En la última década, varios avances se han establecido con respecto a la caracterización del proceso de formación de biofilm en Bordetella, en parte gracias al estudio en B. bronchiseptica. En la Figura 5 se resume lo reportado hasta el momento sobre los factores y mecanismos de regulación caracterizados o que se ha observado que se encuentran involucrados en el desarrollo de biofilm en Bordetella.
Los primeros estudios que demostraron la capacidad de formación de biofilm en el género Bordetella, se orientaron a analizar la participación del sistema de regulación BvgAS. Experimentos in vitro utilizando a B. bronchiseptica y B. pertussis, junto con cepas derivadas bloqueadas en fase Bvg- demostraron que la formación de biofilm ocurre bajo condiciones Bvg+, mientras que se reprime en condiciones Bvg- [121, 123]. Estos resultados revelaron indirectamente la participación de los factores de virulencia regulados por BvgAS en el desarrollo de biofilms. Por otro lado, estudios en B.
A B
C D E
Figura 4. A-B. Dibujos de cortes histológicos del tejido ciliado de la tráquea publicado hace más de 100 años. En A se representa el tejido normal, mientras que en B, el tejido de un paciente que falleció de Tos convulsa [1]. C-D. Tinción inmunohistoquímica de B. pertussis presente en tráquea y en bronquiolos [2]. E. Micrografía electrónica de escaneo de explantos humanos nasales infectados con B. pertussis. En todos los casos se pueden observar grandes números de bacterias sobre las células ciliadas formando agregados [8].
bronchiseptica han mostrado que sería en la fase Bvgi donde se produce el máximo nivel de biofilm para esta bacteria [124]. Estas condiciones aún no han sido analizadas en el contexto de B. pertussis, pero sugiere una participación e interacción entre diferentes factores de virulencia que favorecerían, o no, al desarrollo del biofilm.
Otros mecanismos han sido descriptos en su participación en la regulación del proceso. Uno de ellos, es mediado por la molécula GMP-di-c, una molécula intracelular que actúa a nivel de transducción de señales y regulación de expresión de genes. Esta molécula cumple un rol clave en la decisión entre un crecimiento planctónico o sésil, actuando a nivel de un amplio rango de efectores controlando así la transcripción y la actividad de diversas enzimas [185, 186]. Sisti y colaboradores demostraron que la sobreexpresión de la molécula c-di-GMP, especialmente en condiciones de cultivo Bvgi, incrementa el nivel de biofilm formado por B. bronchiseptica. A su vez, han demostrado que el c-di-GMP regula de forma negativa la expresión del flagelo (presente únicamente en B. bronchiseptica), contribuyendo posiblemente al desarrollo sésil [187].
Figura 5. Modelo del desarrollo de biofilm por Bordetella spp. Células planctónicas inician el proceso de adhesión regulado por BvgAS. En este paso, una etapa Bvg- es promovida en B. bronchiseptica, donde se expresa su flagelo. En B. pertussis, FHA es la principal adhesina. Bps es el polisacárido que se encuentra involucrado en la adhesión al epitelio nasal. Las microcolonias se diferencian a una estructura de biofilm maduro, el cual presenta estructuras de capas de bacterias rodeadas de una matriz extracelular y canales de agua de forma irregular. Varios puntos de regulación han sido caracterizados, entre ellos BvgAS, (p)ppGpp, GMP-di-c y BpsR. Bps y ADNe, como componentes de la matriz extracelular, promueven la estabilidad de las microcolonias, junto con FHA, la cual facilita el contacto cercano entre células y con el substrato, posiblemente junto con Fim. ACT inhibe el desarrollo de biofilm en B. bronchiseptica, mediante un mecanismo que podría involucrar su interacción con FHA. Modificado de Cattelan y colaboradores [5].
Por otro lado, se ha reportado que la alarmona (p)ppGpp, que es acumulada en el citoplasma de bacterias que se encuentran bajo estrés nutricional, favorece la expresión de Fim3 y Bsp22, un efector del Sistema de Secreción Tipo III. En estas condiciones, las dos proteínas se encuentran formando proyecciones en forma de filamentos que favorecerían la interacción entre bacterias vecinas, y, de este modo, la formación de biofilm en B. pertussis [188]. Tanto la regulación de la producción de c-di-GMP como de (p)ppGpp son independientes de BvgAS [187, 188].
A modo de comprender de forma más extensiva el significado de la formación de biofilms en la patogénesis de B. pertussis, la identificación de los factores involucrados dentro de este proceso es de vital importancia. Como se detalló previamente, los hallazgos de que bajo condiciones de modulación, B. pertussis y B. bronchiseptica son incapaces de formar biofilms, sugiere que los genes vags son importantes para la formación del biofilm. Además, debido a que la formación de un biofilm es iniciada por la adhesión de células planctónicas a una superficie, las adhesinas jugarían un rol esencial en este proceso. Experimentos in vitro, y algunos in vivo, han demostrado la participación de FHA y Fim en la adhesión y desarrollo del biofilm [124, 189]. Ha sido reportado que estas dos proteínas forman estructuras que facilitarían, en B. pertussis, la interacción no sólo bacteria-sustrato, sino también bacteria-bacteria. En particular, Irie y colaboradores reportaron que la atenuación de la formación de biofilm en mutantes de B. bronchiseptica defectivos en Fim y FHA era dependiente de la fase Bvg [124]. Por un lado, el mutante por deleción de Fim se mostró afectado en la formación de biofilm bajo condiciones Bvg+, mientras que el mutante por deleción de FHA mostró un defecto en el crecimiento en biofilm bajo condiciones Bvgi. A su vez, este estudio reveló que la deleción de la toxina ACT resulta en un aumento en la formación de biofilm, lo que sugiere que ACT podría directa o indirectamente inhibir la formación de biofilm en B. bronchiseptica [124][110]. Debido a que ACT se expresa de forma máxima en la fase Bvg+, mientras que FHA es expresada en las fases Bvg+ y Bvgi [107], se ha especulado que la interacción entre FHA y ACT en la fase Bvg+ es la que llevaría a un fenotipo de biofilm más débil [190]. B. pertussis presenta un perfil de expresión similar de FHA y ACT, motivo por el cual sería interesante estudiar si la interacción entre ambas proteínas tiene el mismo efecto en B. pertussis, y si la fase Bvgi favorece el desarrollo de forma más fuerte de biofilm.
Para la formación de un biofilm maduro, las bacterias presentes en una microcolonia necesitan producir y secretar componentes de la matriz extracelular, como proteínas, lípidos, ADN y principalmente polisacáridos. Parise y colaboradores han identificado un locus (bpsABCD) requerido para la producción de poli-b-1,6-N-acetil-D- glucosamina, también conocido como polisacárido Bps [122]. Los autores demostraron que la formación de biofilm se inhibe al agregar dispersina B (una enzima degradadora de polisacárido) tanto en B. pertussis como en B. bronchiseptica o bien al delecionar el locus bpsABCD en B. bronchiseptica. Estos resultados fueron también corroborados in vivo, donde el mutante por deleción de bpsABCD no fue capaz de producir biofilms robustos en el tracto respiratorio de ratones. Más aún, ha sido demostrado que el rol del polisacárido Bps se encuentra restricto en etapas de colonización temprana y en la formación de biofilms en la cavidad nasal y en la tráquea, pero no en los pulmones [191]. El polisacárido Bps fue caracterizado como una adhesina, debido a que media específicamente la adhesión a células epiteliales humanas de la cavidad nasal y no a células epiteliales humanas de pulmón. Estos hallazgos sugieren que el receptor al cual Bps se uniría, se encuentra en células del tracto respiratorio superior, y que la formación de biofilm podría ser específicamente importante para la colonización y posiblemente para la transmisión.
Conover y colaboradores también demostraron que el ADN es un componente importante de la matriz de biofilms de Bordetella [192]. El agregado de DNasaI al inicio del crecimiento en biofilm produce una inhibición en la formación de biofilm. Por otro lado, el tratamiento de biofilms maduros con DNasaI llevó a la disrupción de la biomasa, demostrando que el ADN extracelular actúa como un componente estructural de la matriz, no sólo in vitro, sino también in vivo.
A pesar de los importantes avances realizados en la última década sobre el proceso de formación de biofilm en Bordetella, los aspectos moleculares de este proceso de desarrollo sésil son aún motivo de investigación y representan potenciales implicancias significativas en el diseño de nuevas estrategias terapéuticas y de control de pertussis.