BASIC SCIENCE STUDY

8.1 Modelo de inflamación inducido por LPS

Se utilizaron ratones hembras C57BL/6J de 11-13 semanas de edad (Charles-River

Laboratories) mantenidos en el animalario de la Unidad de Cirurgía Experimental del Hospital

Universitario La Paz o en el animalario de la Facultad de Medicina (UAM). Los experimentos fueron aprobados por el comité ético de experimentación animal del Instituto de Investigación del Hospital Universitario La Paz (IdiPAZ).

Los ratones se trataron durante 1 noche con el compuesto EBM-T78d (2mg/kg) mediante inyección intra-peritoneal y durante 4 horas con LPS (1,5mg/kg) y otra dosis del compuesto en el grupo control que no lleva LPS. Posteriormente se sacrificaron mediante dislocación cervical y se inyectó 1ml de PBS en la cavidad peritoneal. El lavado peritoneal se centrifugó y se midieron las citoquinas pro-inflamatorias (TNF-α, IL1-β e IL-6) en el lavado peritoneal y en los sobrenadantes de las células peritoneales cultivadas in vitro durante una noche sin re- estimular mediante citometría de flujo siguiendo las instrucciones del fabricante (FlowCytomix

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α, MCP-1 e IL-6 en suero y en los bazos extirpados de cada ratón. Las células del bazo se cultivaron en DMEM/10% FBS a 200.000 células/ml tratándose O/N con el compuesto EBM- T78d en presencia o ausencia de LPS 10ng/ml durante 4 horas analizando los niveles de la citoquinas TNF-α, MCP-1 e IL-6 en el sobrenadante celular.

También se obtuvieron macrófagos de la médula ósea (fémur) de ratón, se pre-trataron 12 horas con el compuesto EBM T78d (1µM) y posteriormente se estimularon durante 4 horas con LPS (10ng/ml). Se midieron las concentraciones de MCP-1 y TNF-α en el sobrenadante celular de los macrófagos.

Se estudió por citometría el fenotipo de las células peritoneales y los esplenocitos usando los anticuerpos de ratón CD19-FITC (BD), CD3-APC (BD), F4/80-PE-Cy7 (eBioscience), CD11b-PE

(BD) y Gr1-APC (BD).

8.2 Modelo de diálisis peritoneal (DP)

Se ensayó el compuesto EBM-T78d en un modelo de diálisis peritoneal en ratón según González-Mateo y colaboradores(Gonzalez-Mateo et al., 2009), en el que se diseñó un catéter unido a un puerto de acceso vascular (Pennyport) (Access Technologies, USA). Este catéter consta de 10 agujeros situados en el extremo del mismo, que permiten la salida del líquido, previniendo posibles obstrucciones. Tras anestesiar los ratones intraperitonealmente con 100 mg/kg de ketamina y 10 mg/kg de xilacina e isofluorano como anestesia inhalatoria, se introdujo el catéter en la cavidad peritoneal. El puerto de acceso vascular se colocó subcutáneamente en el lomo de los animales para evitar pinchar reiteradamente el peritoneo de los ratones al inyectar el líquido, reduciendo el riesgo de infecciones y hemoperitoneo y se evitó causar una inflamación debida al procedimiento.

Transcurrida una semana de recuperación tras la operación, comenzó el tratamiento con el líquido de diálisis Stay Safe 4,25% (tampón de lactato con 4,25% de glucosa, de Fresenius

C57BL/6 O/N EBM T78d (2mg/kg) _{LPS (1.5mg/kg)} 4H _Sacrificio Lavado peritoneal Suero Células peritoneales Células del bazo Higado/riñón citoquinas cultivo Citoquinas en SN Tinción C57BL/6 O/N EBM T78d (2mg/kg) _{LPS (1.5mg/kg)} 4H _Sacrificio Lavado peritoneal Suero Células peritoneales Células del bazo Higado/riñón

citoquinas

cultivo Citoquinas en SN Tinción

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Medical Care, Alemania). Durante 1 mes se inyectó 1 mL de líquido diariamente en la cavidad

peritoneal de los ratones junto con el compuesto EBM T78d en los grupos correspondientes a distintas dosis. Al finalizar el experimento se sacrificaron los animales y se analizaron las citoquinas más representativas en el lavado peritoneal y el sobrenadante de las células peritoneales puestas en cultivo sin estimular. Además se recogió higado, riñón, grasa epididimal, se analizó el grosor de la membrana peritoneal y se contabilizaron las células del infiltrado con el programa Image-Pro-Plus del microscopio (Leika CTR6000).

8.3 Estudios histológicos

Inmediatamente después del sacrificio de los animales se les extrajo el hígado y el riñón, que se lavó con una solución de cloruro sódico 0,9% (Meinsol®, Fresenius Kabi) y se fijó en formaldehído 10% durante al menos 48 horas. Una vez fijado, el tejido se deshidrató mediante lavados con alcohol de concentración creciente y xilol, hasta su inclusión en parafina. Los bloques de parafina se cortaron en el microtomo en secciones de 5μm, que se recogieron en portaobjetos de cristal recubiertos de silano y se mantuvieron a 37ºC antes de teñirlos.

8.3.1 Tinción con hematoxilina-eosina

Para teñir los cortes con hematoxilina-eosina, éstos se desparafinaron en xilol durante 5 minutos y se rehidrataron después mediante baños de 5 minutos en alcoholes de concentración decreciente, hasta pasar a una cubeta con agua destilada. A continuación, los portaobjetos se introdujeron en otro recipiente con hematoxilina de Harris (Merck) durante 20 segundos y se lavaron dos veces con agua corriente antes de pasarlos a una cubeta con eosina

(Merck) al 0,15% en etanol-acético (ácido acético 4% en etanol de 96º) donde se tiñeron

durante 1 minuto. El exceso de colorante se eliminó tras 4 minutos de inmersión en 96% ETOH y los cortes se deshidrataron de nuevo para montarlos con cubreobjetos de cristal utilizando medio de montaje DPX.

8.3.2 Tinción con tricrómico de Masson

Los cortes se tiñeron mediante tricrómico de Masson para analizar el grosor de la membrana peritoneal mediante microscopía óptica (Leika CTR6000, with a Leika Microsystems LAS-

AF6000).

Los cortes se desparafinaron en xilol en este caso durante 30 minutos y se rehidrataron después de igual manera que la tinción con hematoxilina-eosina. Para el material fijado en

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formaldehído se realizó el montaje en Bouin(Sigma) toda la noche a RT. A continuación los cortes se enfriaron, se lavaron con agua destilada hasta que desapareció el color amarillo y se tiñeron con hematoxilina durante 5 minutos. Se lavaron los portas con agua corriente 1 minuto y con agua destilada varias veces. Posteriormente se tiñeron las muestras con Fuscina ácida durante 2-5 minutos y se lavaron dos veces con agua destilada tiñéndose después los portas con la solución de ácido fosfomolíbdico- fosfotúngstico durante 10 minutos. Sin lavar se tiñeron con azul de anilina 5 minutos y después se lavaron con agua destilada de nuevo. Por último se añadió ácido acético al 1% durante 2 minutos, se lavó, se deshidrató, se aclaró y se montó con DPX.