 4), donde se puede observar que las cepas con códigos 194-8 y 1-10, quedan separadas del resto (<40% de similitud). En los recuadros destacados, se observa la presencia de 2 grupos mayoritarios (A y B) con bajo porcentaje de similitud (alrededor de 50%). El grupo A contiene 3 subgrupos, que tampoco tienen una relación muy estrecha (< 60% de similitud). Las cepas que presentaron patrones con un alto porcentaje de similitud (> 90 %), fueron aislados de la misma muestra de carne y del mismo país de oirigen.

El PFGE, permitió determinar que el grado de similitud genética que existe entre las cepas de STEC aisladas desde carne bovina, es bajo, lo que sugiere que presentan una alta diversidad genética y no es posible establecer asociaciones entre ellas, con el país de origen, frigorífico y supermercado.

45 Figura 4. Dendrograma que muestra la relación clonal entre las diferentes cepas STEC aisladas desde carne bovina.

Las muestras de carne bovina, positivas para la detección por PCR de genes stx, fueron tomadas en distintos establecimientos de comercialización en Santiago y provenían de diversos frigoríficos, de variadas localidades y países de origen en donde la carne se faena, se envasa al vació y se certifica.

Cabe destacar que de una muestra de carne fue posible aislar más de una cepa y cada una de ellas con serogrupos y perfil toxigénico distintos (Anexo 5).

N°

cepa Serogrupo

Perfil

toxigénico Local Frig. País de

46 DISCUSION

En el presente estudio se logró detectar STEC en muestras de carne bovina selladas al vacío de procedencia nacional e importada que expenden las principales cadenas de supermercados de Santiago de Chile. El porcentaje de muestras de carne con presencia de STEC fue de 6,6% (20/304), lo que pone de manifiesto que el consumo de carne en Chile es un potencial riesgo para la salud de la población infantil. Otros resultados obtenidos a partir del análisis de muestras de hamburguesas crudas y productos carnicos de origen bovino nacionales e importados, describieron una frecuencia de aislamiento de 4,2% (9/213) de STEC (Alexandre et al, 1999). Es importante destacar que a pesar de haber utilizado técnicas diagnósticas distintas en ambos trabajos, mostraron resultados similares. Alexandre et al detectó la presencia de shigatoxinas utilizando anticuerpos monoclonales específicos para Stx1 y Stx2 mediante la técnica de ELISA y en nuestro estudio, se detectaron los genes específicos de los factores de virulencia stx1, stx2 y eae, mediante PCR múltiple.

Esta tesis tuvo como objetivo no sólo detectar y aislar STEC O157 si no también determinar la presencia de STEC no-O157, evitando la utilización de inhibidores del crecimiento tales como novobiocina, telurito y cefixime.

Diversos estudios, en distintos países, han aislado éste patógeno desde carne, describiendo una prevalencia de STEC O157 que fluctúa entre 0,4 a 3,7% y de STEC no-O157 que fluctúa entre 2,4 a 30% (Hussein, 2007). Lo anterior, difiere de nuestros resultados, debido a que del total de muestras analizadas, sólo se logró aislar e identificar cepas no-O157. Sin embargo, Vidal et al (2010) mostraron que de un total de 385 muestras obtenidas de heces bovinas faenadas en la Región Metropolitana, sólo una presentó O157:H7 en su contenido intestinal. En este sentido, un mayor número de muestras analizadas por país, probablemente permitirían detectar O157. A pesar de ello nuestros resultados pueden deberse también al hecho de no haber utilizado la metodología epecífica para enriquecer aislados de STEC O157, fundamentalmente en lo referido al uso de agar MacConkey Sorbitol (SMAC) y el enriquecimiento del medio para lograr mayor

sensibilidad y especificidad en el aislamiento de éste serotipo (INEI-ANLIS y OPS, 2011). Sumado a lo anterior es importante considerar que el aislamiento de STEC desde carne es complicado debido a que éstas bacterias se encuentran en bajo número y compitiendo con otras bacterias de la microbiota de la carne (Brusa et al, 2013).

Al analizar las muestras de carne de Chile, se logró detectar 3,4% de STEC, similar a lo descrito por Burgos et al en el año 2003, que detectaron la presencia de genes de shigatoxinas en el 0,89% (2/226) de las muestras de canales bovinas nacionales faenadas en la Región Metropolitana. El menor porcentaje de aislamiento en carnes nacionales selladas al vació, se puede explicar por la baja colonización de STEC en bovinos de nuestro país. Esto podría estar directamente relacionado con mejoras en la producción animal, lo que se traduce también en un buen manejo sanitario y por lo tanto, en una disminución en la presencia de esta bacteria (Vidal et al, 2010). Además, la mayor parte de la carne bovina que se produce en Chile se exporta y el mercado en el cual está enfocado Chile son principalmente países desarrollados (UE, Japón, EEUU) que tienen altos estándares de calidad, debido a lo cual los planteles nacionales deben cumplir con estos requisitos. Sin embargo, a pesar de la baja prevalencia de STEC en las carnes bovinas de nuestro país, es necesario la incorporación de medidas de control más efectivas sobre todo en las etapas críticas de producción (sacrificio y evisceración) para disminuir el riesgo de contaminación con STEC a lo largo de la cadena agroalimentaria y de ésta manera poder asegurar la calidad e inocuidad de la carne nacional.

En el caso de la carne de origen importada, los resultados de los análisis estadísticos indicaron que tanto Argentina como Uruguay se asociaron significativamente con presencia de STEC en carnes selladas al vacío (OR: 5,4; OR: 8,6 respectivamente), siendo Chile el país de comparación o de referencia. De lo anterior se puede inferir que la posibilidad de encontrar STEC en carne importada desde Argentina es cinco veces más que en la carne de Chile, y a su vez, la carne proveniente de Uruguay tendría 8 veces más posibilidades de

presentar STEC que la carne de nuestro país. Estos resultados se pueden asociar con un estudio realizado en Argentina por Padola et al en el año 2004, donde se describió una alta prevalencia de STEC (63%) en bovinos de ese país lo que podría explicar el mayor porcentaje de STEC en carnes. Además, estudios previos realizados en Argentina reportaron un alto nivel de contaminación con STEC en carne molida (15,3%, 11/72) donde se aislaron cepas con perfiles altamente virulentos (Miccio et al, 2011). Otro estudio realizado en Argentina, donde se analizó por PCR 95 muestras de hamburguesas de carne bovina congelada, también mostraron una prevalencia de STEC significativa (8,4%) (Gómez et al, 2002). Lo anteriormente expuesto, es relevante debido a que en Argentina el SHU ha sido descrito desde el año 1964, siendo actualmente el país donde se registra la mayor incidencia mundial, con más de 400 casos nuevos por año (Miccio et al, 2011; Masana et al, 2011). En relación a Uruguay, un estudio realizado por Varela et al en el año 2008, describió una prevalencia de 1,8% (4/220) de STEC del serotipo O157:H7 en muestras de carne picada. Lamentablemente no existen referencias en Uruguay que describan la presencia de STEC no-O157, a pesar de ello, nuestros resultados muestran una prevalencia de STEC significativamente mayor (24%, 4/17, Fig. 1).

Un estudio reciente realizado en EE.UU. mostró que el 7,3% (300/4133) de las muestras de carne molida fueron positivas para STEC no-O157 (Bosilevac y Koohmaraie, 2011), mientras que en Australia la tasa de positivos fue del 16% (46/285) (Barlow et al, 2006). Estos reportes indican prevalencias mucho más altas que las encontradas en nuestro estudio donde las muestras de carne provenientes de Australia presentaron una baja prevalencia de STEC (4%, 2/53). En el caso de las muestras provenientes de EEUU, en ninguna de ellas se detectó presencia de STEC, sin embargo éste resultado no es representativo debido a la baja cantidad de muestras recolectadas (0/3).

Por otro lado, en Brasil se ha descrito una prevalencia de STEC de 3,5% (4/114) en muestras de carne molida (Bergamini et al 2007), porcentaje similar a lo obtenido en este estudio en carnes provenientes de ese país (2%, 2/89). La baja prevalencia de STEC en carne bovina podría explicar la incidencia relativamente

baja de SHU en Brasil (Souza et al, 2011). Sin embargo, es muy difícil comparar las tasas de infección por STEC en los distintos países debido a las diferencias en los métodos de detección de STEC de cada estudio, en los procedimientos de muestreo, en el número de muestras analizadas y la técnica de aislamiento de la bacteria, pudiendo afectar los datos de prevalencia.

Varios autores señalan que el mayor riesgo de contaminación de las canales bovinas ocurre durante el proceso de faena, cuando el contenido intestinal o heces tienen contacto con la superficie de la carne (Arthur et al, 2010; Edwards y Fung, 2006). Es así como se ha descrito que la contaminación con STEC en los cuartos posteriores de la canal bovina es significativamente mayor que en los cuartos anteriores (Etcheverría et al, 2010). Estos datos coinciden con los resultados de nuestro estudio pues la mayor prevalencia de STEC se observó en los cortes pertenecientes al cuarto posterior de la canal bovina como por ejemplo, ganso (29%, 4/14), abastero (18%, 4/22) y pollo ganso (17%, 4/23), determinando que estos tipos de cortes de carne, se asociacian significativamente con la presencia de STEC(OR= 6,7).

Nuestro estudio, realizó la búsqueda de los genes stx1 y stx2 en las muestras de carne, detectando en un 90% el gen stx2. Este antecedente es muy importante, debido a que la proteína Stx2 codificada en éste gen, es el principal responsable de la falla renal en el SHU y tiene una actividad citotóxica de 100 a 1000 veces superior a Stx1 (Paton y Paton, 2002; INEI-ANLIS y OPS, 2011). Por lo tanto, la mayor prevalencia de stx2 en aislados de STEC en carne, podría relacionarse a un mayor riesgo de incidencia de casos clínicos más graves de esta patología. Si bien las Stx muestran similitud en su estructura y función, cada una de las variantes (Stx1 y Stx2) presenta grandes diferencias en su toxicidad en tejidos celulares y especies animales. Las cepas aisladas en este estudio, presentaron distintos genotipos de stx, predominando los genes stx1a, stx2a, stx2c y stx2d . Estos resultados son muy relevantes debido a que éstos genes se han asociado a cuadros clínicos severos en humanos (Friedrich et al, 2003; Jelacic et al, 2003). En relación al gen stx2b, sólo se detectó en una de las cepas y se ha

asociado principalmente a cuadros diarreicos no complicados (Friedrich et al, 2003).

Por otro lado, el gen eae, que codifica para la producción de la proteína intimina, no se logró identificar en ninguna de las cepas analizadas . Aunque la presencia de este gen está mayormente asociada con la capacidad de las cepas de STEC para causar cuadros graves de SHU, la síntesis de intimina no es esencial para la patogénesis, dado que existen cepas negativas para el gen eae que se han aislado en pacientes con SHU (Paton et al 1999). Además de la capacidad de producir Stx e intimina, STEC puede tener otros factores de virulencia, codificados por distintos genes que les confiere la capacidad de adherirse a las células del epitelio intestinal. Entre estos genes de virulencia, los más estudiados y caracterizados son ent, efa1, hlyA, iha, saa y lpf (Vidal et al, 2007).

El gen saa, fue descrito por primera vez por Paton et al en el año 2001 y detectado en cepas STEC que carecían del gen eae. Estas cepas negativas para la presencia de intimina igual fueron capaces de generar cuadros de SHU, pudiendo ser la fimbria Saa un importante mecanismo de adherencia ante la ausencia de intimina. En esta tesis, el gen saa fue detectado en el 65% de las cepas (13/20), las cuales no poseían el gen eae, concordando con lo descrito por Paton (2001). Además, un estudio reciente describió que gran parte de las STEC aisladas desde carne bovina picada presentaban el gen saa (73%) y estaba presente sólo en ausencia del gen eae (Bosilevac y Koohmaraie, 2011), resultado similar a lo obtenido en nuestro estudio. Por otra parte, estudios realizados en Chile han descrito al gen saa como la adhesina más frecuentemente aislada desde productos alimenticios (Vidal et al, 2007).

Respecto al gen hlyA, también se detectó con una alta frecuencia (65%). Esta hemolisina estaría presente en la mayoría de las STEC, tanto eae positivas como eae negativas, pero su patogenia en cuadros de SHU es aún incierta (Nataro y Kaper, 1998). Recientemente, se ha descrito que hlyA, está presente en el 96% de las cepas STEC aisladas de pacientes con diarrea aguda, síndrome disentérico y SHU, lo que sugiere que la hemolisina codificada por éste gen tiene un rol

importante en las cepas STEC para producir infección en humanos (Vidal et al, 2010). Además, estudios llevados a cabo en Chile y Argentina demostraron que la mayoría de los aislados de STEC desde heces de bovino presentaron éste gen (67,3% y 46% respectivamente) (Blanco et al, 2004; Vidal et al, 2012).

En relación al gen iha, éste se detectó en un 60% de los aislados. Sin embargo, a pesar de estar ampliamente distribuido entre las STEC (Tarr et al, 2000), aún no existe claridad de su importancia en la virulencia de éste patógeno (Vidal et al, 2010).

Por otro lado, si bien el gen lpf junto a stx2 han sido los factores de virulencia con mayor asociación a cuadros graves de SHU, (Torres et al, 2009) en nuestro estudio, ninguna de las cepas aisladas fue positiva para su detección.

Respecto a los serogrupos obtenidos en este trabajo, el 100% correspondió a cepas STEC no-O157. En orden de mayor a menor frecuencia se identificó los serogrupos O113, O174, O141 y O8 representando el 50% del total de cepas aisladas. El 50% restante correspondió a serogrupos O no tipificables (NT), lo que sugiere que podrían ser otros serogrupos que no están incluidos dentro del esquema de tipificación serológica utilizado. Informes publicados en los últimos 25 años, sobre contaminación de carne bovina con STEC revelan que existe alrededor de 98 serogrupos O y más de 160 serotipos diferentes (O:H). De éstos, se han descrito 40 serotipos aislados desde pacientes con SHU (Hussein, 2007), incluyendo las STEC O113, O174, O141 y O8 caracterizadas en nuestro estudio. Otros resultados indican que STEC O8 y O113 también han sido aislados desde carne picada (Bosilevac y Koohmaraie, 2011) y son serotipos que se han asociado a casos de SHU y colitis hemorrágica a nivel mundial (Brusa et al, 2013).

En base a los resultados obtenidos en este estudio y considerando que en nuestro país STEC es endémico y su principal mecanismo de transmisión es el consumo de carne bovina, es importante establecer programas de control que sean frecuentes y periódicos para mejorar la bioseguridad a nivel de predio, de matadero y en las distintas etapas de producción. Medidas como reducir la densidad de animales durante el transporte y en el predio, podrían evitar la

transmisión de cepas entre animales y hacia el ambiente. Por otro lado, evitar la contaminación cruzada en las plantas de faenamiento, sobre todo durante la etapa de evisceración, debiera ser una preocupación constante. A su vez, es fundamental, la aplicación de medidas educativas y preventivas relativas al consumo de carne bien cocida, evitar la contaminación cruzada durante la manipulación de los alimentos y promover el consumo de productos cárnicos frescos y procesados, que involucren conceptos de calidad e inocuidad y con ello influir en la reducción de los casos de SHU.

Los resultados de este estudio, se pueden extrapolar al resto de las regiones del país, pues se analizó un adecuado número de muestras de carne bovina, la técnica que se utilizó para la detección de STEC en carne es altamente sensible y específica, las muestras se recolectaron desde los supermercados de Santiago, que es donde se realiza la mayor parte de las ventas de carne en Chile, debido a que geográficamente, el mercado agroalimentario se encuentra concentrado en aquellas zonas donde habita la mayor parte de la población chilena.

53 CONCLUSIONES

• Existe presencia de STEC en muestras de carnes bovinas selladas al vacío (6,6 %) de procedencia nacional e importada que están a la venta en los supermercados de Santiago.

• Las muestras de carne bovina chilena presentan un bajo porcentaje de STEC.

• Los análisis estadísticos indicaron que tanto Argentina como Uruguay se asociaron significativamente con presencia de STEC en carnes selladas al vacío, independiente del tipo de corte (p< 0,05).

• Los cortes de carne pertenecientes al cuarto posterior de la canal bovina, se asocian significativamente con la presencia de STEC, independiente del país de origen (p<0,05).

• Las cepas aisladas en este estudio, presentan serogrupos y genes de virulencia (toxinas y adhesinas) previamente descritos en cepas de STEC aisladas de casos clínicos de CH y SHU en humanos.

• Los resultados obtenidos en este estudio, ponen de manifiesto que el consumo de carne mal cocida es un potencial riesgo para la salud de la población infantil y adulto mayor.

54 RECOMENDACIONES

 Incluir STEC en el Reglamento Sanitario Chileno de Alimentos orientado a la búsqueda de los genes de shigatoxinas.

In document Module 6: Air Quality Local Assessment (Page 165-172)