Case Study

La evaluación de la CA in vivo es necesaria debido a que el efecto real de un compuesto o extracto en un organismos puede estar afectado por problemas de permeabilidad, efectos secundarios de los productos generados a partir de las reacciones de estos con oxidantes, y también por el metabolismo que sufren dentro del mismo (Bednarska

et al., 2008).

En esta tesis la CA in vivo se evaluó a través del estudio de la capacidad que tienen los extractos de trigo, tanto la FL como la FU, para atenuar el estrés oxidativo provocado por un oxidante fuerte (H2O2) en cepas de S. cerevisiae mediante ensayos de sobrevida.

En primer lugar se evaluó la sobrevida de las levaduras frente a distintas concentraciones de extractos de trigo (FL y FU) de las dos variedades seleccionadas por poseer mayor y menor CA en los ensayos in vitro (ACA 315 y BIOINTA 3004, respectivamente). Este ensayo previo se realizó con el fin de encontrar la mínima concentración capaz de revertir el efecto producido por el H2O2 en las levaduras, sin

producir toxicidad celular por sí mismo. La concentración de H2O2 utilizada (2,5 mM) fue

determinada en ensayos previos. Esta concentración permitió un porcentaje (%) de sobrevida promedio de las levaduras del 44 % (Figura 3.5 y Figura 3.6). Un porcentaje de sobrevida mayor resulta de difícil comparación con respecto a un control sin H2O2, por otro

lado, un porcentaje menor de sobrevida podría ser difícilmente recuperado por los extractos de trigo. Por otro lado las FLs y las FUs estudiadas en esta parte del ensayo se construyeron a partir de la mezcla de distintas FLs y FUs, correspondientes a las muestras extraídas por cada variedad de trigo; es decir, para la FL de BIOINTA 3004 se utilizaron 14 FLs provenientes de las 14 muestras extraídas de esta variedad, mientras que para la FL de ACA 315 se utilizaron 17 FLs, también una por cada muestra extraída. Lo mismo se hizo para las FUs.

En la Figura 3.5 se muestras las distintas concentraciones ensayadas de las FLs procedentes de BIOINTA 3004 y ACA 315, frente a un control negativo de las levaduras sin exposición a H2O2 ni extracto (CN), y a un control positivo con H2O2 (CPo) sin extracto. El %

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de sobrevida se calculó en relación a las levaduras control, y los resultados se expresaron como el porcentaje de unidades formadoras de colonias (UFC) por placa.

Figura 3.5. Porcentaje de sobrevida de las levaduras expuestas a distintas concentraciones de la FL de extractos de trigo de dos variedades (ACA 315 y BIOINTA 3004). CN es el control negativo (sin H2O2

y sin extracto); CPo es el control positivo (con H2O2 pero sin extracto agregado). Letras diferentes indican diferencias significativas (p < 0,05).

En cada FL se estudiaron 4 concentraciones diferentes de polifenoles. Para la FL de la variedad BIOINTA 3004 se encontró que la concentración de 38,4 pg EAG/mL presentaba la mayor tasa de sobrevida con respecto al CPo, mientras que para la variedad ACA 315 se encontró que las concentraciones 12,5 y 62,2 pg EAG/mL lograban recuperar a las levaduras luego del estrés oxidativo provocado por el H2O2. El resto de las concentraciones

ensayadas no mostraron diferencias significativas en el % de sobrevida con respecto al CPo. Si bien estas concentraciones no resultaron citotóxicas para las levaduras, no lograron recuperarlas del estrés producido por el H2O2. Considerando todos estos resultados, y

teniendo en cuenta las dos variedades estudiadas, se decidió continuar trabajando con una concentración final de polifenoles en la FL de 40 pg EAG/mL.

Este mismo ensayo se realizó para la FU de polifenoles en las dos variedades bajo estudio. En la Figura 3.6 se muestras los resultados obtenidos de las distintas concentraciones estudiadas para la variedad BIOINTA 3004 y la variedad ACA 315.

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Figura 3.6. Porcentaje de sobrevida de las levaduras expuestas a distintas concentraciones de la FU de extractos de trigo de dos variedades (ACA 315 y BIOINTA 3004). CN es el control negativo; CPo es el

control positivo. Letras diferentes indican diferencias significativas (p < 0,05).

Al igual que para la FL, en la FU se estudiaron 4 concentraciones diferentes de polifenoles por cada variedad. Las concentraciones de 1.017 pg EAG/mL para la variedad BIOINTA 3004 y la concentración 1.272 pg EAG/mL para la variedad ACA 315, mostraron diferencias significativas (p < 0,05) con respecto al CN, el resto de las concentraciones ensayadas no lograron diferenciarse estadísticamente del mismo. A partir de estos resultados se decidió seguir trabajando con una concentración final de polifenoles en la FU de 1.000 pg EAG/mL.

Luego de encontrar la mínima concentración de cada fracción capaz de revertir el efecto producido por el H2O2 en las levaduras, se procedió a realizar los ensayos de

sobrevida con todas las muestras de cada variedad. Para tal fin se evaluaron 4 tratamientos por cada fracción:

I- un control de las levaduras sin ningún tipo de exposición (CN);

II- un control de levaduras expuesto a la FL (40 pg EAG/mL), o a la FU (1000 pg EAG/mL);

III- un control de levaduras expuestas sólo a H2O2 (CPo);

IV- exposición de las levaduras a las distintas FL, o FU, de cada variedad más el agregado del H2O2.

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En la Figura 3.7 se muestran los resultados obtenidos para las FLs de las variedades estudiadas.

Figura 3.7. Porcentaje de sobrevida de las levaduras (media ± EE) expuestas a 40 pg/mL de FL de ACA 315 y BIOINTA 3004, con y sin H2O2. Letras diferentes indican diferencias significativas (p <

0,05).

Todas las muestras de la FL de cada una de las variedades de trigo evaluadas, fueron capaces de proteger a las levaduras del daño producido por el H2O2. La FL de la

variedad BIOINTA 3004 aumentó un 11,3 % la tasa de sobrevida con respecto al control de levaduras con H2O2 (CPo), mientras que la variedad ACA 315 mostró un aumento del 3,2 %.

Con estos resultados se puede decir que la FL de extractos de trigo de la variedad BIOINTA 3004 posee mayor capacidad de atenuar el estrés oxidativo provocado por el H2O2 en cepas

de S. cerevisiae. De la Figura 3.7 también se desprende que los controles del tratamiento II no se diferenciaron significativamente del CN, por lo que no hay un efecto citotóxico de los extractos sobre las levaduras.

De la misma forma se evaluaron las FUs de los extractos de trigo de las dos variedades estudiadas. En la Figura 3.8 se muestran los resultados obtenidos.

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Figura 3.8. Porcentaje de sobrevida de las levaduras (media ± EE) expuestas a 1000 pg/mL de FU de ACA 315 y BIOINTA 3004, con y sin H2O2. Letras diferentes indican diferencias significativas (p <

0,05).

Las muestras analizadas de la FU de cada una de las variedades de trigo estudiadas, fueron capaces de proteger a las levaduras del daño producido por el H2O2. La FU de la

variedad BIOINTA 3004 aumentó un 8,8 % la tasa de sobrevida con respecto al CPo, mientras que la variedad ACA 315 mostró un aumento del 6,1 %, sin embargo, a diferencia de la CA encontrada en la FL, las tasas de sobrevida entre ambas variedades no pudieron ser diferenciadas estadísticamente. Por otro lado los controles del tratamiento II no se diferenciaron significativamente del CN, por lo que no se evidencia un efecto citotóxico sobre las levaduras.

Tanto la FL como la FU de los extractos de trigo de cada una de las dos variedades estudiadas lograron aumentar el % de sobrevida de S. cerevisiae frente a un estrés oxidativo, sin embargo, al contrario de lo encontrado en la evaluación de la CA in vitro, donde la variedad ACA 315 mostró los valores significativamente más altos de CA, fue la variedad BIOINTA 3004 la que presentó mayor CA in vivo. Adicionalmente a estos resultados, el estudio de la influencia de la zona y el año de cultivo, no parecen tener una influencia significativa sobre la CA evaluada in vivo. Tampoco se encontró una interacción significativa entre el genotipo y la zona, y entre el genotipo y el año de producción (Tabla 3.2).

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Tabla 3.2. Estadístico F para un análisis combinado de la varianza para los valores obtenidos de CA in vivo en la FL y en la FU de 2 variedades diferentes de trigo cultivadas en 4 zonas distintas, en 2 años

de producción.

Variedad y Zona Variedad y Año

CA in vivo V Z V x Z V A V x A

FL 7,85 * 0,4 4,4 * 4,98 * 2,71 1,56

FU 0,86 0,75 0,38 2,17 8,76 ** 3,61

Resultados con * fueron significativos a p < 0,05; ** significativos a p < 0,01. Resultados sin * no fueron significativos.

Hasta el momento no se encontraron trabajos donde utilicen S. cerevisiae para evaluar la CA de extractos de trigo. Sin embargo algunos trabajos han demostrado que este modelo puede servir para estudiar la CA en distintos alimentos. Mortorell et al. (2011), estudiaron la CA in vivo de cacao en polvo enriquecido con flavonoides. Ellos encontraron que éste era capaz de aumentar un 15,4 % la tasa de sobrevida de las levaduras con respecto a un CPo, siendo similar al porcentaje observado en células tratadas con vitamina C (19,3 %). Más tarde, Baroni et al. (2012), evaluaron CA de vinos argentinos encontrando un porcentaje de sobrevida entre 28 % y 12 % para los varietales cabernet sauvignon y syrah, respectivamente. Cheminet (2013) también encontró tasas de sobrevida entre 8 % y 30 % para extractos y decocciones de yerba mate. Estos resultados demuestran que los extractos de trigo analizados, presentan propiedades antioxidantes similares a las obtenidas en otros alimentos y bebidas de capacidad antioxidante reconocida.

Las diferencias encontradas entre la CA evaluada in vitro y la CA estudiada in vivo, pueden ser explicadas por el hecho de que los métodos in vitro ignoran la acción biológica que pueden tener los compuestos antioxidantes in vivo, como la actividad de las enzimas antioxidantes y/o la vía metabólica relacionada a la oxidación, activación/represión de genes que codifican las enzimas antioxidantes, o la activación de vías de señalamiento (Liu & Finley, 2005). Por lo que los efectos observados in vitro no necesariamente se correlacionan con los observados in vivo. Otro hecho importante que hay que tener en cuenta es que cuando se está en presencia de una mezcla de diferentes compuestos antioxidantes, como en el caso de los extractos de trigo, estos pueden mostrar reacciones aditivas, sinérgicas o antagónicas entre ellos, que resultan en diferentes acciones antioxidantes sobre distintos sistemas, por lo que no es extraño que los resultados obtenidos difieran entre los distintos métodos empleados.

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3.3.2. Correlación entre CA in vitro e in vivo con el contenido de compuestos