Application of multi-level concept

Varias proteínas asociadas con la respuesta bacteriana a condiciones de estrés mostraron un aumento moderado pero significativo durante la infección intracelular. Se encontró que la chaperona GroEL y la cochaperona GroES aumentaron significativamente sus respectivos niveles a las 3 h post infección y permanecieron elevados aún a las 48 h post infección. Por otra parte, la chaperona ClpB permaneció sin cambios durante las primeras 3 h post infección comparado con bacterias control pero mostró un incremento significativo a las 48 h post infección. Las condiciones de estrés tienden a desnaturalizar y agregar a las proteínas. Las chaperonas juegan un rol relevante en la sobrevida bajo estas condiciones evitando el efecto perjudicial de la acumulación de proteínas mal plegadas. Mientras que la expresión de GroEL es particularmente importante ya que previene la desnaturalización y el agregado de proteínas [66], ClpB es capaz de desagregar y reactivar proteínas fuertemente agregadas en conjunto con el sistema de chaperona DnaK [67, 68]. Estudios previos demostraron que la actividad de ClpB es crucial para la sobrevida transitoria de E. coli en condiciones de calor extremo [69]. Otros estudios muestran que ClpB está involucrada en la resistencia al estrés en varias especies bacterianas, como Staphylococcus aureus [70], Helicobacter pylori [71],

Campylobacter jejuni [72] y Brucella suis [73]. Cabe destacar que ClpB es requerida para

la sobrevida intracelular de Porphyromonas gingivalis [74] y Staphylococcus aureus [70], y que es expresada en el estadio intracelular por Piscirickettsia salmoni [75]. Por otra parte, se ha sugerido que la chaperona GroEL y la cochaperona GroES, además de los roles que cumplen en el plegado de proteínas, estarían involucradas en otras actividades en bacterias patogénicas intracelulares. En particular, se ha encontrado que estas proteínas pueden intervenir varios procesos de la célula huésped, como el tráfico de organelas, las vías de señalización celular y la organización de microfilamentos de actina [76]. Estos resultados sugieren que la inducción de proteínas de estrés en patógenos intracelulares

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podría no sólo ayudar a sobrellevar las condiciones ambientales desfavorables encontradas dentro de la célula hospedadora sino también influenciar la interacción huésped-patógeno, favoreciendo el establecimiento de infecciones intracelulares [77]. Otros estudios serán necesarios para determinar si GroEL/GroES y ClpB cumplen otras funciones además del rol de prevenir la acumulación de proteínas mal plegadas, que pudieran ser relevantes para la sobrevida intracelular de B. pertussis.

Los estudios de proteómica también indican que la proteína Hfq, un factor central de la regulación postranscripcional en bacterias, aumenta su abundancia en bacterias intracelulares alcanzando un aumento significativo a las 48 h post infección. Hfq es una chaperona que facilita el apareamiento de bases nucleotídicas entre los ARN mensajeros y los ARN no codificantes en respuesta al estrés y otras señales ambientales, generando la activación transcripcional, la represión y/o la degradación de los ARN mensajeros [78], según el caso. Estudios previos demostraron que Hfq se induce en bacterias expuestas a condiciones extremas como golpes de calor [79], estrés osmótico, la presencia de etanol y en la fase estacionaria de crecimiento [80]. Asimismo, Hfq está involucrada en la regulación de varios procesos biológicos, incluyendo la resistencia al estrés y la virulencia [80-88]. En B. pertussis, la falta de Hfq resulta en una reducción de la expresión de proteínas de respuesta a estrés, como GroEL, y varios factores de virulencia, incluyendo el sistema de secreción de tipo III (SST3), el autotransportador Vag8 y el factor de colonización traqueal (Tcf) [81]. Además, estudios previos mostraron que la ausencia del gen hfq resulta en una capacidad reducida de B. pertussis para sobrevivir en la línea celular de macrófagos murinos RAW 246.7 [82], sugiriendo un rol relevante de este factor de regulación postranscripcional en la sobrevida intracelular de este patógeno. El incremento en la abundancia de Hfq en B. pertussis intracelular en el presente estudio parece confirmar que esta proteína tiene un rol en la respuesta coordinada a los cambios ambientales que ocurren durante la adaptación de esta bacteria al ambiente intracelular. Asimismo, sugieren que la adaptación de B. pertussis a este ambiente involucra mecanismos de regulación post transcripcionales en los que intervienen ARN pequeños.

El estrés oxidativo se encuentra entre las condiciones que las bacterias tienen que enfrenar durante la infección intracelular de células inmunes [89]. El estudio del proteoma de B. pertussis no mostró cambios en la abundancia relativa de proteínas involucradas en la detoxificación de metabolitos del oxígeno, como las enzimas catalasa (KatA), superóxido dismutasa (SodA/SodB), porfobilinogeno deaminasa (HemC) y alquil

119 hidroperóxido reductasa (AhpC). Esto concuerda con resultados previos que sugieren que

Bordetella es capaz de modular la respuesta oxidativa de los macrófagos a través de la

acción de la toxina adenilato ciclasa (CyaA) [90-92]. A su vez se ha encontrado que la catalasa y la superóxido dismutasa no son esenciales para la sobrevida intracelular de B.

pertussis [93, 94].

Finalmente, el análisis proteómico mostró la inducción de la respuesta SOS durante el período intracelular, evidenciada por el incremento de BP2506 (RecN), una proteína involucrada en la reparación del ADN, en bacterias intracelulares. Los niveles de esta proteína se observaron aumentados a las 48 h post infección comparado con las bacterias recuperadas a las 3 h post infección. También se observó un incremento en UvrC, una subunidad de una posible endonucleasa también implicada en la reparación del ADN, en tiempos tempranos de infección. Cabe destacar que el nivel de UvrC permaneció elevado durante todo el periodo de infección.