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La producción de auxinas como el AIA por parte de las cepas seleccionadas fue cuantificada usando el reactivo de Salkowsky y midiendo la absorbancia a 530 nm. Con los datos de la absorbancia en función de la concentración se hizo una curva de regresión lineal para determinar la ecuación de la recta: y=25,87x-2,8233; la cual mostró un coeficiente R2 =0,9839 (Figura 6). Se consideró una dispersión adecuada de los valores sobre la recta, por lo tanto se empleó dicha ecuación para el cálculo de las concentraciones de AIA producidas por las cepas evaluadas.
Figura 6: Determinación de la curva estándar de Ácido Indolacético. Solubilización de fosfato (mm)
Cepas Rango promedio Medias reales
B8 84.50 a 70 EA2 42.50 c 35 EBa21 84.50 a 70 EBe3 21.50 d 25 J4 63.50 b 55 J11 7.50 e 20 L2 42.50 c 35
36 Todas las cepas fueron capaces de producir AIA (Tabla 7). Los mayores niveles se obtuvieron con las cepas EBe3, EBa21, EA2 y L2 con valores significativamente superiores; seguido por J4 y B8. Se supone que las concentraciones obtenidas en algunas cepas pueden ser suficientes para tener una influencia directa en la fitoestimulación, si se tiene en cuenta que los reguladores del crecimiento vegetal actúan a bajas concentraciones para ejercer esta función.
Tabla 7: Determinación de la producción de AIA por las cepas evaluadas.
Medias con letras desiguales en la columna denotan diferencias significativas según prueba HSD Tukey para p< 0,05.
4.5 Caracterización molecular de las cepas
La secuenciación del gen que codifica para el ARNr 16S mostró que todas las cepas secuenciadas pertenecen al género Streptomyces con una homología del 99% (Tabla 8). Aunque Streptomyces albus es la cepa homóloga más cercana a las cepas EA2 y L2, es poco probable que éstas sean la misma cepa no sólo porque fueron aisladas a partir de fuentes diferentes sino porque su comportamiento es diferente en varios ensayos que se han desarrollado con las mismas.
Tabla 8: Homología de las cepas de actinomicetos. AIA
Cepas Medias reales Error estándar
B8 4.15 bc ± 0.90 EA2 8.31 ab ± 1.42 EBa21 9.82 a ± 2.35 EBe3 6.84 ab ± 2.11 J4 5.51 bc ± 2.37 J11 2.50 c ± 1.12 L2 7.87 ab ± 1.58
37
Cepa Organismo Homólogo más cercano
(BLASTN) %
B8 Streptomyces flavofungini 99
EA2 Streptomyces albus 99
EBa21 Streptomyces lividans 99
EBe3 Streptomyces albidoflavus 99
J4 Streptomyces intermedius 99
J11 Streptomyces lavendulae 99
DDiiscscuussiióón n
38
5 DISCUSIÓN
5.1 Efecto del antagonismo de las cepas sobre los hongos fitopatógenos del suelo
Los resultados obtenidos en el estudio concuerdan con los descritos por Getha et al., (2005), quienes demostraron que los actinomicetos son agentes potenciales de control biológico contra hongos fitopatógenos como Fusarium sp. por ser fuente de metabolitos secundarios, antibióticos y enzimas líticas.
Cabe resaltar que un posible motivo por el que no todas las cepas evaluadas hayan presentado inhibición frente a los hongos, puede justificarse teniendo en cuenta la influencia que ejerce el cambio de las condiciones naturales, en las cuales normalmente los dos microorganismos se desarrollan. Generalmente en condiciones de laboratorio, el crecimiento de los actinomicetos se hace más lento al igual que su esporulación (Franco- Correa, 2008).
Según Ezziyyani et al., (2004) los fenómenos de antagonismo en hongos pueden ser explicados por diversos mecanismos incluyendo antibiosis y parasitismo; la inhibición en el crecimiento diametral del hongo puede ser atribuido a la presencia de algunas sustancias inhibitorias excretadas por los actinomicetos. El grado de inhibición varía por factores como: la temperatura, el pH y el medio de cultivo empleado, demostrando que el medio PDA intensifica la inhibición.
Los resultados obtenidos en el estudio concuerdan con los descritos por Dávila et al., (2013), quienes demostraron que de los 70 actinomicetos aislados, 25 fueron antagonistas para Alternaria sp., Rhizoctonia sp., Fusarium sp., y Colletotrichum sp. A su vez concuerdan con los resultados obtenidos por Iznaga et al., (2003), quienes demostraron que de 563 actinomicetos, 286 fueron capaces de producir componentes con actividad antifúngica.
Asimismo, Rico (2009) reportó que de los 45 aislamientos de actinomicetos evaluados, 22 resultaron ser antagonistas contra Fusarium solani y 19 contra Rhizoctonia solani, siendo la cepa A1-42/08 la que presentó el porcentaje de inhibición más alto.
Por otra parte, Molano et al., (2000) observaron la inhibición in vitro del crecimiento de Fusarium oxysporum a partir de la actinomicina, un antibiótico producido por Nocardia sp.,
39 cepa aislada de una muestra de suelo rizosférico de liquen (Mosquera-Colombia). La producción de dicho metabolito secundario resultó ser tóxico para el hogo fitopatógeno. También Gomes et al., (2000) en su ensayo de inhibición del crecimiento micelial de agentes fitopatógenos por cepas de actinomicetos, demostraron la inhibición total del crecimiento de Fusarium solani, Fusarium graminearum y Fusarium oxysporum.
Los resultados obtenidos por Abyad et al., (1996), al evaluar cepas de actinomicetos aislados de suelos cultivados contra patógenos del tomate, mostraron que las cepas de Streptomyces pulcher, S. canescens y S. citrof luorescens, fueron las más activas contra Fusarium oxysporum f.sp. lycopersici, Verticillium alboatrumy y Alternaria solani. De igual forma Castillo et al., (2001), reportaron cepas de actinomicetos aislados de la rizósfera de plántulas de papa con porcentajes de inhibición de hasta 87% contra Rhizoctonia solani. Otros de los resultados que concuerdan con los obtenidos en dicha investigación son los de Sánchez et al., (2011) quienes aislaron y evaluaron 29 cepas de actinomicetos; y obtuvieron como resultado que solo 11 mostraron una inhibición sobre Colletotrichum lindemuthianum con un promedio de 31.2 %; y solo 3 cepas presentaron actividad inhibitoria contra R. solani con un promedio de 42.3 % de inhibición.
Asimismo, Castillo (2004) reportó que de 90 cepas de actinomicetos, 24 presentaron actividad contra R. solani con una inhibición promedio de 57%, la mejor cepa fue AC77 con un 87% de inhibición.
También Jianyou et al., (2011) observaron que las cepas S. roseobiolascens XAS585 y S. roseofulvus XAS588 mostraron efecto inhibitorio contra el crecimiento micelial de los hongos: Botrytis cinerea, Alternaria alternate, Fusarium f. cucumerinum, Colletotrichum gloeosporioides, Bipolaris sorokiniana, Sclerotinia scleroitiorum, Valsa mali y Cercospora sorghi; siendo la segunda cepa la que exhibió el mejor efecto antagonista excepto frente a B. sorokiniana; donde S. roseobiolascens XAS585 mostró un 90% de inhibición contra ese fitopatógeno.
Franco-Correa (2008) reportó que la inhibición del crecimiento micelial se debe a productos antifúngicos y no a la producción de la quitinasa, ya que cepas con actividad quitinolítica no produjeron inhibición del crecimiento micelial. Es importante tener en
40 cuenta que no todos los antibióticos que posiblemente producen los actinomicetos que se aislaron pueden inhibir o afectar el desarrollo de los hongos evaluados.
También Priya (2012) en su investigación obtuvo que un 18,5% de las cepas evaluadas presentaron actividad antagonista contra Fusarium solani, 12.3% contra Phytophthora infestans, 30.7% contra Macrophomina phaseolina, un 32.3% contra Botrytis cinerea y un 38.5% contra Rhytisma acerinum. Los resultados obtenidos por la autora son inferiores a los nuestros; mientras que los valores obtenidos contra M. phaseolina en su investigación variaron desde 0,3-17,30 mm, los nuestros variaron desde 2 hasta 40mm.
Errakhi et al., (2009) obtuvieron que de 195 aislados de actinomicetos más del 80% (157) de éstos presentaron actividad antagonista hacia por lo menos uno de los hongos fitopatógenos evaluados. En dicho estudio, Streptomyces scabies EF35 fue la única cepa activa contra S. rolfsii con sólo 15,9% (31/195) de actividad. Esto concuerda con lo obtenido en el presente estudio, ya que de 69 cepas evaluadas solo dos fueron capaces de presentar actividad antagónica contra S. rolfsii.
De 12 cepas evaluadas en el estudio de Cuesta et al., (2012) 8 presentaron actividad antagonista en menor, intermedio y mayor grado contra Sclerotinia sclerotiorum, mientras que en el presente estudio se obtuvo que 26 de 69 cepas evaluadas fueron capaces de presentar actividad antagonista con valores entre 2-25 mm.
Actualmente es distribuido en Europa un bioplaguicida denominado Mycostop® que contiene micelio y esporas de Streptomices griseoviride para proteger cultivos frente a Fusarium sp. y Alternaria sp. La acción de este plaguicida se basa en una compleja interacción biológica, después que el producto ha sido introducido dentro del sustrato de crecimiento, el organismo coloniza la rizosfera y empieza a secretar metabolitos secundarios (Sánchez y Cantero, 2001).
Estos resultados constituyen el inicio de futuros estudios en Cuba relacionados con la actividad antagonista de los actinomicetos, frente a hongos fitopatógenos que afectan la germinación y desarrollo vegetativo del frijol y de otros cultivos.
5.2 Efecto de la actividad enzimática extracelular 5.2.1 Actividad Quitinolítica
Las enzimas de tipo quitinasas han recibido especial interés por el control que ejercen sobre patógenos del suelo. Concretamente se ha descrito la purificación, caracterización
41 de enzimas hidrolíticas quitinasas y β-1,3-glucanasas producidas por Trichoderma sp. y Talaromyces flavus, microorganismos que ejercen efecto antagónico por micoparasitismo sobre S. rolfsii, R. solani y Fusarium sp. (Franco-Correa, 2008).
Es posible que el pH empleado en la reacción enzima/sustrato haya favorecido la actividad de las quitinasas debido a que al ser secretadas por bacterias del suelo presentan preferencia por un pH cercano a la neutralidad (Swiontek et al., 2007).
Las siete cepas de actinomicetos que se evaluaron fueron capaces de utilizar la quitina coloidal como única fuente de carbono, mostrando crecimiento y presentando una zona de hidrólisis alrededor de la colonia, indicando actividad quitinolítica, esto concuerda con lo reportado por Swiontek et al., (2007).
Hsu y Lockwood (1975) demostraron en su estudio un crecimiento más efectivo de aislamientos de actinomicetos marinos cuando se empleó agar quitina coloidal con sales minerales, en relación a lo sucedido en un medio ausente de éstas. Asimismo, para la selección del medio, se tuvo en cuenta lo reportado por Safarida et al., (2006), quienes señalaron la importancia de los micronutrientes tales como potasio, magnesio y calcio en la conservación de la conformación estructural de las enzimas.
Farfán y Gutiérrez (2009) en su investigación obtuvieron que las cepas 24 y 22 mostraron tener un buen potencial quitinolítico evidente por su crecimiento e hidrólisis de quitina en placas, presentando un halo de hidrólisis de 8,133 y 7,508 mm, respetivamente. Estos valores son bajos en comparación con los obtenidos en la presente investigación ya que se encuentran entre 3 y 27 mm.
Srividya et al., (2012) obtuvieron que de 12 cepas de actinomicetos solo 5 fueron capaces de hidrolizar la quitina con halos que variaban de 6 a 15 mm, estos resultados fueron igualmente bajos en comparación con los obtenidos en el presente estudio.
Se puede corroborar la habilidad de los microorganismos del suelo como los actinomicetos para hidrolizar quitina, ya que un alto porcentaje de los aislamientos de actinomicetos mostraron presentar actividad quitinolítica para esta prueba en placa, lo cual coincide con lo reportado por Mukherjee y Sen (2006), quienes demostraron la capacidad de Streptomyces olivaceoviridis y S. venezuelae P10, respectivamente, de hidrolizar quitina.
42 También Taechowisan et al., (2003) demostraron en su estudio que la mayoría de los aislamientos evaluados eran quitinolíticos. A su vez, Fermino et al., (2006) reportaron en su evaluación un alto porcentaje de actinomicetos capaces de emplear la quitina como fuente de carbono siendo del 100, 60 y 83%, respectivamente.
El grado de hidrólisis final está determinado por las condiciones utilizadas en el ensayo de actividad enzimática, siendo éstas, la concentración de sustrato, la relación enzima/sustrato, el tiempo de incubación y las condiciones fisicoquímicas tales como el pH y la temperatura (Benitez et al., 2008). Las quitinasas son activas a temperaturas en el rango de los 20-50 °C (Swiontek et al., 2007).
De igual manera Gomes et al., (2000) mostraron una óptima temperatura entre 40 y 50 °C para la mayor actividad enzimática de quitinasas de Streptomyces sp.
Hoster et al., (2005) demostraron en su estudio una óptima actividad quitinolítica empleando un pH de 5 a 7 al evaluar un extracto de quitinasas de la cepa MG3 de Streptomyces sp aislada del suelo de Gottingen. Así mismo, numerosos estudios han mostrado que las quitinasa se caracterizan por presentar una alta actividad quitinolítica en un rango de pH de 4,5 a 8.
Los actinomicetos quitinolíticos derivados del presente estudio son agentes potenciales para el control biológico de enfermedades de plantas causadas por diversos hongos fitopatógenos, pues pueden hidrolizar la quitina presente en la pared celular de los hongos fitopatógenos.
5.2.2 Actividad Celulolítica
La celulosa es uno de los componentes más abundantes de la biomasa vegetal, puede ser degradada por diversos microorganismos debido a la acción de diferentes enzimas; sin embargo, la actividad de dichas enzimas puede ser inhibida por factores físicos y químicos (Ramírez y Coha, 2003). Dentro de las enzimas que participan en el proceso de degradación de materia orgánica, las celulasas son una de las más importantes puesto que participan en el ciclo del carbono mediante la degradación de desechos vegetales, acción que está relacionada con la fertilidad y calidad de los suelos (Gutiérrez et al., 2008).
43 La actividad celulolítica se evidenció mediante evaluaciones cualitativas utilizando como revelado de zonas de aclaramiento solución de rojo congo al 1% (p/v) como ha sido reportado por diferentes autores como Lu et al., (2005).
Solans y Vobis (2003) demostraron que dentro de los microorganismos capaces de degradar la celulosa, se encuentran los actinomicetos y en especial los Streptomyces quienes poseen cerca de un 33% de actividad degradadora de celulosa, pero adicionalmente son capaces de degradar otro tipo de material orgánico de origen vegetal como hemicelulosa, almidón, lignina y pectina, entre otros.
Gaitan y Perez (2007) reportaron en su estudio que las cepas 2, 6 y 8 mostraron un halo de hidrólisis de 0,3; 0,2 y 0,35 mm, mientras que los otros no fueron medibles ya que las zonas de aclaramiento difundieron por todo el medio. También Pragya et al., (2012) obtuvieron que de 17 cepas de actinomicetos 16 presentaron actividad celulolítica, estos resultados son similares en comparación a los obtenidos en el presente estudio.
Los actinomicetos que se evaluaron en el presente estudio presentan mejor actividad celulolítica que los aislados por Mikán y Castellanos (2004), ya que los halos de degradación de celulosa obtenidos en el presente estudio variaron entre 2-44 mm; mientras que el máximo tamaño de degradación que presentaron los actinomicetos aislados por dichos autores fue de 14 mm.
Las evaluaciones realizadas por Otero (2011) arrojaron que de 30 aislamientos de actinomicetos; 22 presentaron halos de degradación entre 4 y 28 mm; estos resultados también difieren en comparación con los obtenidos en el presente estudio.
Otros autores como Lu et al., (2005) reportaron que los diámetros de hidrólisis de las cepas aisladas de tallos de flores cultivadas en agar CMC e incubadas a una temperatura de 30+/-2 ºC durante 5 días, alcanzaron valores de 6,4 cm, lo cual es un resultado superior a los obtenidos en el presente estudio.
Los actinomicetos son una fuente importante para la producción de enzimas con elevada actividad celulolítica para ser usadas en el control biológico y con otros fines biotecnológicos.
5.2.3 Actividad Proteolítica
Las proteasas son endopeptidasas que actúan sobre las proteínas hidrolizando enlaces peptídicos; éstas pueden ser metaloproteasas que trabajan a pH óptimo de 7, estearasas,
44 enzimas con alta actividad esterolítica y baja actividad proteolítica, y serinproteasas (proteasas alcalinas), que tienen residuo serina en/o cerca al sitio activo (Sáez et al., 2004).
Los autores (de la Rosa-Hernández et al., 2011) reportaron que de las 20 cepas estudiadas, BC14 y BP16 presentaron los índices más altos de potencia para la actividad proteolítica.
Los investigadores Medina-Cuevas y Martínez (2011) obtuvieron que de 20 cepas evaluadas, el 95 % de las cepas expresaron proteasas, el 60 % asparaginasas, un 30 % naringinasas, y un 15 % de las cepas produjeron lipasas. En el caso de la actividad proteolítica se observaron halos claros del colorante utilizado alrededor de las cepas evaluadas como evidencia de que presentó actividad, estos resultados concuerdan con los obtenidos en el presente trabajo.
Los autores Srividya et al., (2012) obtuvieron que de 12 cepas de actinomicetos solo 9 presentaron actividad proteolítica. También Haritha et al., (2011) obtuvieron que de 5 aislados de actinomicetos marinos solo 4 fueron capaces de producir enzimas proteolíticas, estos resultados son similares a los obtenidos en la presente investigación. Jeffrey (2008) obtuvo en su estudio que de 6 cepas evaluadas solo 4 mostraron tener actividad proteolítica, los valores variaron desde 25 a 33 mm, los cuales son altos en comparación con los obtenidos en el presente estudio ya que estos variaron entre 15 y 26 mm.
5.3 Capacidad solubilizadora de fosfato
La capacidad que poseen algunas bacterias habitantes de la rizósfera para solubilizar fosfato, les permite ser consideradas como bacterias promotoras del crecimiento vegetal, especialmente aquellas que se encuentran en suelos con grandes cantidades de fosfato precipitado, es decir, no disponible para las plantas (Rico, 2009).
Los resultados obtenidos en la evaluación de la solubilización del fosfato son altos con respecto a los reportados por Rico (2009), quien obtuvo que de las 45 cepas de actinomicetos evaluadas, solo el 11% (9 cepas) formaron halos de aclaramiento, los cuales variaron entre 0,13 a 0,35 cm2, siendo la cepa A1-45/08 la que presentó el valor más alto, siendo este de 0,35 cm2.
45 Pragya et al., (2012) obtuvieron en sus estudios que las 17 cepas evaluadas eran capaces de solubilizar el fosfato por lo cual podían ser utilizadas para promover el crecimiento de las plantas.
Franco-Correa (2008) reportó que las cepas de actinomicetos evaluadas en su investigación presentaron mayor actividad solubilizadora de fosfato en medio SRSM-1, en comparación con las del medio Pikovskaya.
Los resultados obtenidos en el presente trabajo se corresponden con los descritos por Kumar et al., (2001), quienes reportaron bacterias del suelo solubilizadoras de fosfato pertenecientes a los géneros Pseudomonas, Bacillus, Rhizobium, Agrobacterium, Burkholderia, Achromobacter, Microccocus, Aerobacter, Flavobacterium y Erwinia. Estos microorganismos crecen en medios con fosfato tricálcico, apatita o materiales insolubles similares como única fuente de fosfato y no solo asimilan el elemento sino que solubilizan una gran proporción del mismo, liberándolo en cantidades superiores a sus demandas nutricionales (Fernández et al., 2005).
Los resultados obtenidos en agar Pikovskaya están muy por encima de los reportados por Gupta et al., (2007), para microorganismos aislados de minas de cromita, hierro y manganeso, quienes reportan halos entre 14 y 41 mm a la misma temperatura trabajada en este estudio y a un pH de 7.
Los resultados obtenidos en el presente trabajo son altos si se comparan con los datos presentados por Caballero y Camelo (2006), donde los halos de solubilización oscilaron entre 9 y 15,5 mm en agar SRS, para bacterias aisladas de suelos algodoneros del Cesar. La capacidad que poseen los actinomicetos para solubilizar fosfato, les permite ser consideradas como bacterias promotoras del crecimiento vegetal, especialmente aquellas que se encuentran en suelos con grandes cantidades de fosfato precipitado, es decir, no disponible para las plantas.
5.4 Efecto de la Producción de Ácido Indolacético
El AIA regula una gran variedad de procesos fisiológicos entre los cuales se encuentra la extensión celular, la división celular, la diferenciación vascular, la formación de raíces laterales, la dominancia apical y el fototropismo Matsukawa et al., (2007). Sin embargo, se
46 ha considerado que el AIA producido por la planta también puede influenciar el crecimiento de los actinomicetos asociados a su rizosfera.
La habilidad de producir hormonas de crecimientos por parte de microorganismos está ampliamente citada por varios autores. Así, hongos micorrícicos, Pseudomonas sp., Azospirilum brasilense, Azotobacter paspali y Xanthomonas sp. producen esta hormona (Paten y Glick, 2002).
Franco-Correa (2008) obtuvo en su investigación que las cepas MCR3, MCR10, MCR 21, MCR27 y MCR32 produjeron como valores máximos de AIA: 11,1; 11,9; 6,86; 10,72 y 3,05 μg/mL, los cuales son valores bajos comparados con los estudios de Matsukawa et al., (2007) quienes encuentran que Streptomyces purpurascens NBRC 13077, S. coelicolor A3, S. olivaceus NBRC 12805 y S. kasugaensis NBRC 13851 producen AIA en concentraciones de 28,4; 21,8; 14,2 y 51,5 μg/mL. Los valores antes mencionados son altos en comparación con los obtenidos en el presente estudio ya que estos se encuentran entre 2,50 y 9,82 μg/mL.
En los estudios de Matsukawa et al., (2007) se evaluó el efecto exógeno del AIA en la morfogénesis y la producción de metabolitos secundarios en S. purpurascens NBRC 13077, donde se demuestra que el AIA en concentraciones entre 1 y 50 µg.mL-1 estimula la formación de micelio aéreo y la producción de metabolitos secundarios en esta bacteria con respecto a cepas de S. aureus, Escherichia coli, Candida albicans y Aspergillus niger. De ahí, que los actinomicetos durante la estimulación para la producción de AIA,