Appendix

Otro de nuestros objetivos fue estudiar la expresión hepática de Prohepcidina en condiciones de elevada demanda de Fe como es la Anemia Hemolítica.

El hígado de ratones No Anémicos mostró moderada expresión de Prohepcidina, localizada en hepatocitos y no en células de Kupffer. La expresión de la proteína no estuvo asociada a ninguna estructura vascular específica (Figura 59).

También se evaluó la expresión de Prohepcidina durante los días de anemia severa (día 3 y 4), cuando la disminución de Hb y HCT sugirió masiva destrucción eritrocitaria y elevadas demandas de Fe para compensar el cuadro anémico (Capítulo I), y durante la etapa de recuperación de la anemia.

En la anemia aguda y en la recuperación de la anemia se observó moderada expresión de Prohepcidina, sin hallarse cambios importantes respecto al tejido de ratones No Anémicos (Figura 60).

En el control negativo no se evidenció inmunomarcación inespecífica en el tejido hepático (Figura 61).

Figura 59. Expresión de Prohepcidina Hepática. Un grupo de animales (n=3) fue sacrificado y el tejido se procesó para Inmunohistoquímica utilizando anticuerpo anti-Prohepcidina de ratón y el kit EnVision+System-HRP (DAB) según se describe en Materiales y Métodos. Se muestra moderada expresión intracelular de Prohepcidina en hepatocitos. X 400 (A), X 1000 (B). VS: Vaso sanguíneo. Escala: 30 µm

Figura 60. Expresión de Prohepcidina Hepática en Anemia. Ratones hembras se anemizaron con FHZ. Un grupo de animales (n=3) fue sacrificado y el tejido se procesó para Inmunohistoquímica según se describe en Materiales y Métodos. Se muestra moderada expresión de Prohepcidina (día 4). X 400 (A), X 1000 (B). VS: Vaso sanguíneo. Escala: 30 µm

Figura 61. Control Negativo para Prohepcidina en Tejido Hepático en Anemia. Ratones hembras se anemizaron con FHZ. Un grupo de animales (n=3) fue sacrificado y el tejido se procesó para Inmunohistoquímica según se describe en Materiales y Métodos, en ausencia del anticuerpo primario y con el kit EnVision+System-HRP (DAB). No se observa marcación inespecífica. X 400. Escala: 30 µm

2. MODELO DE SOBRECARGA DE HIERRO

En una primera etapa evaluamos la expresión de DMT1 y Hepcidina en órganos claves del metabolismo del Fe, en condiciones de actividad eritropoyética normal y en condiciones fisiopatológicas como Anemia en estado de suficiencia de Fe. En una etapa posterior se propuso avanzar en el estudio de estas proteínas frente al exceso de Fe.

De acuerdo a lo descripto en Materiales y Métodos, ratones hembra se dividieron en: a) Sin Sobrecarga de Fe (n=10): solución salina estéril (NaCl 0,9 %) i.p. los días 0 y 10; b) Con Sobrecarga de Fe (n=10): 1,0 g Fe-Dextrán/Kg peso i.p. los días 0 y 10 del protocolo experimental. Los días 0, 10 y 20 un lote de animales de cada grupo fue sacrificado (n=3), se realizó la disección del hígado, duodeno y bazo, los que se procesaron para estudios histológicos e inmunohistoquímicos.

2.1. TRANSPORTADOR DE METALES DIVALENTES 1

2.1.a. TEJIDO DUODENAL

En el duodeno de ratones con Sobrecarga de Fe se identificó expresión de DMT1 en los enterocitos, con localización intracelular. No se identificó DMT1 en las criptas duodenales y en células caliciformes (Figura 62). Estos resultados muestran un patrón de expresión similar al hallado en duodeno de animales con suficiencia de Fe, sin evidenciarse cambios en la intensidad de la expresión.

Es importante mencionar que el perfil de expresión de DMT1 coexistió con elevados niveles de Fe hepático en ratones con Sobrecarga de Fe (día 20: día 20: 4840,73 ± 1565,91 µmol Fe/g tejido vs día 0: 293,07 ± 22,1 µmol Fe/g tejido), y con elevados niveles de Ferremia, lo que confirma la presencia del exceso de Fe en este grupo experimental.

En el control negativo no se evidenció inmunomarcación inespecífica en el tejido duodenal (Figura 63).

El estado de Sobrecarga de Fe se confirmó con la valoración de los depósitos duodenales de Fe3+. El tejido de ratones con Sobrecarga de Fe no mostró pigmentos de

Fe en enterocitos duodenales, un resultado similar al hallado en tejido de ratones sin Sobrecarga. Sin embargo, frente a la Sobrecarga se vieron abundantes depósitos de Fe localizados selectivamente en el tejido conectivo (Figura 64).

Figura 62. Expresión de DMT1 Duodenal en Sobrecarga de Fe. Ratones hembras se trataron con Fe-Dextrán. Un grupo de animales (n=3) fue sacrificado y el tejido se procesó para Inmunohistoquímica utilizando anticuerpo policlonal anti-DMT1 de ratón y el kit EnVision+System-HRP (DAB) según se describe en Materiales y Métodos. Se muestra expresión intracelular de DMT1 en las vellosidades duodenales el día 20 (A, B). Se muestra ausencia de DMT1 en las criptas duodenales el día 20 (flecha) (C, D). X 400 (A, C), X 1000 (B, D). Escala: 30 µm

Figura 63. Control Negativo para DMT1 en Tejido Duodenal en Sobrecarga de Fe. Ratones hembras se trataron con Fe-Dextrán. Un grupo de animales (n=3) fue sacrificado y el tejido se procesó para Inmunohistoquímica según se describe en Materiales y Métodos en ausencia del anticuerpo primario y con el kit EnVision+System-HRP (DAB). No se observa marcación inespecífica (día 20). X 400. Escala: 30 µm

Figura 64. Tinción de Perl’s en Tejido Duodenal en Sobrecarga de Fe. Ratones hembras se trataron con Fe-Dextrán. Un grupo de animales (n=3) fue sacrificado y el tejido se procesó para la Tinción de Perl’s según se describe en Materiales y Métodos. Se muestran abundantes pigmentos de Fe férrico en el tejido conectivo de las vellosidades (flecha) (día 20). X 400 (A), X 1000 (B). Escala: 30 µm

2.1.b. TEJIDO HEPÁTICO

En sobrecarga de Fe se identificó marcada expresión DMT1 en el hígado. El transportador, localizado intracelularmente, se distribuyó en forma homogénea en el hígado. Es interesante destacar que su expresión fue más evidente en las células hepáticas que rodean los grandes vasos sanguíneos (Figura 65). En el control negativo no se evidenció inmunomarcación inespecífica en el tejido hepático (Figura 66).

Es importante mencionar que la presencia de DMT1 coincide con elevados niveles hepáticos de Fe (Capítulo I), lo que revela el rol de DMT1 como importador de Fe cuando los niveles del metal son excesivos.

Dado que el hígado es el órgano de depósito del Fe por excelencia, es esperable contar con altos niveles de Fe en condiciones de sobrecarga. Efectivamente, como se describió en el Capítulo I, el hígado de animales con Sobrecarga de Fe mostró abundantes pigmentos de Fe en forma de hemosiderina, evaluado por Tinción de Perl`s.

Es necesario aclarar nuevamente que para evaluar cualitativamente el Fe hepático por la Tinción de Perl`s en el hígado y en forma simultánea identificar DMT1 en el mismo tejido, fue necesario utilizar un estrategia metodológica combinando la técnica inmunohistoquímica con la Tinción de Perl’s. Esta estrategia permitió discriminar la expresión de DMT1 de la presencia de Fe3+.

Mediante esta estrategia experimental confirmamos la expresión de DMT1 en el interior de los hepatocitos cercanos a grandes vasos en tejido de ratones con Sobrecarga de Fe. Cabe destacar además, que nuestros resultados sugieren ausencia de colocalización de DMT1 con los depósitos de hemosiderina, debido a que la expresión de DMT1 no coincide con las concreciones de Fe halladas en células con morfología de células de Kupffer (Figura 67).