Durante la maduración de la semilla se han descrito distintos programas reguladores de la transcripción. Uno de los más estudiados es el que regula la expresión de genes que codifican proteínas de reserva (SSPs). Este programa está conservado entre semillas de monocotiledóneas y dicotiledóneas, a pesar de que ocurra en distintos tejidos: el endospermo y los cotiledones, respectivamente (Vicente-Carbajosa y Carbonero, 2005).
El análisis funcional de los promotores de los genes que codifican SSPs en cebada, trigo y otros cereales, permitió identificar, entre otros CREs, un elemento regulador bipartito, la Caja del Endospermo (EB, Endosperm Box;
Figura 1.14), responsable de la expresión espacio-temporal de estos genes durante la fase de maduración del endospermo (Vicente-Carbajosa y col., 1992). Este elemento regulador contiene dos secuencias de unión a distintas proteínas:
El Motivo GLM (GCN4‐Like Motif), 5’‐(G/A)TGA(G/C)TCA(T/C)‐3’, es reconocido por TFs de tipo bZIP, de la subfamilia Opaco2 (O2) de maíz (Hartings y col., 1989; Schmidt y col., 1990) y sus ortólogos en cebada, BLZ1 y BLZ2 (Onate y col., 1999; Vicente-Carbajosa y col., 1998), y SPA en trigo (Albani y col., 1997).
La caja de Prolaminas (PB, Prolamin Box), 5’‐TGTAAAG‐3’ (Forde y col., 1985), que interacciona con el factor transcripcional de la familia DOF PBF (Prolamine Binding Factor) en maíz (Vicente-Carbajosa y col., 1997), así como con su ortólogo en cebada BPBF (Barley Prolamin Binding Factor), en trigo WPBF (Wheat Prolamin Binding Factor), y RPBF (Rice Prolamine Binding Factor) en arroz (Mena y col., 1998; Yamamoto y col., 2006). En cebada, se han descrito otras proteínas tipo DOF que interaccionan con este elemento como son SAD, HvDOF19 y HvDOF17 (Diaz y col., 2005; Moreno-Risueño, 2006), siendo activadores las dos primeras mientras que la última es un represor transcripcional (Figura 1.14).
El tránscrito de BLZ1 se detecta en los primeros estados del desarrollo del endospermo de cebada. Es un gen de copia única que está implicado en la regulación del gen Hor2 que codifica una B-Hordeína a través de la unión al elemento GLM de su promotor (Vicente-Carbajosa y col., 1997). BLZ1 funciona como un activador transcripcional y es capaz de formar tanto homodímeros como heterodímeros con BLZ2, siendo los heterodímeros activadores más potentes que los homodímeros en experimentos de expresión transitoria (Onate y col., 1999). Otro bZIP asociado a la transactivación del gen Hor2 es HvbZIP53 (Alonso, 2007).
BPBF transactiva la transcripción del gen Hor2 mediante la unión con el elemento PB, en experimentos de expresión transitoria (Mena y col., 1998). Se ha demostrado, que el TF de la familia DOF, SAD, compite por la unión al
elemento PB con BPBF, observándose, en experimentos de expresión transitoria, un efecto aditivo sobre la transactivación del gen Hor2 cuando ambos TFs están presentes (Diaz y col., 2005). HvDOF19 y HvDOF17 también regulan la expresión del gen Hor2, a través de la interacción con la caja PB; HvDOF19 actuando como activador, mientras que HvDOF17 lo hace como represor (Diaz y col., 2005; Moreno-Risueño, 2006). Interacciones reguladoras positivas se han demostrado entre TFs de las dos familias descritas hasta el momento, como es el caso de BLZ2 y BPBF (Rubio-Somoza y col., 2006a) y BLZ2 y HvDOF19 (Moreno-Risueño, 2006). Estudios de ligamiento, utilizando una población de 224 accesiones de cebada, asociaron polimorfismos en la secuencia de DNA que codifica BLZ1, BLZ2 y BPBF con caracteres agronómicos importantes en cebada como el peso seco de 100 granos, contenido total de proteínas y almidón en semillas, tiempo de floración, altura de la planta, etc (Haseneyer y col., 2010).
El factor transcripcional de tipo MYB-R2R3, GAMYB, que se describió inicialmente como activador de genes que codifican hidrolasas inducidos por GA en aleurona durante la germinación (Gubler y col., 1995; Gubler y col., 1999), también regula la expresión de genes durante el desarrollo del grano. Su tránscrito se ha detectado en granos en desarrollo, tanto en el endospermo amiláceo como en la capa de aleurona, así como en embriones inmaduros. Su proteína es capaz de transactivar, en experimentos de expresión transitoria, el gen Hor2 a través del reconocimiento y la unión a la secuencia MBS (Myb Binding Site), 5’‐(C/T) AACA‐3’ (Diaz y col., 2002). Esta transactivación tiene un efecto aditivo cuando interacciona con los factores transcripcionales tipo DOF BPBF y SAD (Diaz y col., 2005; Diaz y col., 2002). Otros TFs de la familia MYB, pero en este caso pertenecientes a la subfamilia R1-SHAQYF, MCB1 y HvMYBS3, regulan positivamente la expresión de genes que se expresan durante la maduración del endospermo mediante la unión a la secuencia CRE 5’‐TATC‐3’ / 5’‐GATA‐3’ y la formación de un complejo ternario, junto con BLZ2 y BPBF, que resulta en una transactivación más eficaz (Rubio-Somoza y col., 2006a; Rubio-Somoza y col., 2006b).
identificado en cebada el ortólogo del gen FUSCA3 de A. thaliana, denominado HvFUS3, que pertenece a esta familia. La proteína HvFUSCA3 reconoce la caja RY y transactiva la expresión del gen Hor2. Además, HvFUS3 interacciona con BLZ2 produciéndose un efecto cooperativo en la activación del gen (Moreno-Risueno y col., 2008).
De forma análoga, los genes que codifican SSPs en A. thaliana que son expresados durante los procesos de la maduración de la semilla en los cotiledones, contienen en sus regiones promotoras elementos comunes con los descritos en cereales, y unen TFs ortólogos. Las relaciones de cooperación entre estas unidades reguladoras parecen haber evolucionado siguiendo unos patrones conservados que podrían haberse originado con la aparición de las plantas superiores (Vicente-Carbajosa y Carbonero, 2005). En A. thaliana, los TFs de la familia bZIP, bZIP10 y bZIP25, ortólogos de los factores bZIP de la subfamilia Opaco-2 en cereales, reconocen elementos CRE en los promotores de los genes que codifican proteínas de reserva, como At2S1 y CRU3, activando su expresión mediante su interacción con DOF17 y ABI3 (ABSCISIC ACID INSENSITIVE3), este último ortólogo al gen VIVIPAROUS-1 de cebada (Lara y col., 2003). Estos factores de tipo bZIP se han clasificado dentro de la subfamilia C en A. thaliana (Jakoby y col., 2002). En el subgrupo S1 de los bZIPs de A. thaliana, se ha identificado a bZIP53 como un regulador clave de los genes que codifican SSPs; la interacción de bZIP53 con bZIP10 o bZIP25, produce un efecto sinergístico sobre la expresión de dichos genes (Alonso y col., 2009).
Estas interacciones jugarían un papel muy importante en el control cuantitativo de los niveles de transcripción de genes que codifican SSPs. La cooperación entre TFs de distintas familias mediante interacciones es un eficiente mecanismo de regulación de expresión génica en semillas, integrando distintas señales.
Figura 1.14. Elementos reguladores en cis y TFs que los reconocen en promotores de los genes que codifican proteínas de reserva en semillas. Esquema de la estructura de los promotores de (A) B-Hor, gen que codifica una B‐Hordeína de cebada y (B) At2S1, que codifica una albúmina 2S de A. thaliana. Las cajas representan motivos conservados en cis: RY, elemento RY; GLM, motivo GCN4‐like; PB, caja de prolaminas. El efecto de los TFs en la regulación transcripcional se ha representado con flechas () si son activadores y con flechas truncadas (-I) si son represores. Adaptación (Vicente‐Carbajosa y Carbonero., 2005).
Trabajos paralelos demostraron que algunos de estos factores transcripcionales descritos no sólo tienen un papel regulador en desarrollo sobre las proteínas de reserva, sino que también intervienen en la regulación de los genes expresados durante la germinación. Así, los reguladores que durante el desarrollo tenían un papel activador de la transcripción de los genes de reserva, en la germinación pueden seguir desempeñando ese papel (como ocurre con SAD y GAMYB) o tener un papel antagonista (como p.e. BPBF, HvDOF19 y HvMCB1). A todo esto hay que añadir la regulación hormonal a la que se ve sometida la expresión de todas estas proteínas, resultando las redes de regulación de una gran complejidad.
La función de la capa de aleurona en los granos de cereales en germinación es la de sintetizar y liberar enzimas hidrolíticas para movilizar las reservas amiláceas almacenadas en el endospermo. Los genes que codifican estas enzimas (p.e. amilasas y proteasas) se inducen por GAs, que son sintetizadas por el embrión tras la imbibición, y difunden hasta la capa de aleurona. El estudio de las regiones promotoras de estos, permitió la identificación de un motivo tripartito conservado denominado GARC (GA- Responsive-Complex; Skriver y col., 1992). En este elemento se pueden identificar los motivos siguientes (Figura 1.15):
El motivo GARE, 5´‐TAACAA/GA‐3´, reconocido por TFs de la familia R2R3-MYB.
La caja de Pirimidinas (complementaria al elemento PB), 5´‐C/TCTTTC/T‐3´, reconocida por TFs de la familia DOF.
El motivo 5´‐TATCCAC/T‐3´, reconocido por TFs de la familia R1MYB- SHAQKYF.
Mutaciones en el GARE suprimen la inducción por GAs, mientras que la mutación de cada una de las otras dos cajas conservadas produce la disminución de esta respuesta, siendo necesario el GARC íntegro para una respuesta completa (Cejudo y col., 1992; Cercós y col., 1999; Gubler y Jacobsen, 1992). GAMYB, interacciona con el elemento GARE del gen que codifica α‐amilasa de bajo y alto pI, Amy2/32b y Amy6-4, respectivamente, y del gen que codifica una proteasa tipo Catepsina, Al21, en cebada (Gubler y col., 1995; Gubler y col., 1999). También, el represor transcripcional HRT, con tres dedos de zinc no canónicos, interacciona con el elemento GARE actuando como regulador negativo de la expresión de estos genes (Raventós y col., 1998). Los TFs de la familia DOF que regulan positivamente la transcripción de los genes que codifican hordeínas durante la maduración, BPBF, SAD, y HvDOF19, interaccionan con la caja de pirimidinas identificada en el motivo GARC, regulando la expresión de los genes que codifican hidrolasas; también se ha demostrado que HvDOF17 interviene en la regulación de estos genes, si bien la interacción física con el motivo no ha podido ser demostrada in vitro. Con la excepción de SAD, que es un activador en ambas fases del desarrollo de la semilla (maduración y germinación), los otros tres DOFs son reguladores
negativos de la expresión génica durante la germinación, revirtiendo parcialmente la activación mediada por GAMYB (Isabel-LaMoneda y col., 2003; Mena y col., 2002; Moreno-Risueno y col., 2007a). Tanto en arroz como en cebada, se han descrito TFs de la familia R1MYB‐SHAQKYF que se unen al tercer motivo que constituye el GARC (5´‐TATCCAC/T‐3´). En experimentos de expresión transitoria en aleuronas de cebada, HvMCB1 ejerce un papel represor, mientras que HvMYBS3 regula positivamente la transcripción (Rubio- Somoza y col., 2006a; 2006b).
En los promotores de los genes que codifican α‐amilasas de alto y bajo pI, se ha identificado un cuarto motivo, O2S, que sería reconocido por TFs de la subfamilia Opaco2 de bZIPs, análoga al motivo GLM. El análisis funcional de este motivo ha demostrado la implicación en la respuesta a GA de estos genes (Lanahan y col., 1992). En cebada, se han identificado cuatro genes que codifican bZIPs pertenecientes a esta subfamilia, BLZ1-4 (Fuentes-López, 2008; Onate y col, 1999; Vicente-Carbajosa y col, 1998). Todos ellos interaccionan con este elemento, y mediante experimentos de expresión transitoria, se ha demostrado que son reguladores negativos de la transcripción.
La regulación transcripcional mediada por GA durante la germinación de las semillas de cereales, no parece estar conservada en A. thaliana. Gracias a análisis transcriptómicos de semillas deficientes en GA, se han identificado genes que son inducidos por estas hormonas durante la imbibición, y mediante el análisis “in silico” de sus promotores, se ha observado la ausencia de sobre- representación del motivo GARE, lo que sugiere la existencia de otros elementos responsables de esa regulación específicos de dicotiledóneas (Ogawa y col., 2003). Al analizar los genes reprimidos por tratamientos con GA, se observa una sobre-representación del motivo ABRE (Ogawa y col., 2003). Se conocen algunos TFs A. thaliana que son rápidamente inducidos por la presencia de esta hormona. Entre ellos se encuentran distintos miembros de las familias MYB y DOF (Sun y Gubler, 2004). Entre los TFs de tipo DOF destacan DAG1 y DOF6, como represores durante la germinación, y DAG2, como activador transcripcional (Gualberti y col., 2002; Rueda-Romero y col.,
Figura 1.15. Elementos reguladores en cis y TFs que unen los promotores de los genes que codifican hidrolasas en aleurona de cebada en post‐germinación. Esquema de la estructura del promotor del gen Amy6‐4 que codifica una α-amilasa de alto‐pI. Las cajas representan motivos conservados en cis: PYR, caja de pirimidinas; GARE, Elemento de respuesta a GA; caja TATC y O2, caja OPACO2. Los motivos encuadrados representan el Complejo de Respuesta a GA (GARC). El efecto de los TFs en la regulación transcripcional se han representado con flechas () si son activadores y con flechas truncadas (-I) si son represores.