Como comentábamos en el apartado anterior, la sustitución de la secuencia de 2.4 kb que contenía los DSBs de mbs1 por el gen marcador ura4+ supuso la desaparición
de los DSBs en ese sitio del genoma. Esto podría ser debido a la existencia de una secuencia en la región delecionada necesaria para la unión de la proteína Rec12. Otra posibilidad podría ser que la transcripción del gen marcador ura4+ impidiera la unión
de Rec12 a esa región aunque no necesitara una secuencia específica para hacerlo. Esta segunda posibilidad concordaría con las conclusiones del trabajo de Cromie et al (2007) en el que se localizaron los sitios del genoma a los que se une Rec12 me- diante inmunoprecipitación de cromatina en una cepa Rec12-FLAG rad50S. Los lu- gares en los que detectaron señales de unión de Rec12 al DNA carecían de una se- cuencia consenso y la única característica común a todos ellos era que se trataba de regiones intergénicas grandes.
A partir de estos datos nos planteamos como siguiente objetivo de este trabajo la sustitución de la región de 2.4 kb que contenía los DSBs en mbs1 por una región in- tergénica no codificante y que no se transcribía, procedente de otra parte del genoma, donde además no se generaban DSBs en meiosis. Esta integración nos permitiría dis- tinguir si era la secuencia o el tamaño de la región intergénica libre de transcripción lo que permitía la unión de la proteína Rec12 al DNA y la formación de los DSBs.
Para realizar el ensayo por duplicado, elegimos dos regiones diferentes del geno- ma que habíamos comprobado en trabajos anteriores en nuestro laboratorio que no contenían orígenes de replicación en el genoma en cultivos asincrónicos en mitosis
(FIGURA 19B) ni tampoco actuaban como ARS en plásmido. Se denominaron C5 y R3. C5 era una región intergénica de 1908 pb y 69.4% A+T que se encontraba entre los genes cdc25+ y hxk1+ y R3 era una región intergénica de 1500 pb y 68.8% A+T que se encontraba entre los genes rad17+ y atp1+. Ambas se localizaban en el cromo-
soma I. Como control previo analizamos la presencia de DSBs durante la recombina- ción meiótica en ambos sitios del genoma (FIGURA 19C) y observamos que en nin- guno de ellos se generaban DSBs.
Fig.19 A. Mapas de las regiones C5 y R3 en su locus silvestre. Los genes se indican con rectángulos blancos y las flechas muestran el inicio de las correspondientes ORFs. Las líneas verticales indican los fragmentos de restricción analizados por Southern blot para el análisis de DSBs y las sondas utilizadas se muestran con rectángulos verdes. B. Análisis por electro-
foresis bidimensional de las regiones C5 y R3 en mitosis en su locus genómico realizados por Gomez & Antequera (1999) y Segurado et al (2002). El resultado de la hibridación
mostró solamente señales correspondientes a horquillas de replicación. C. Análisis por Sout-
hern blot de las regiones C5 y R3 en su locus genómico. Se comprobó que no había DSBs
durante la recombinación meiótica en estas regiones.
A.
Se partió de las cepas haploides en las que se había sustituído la región de 2.4 kb de mbs1 por el gen marcador ura4+ en una cepa inicial ura- (FIGURA 15C). Los
fragmentos que contenían C5 y R3 se flanquearon con los casetes de recombinación homóloga dirigidos a esa región del genoma y se transformaron las cepas receptoras (ura+). Se seleccionaron las colonias transformantes, que debían ser auxótrofas para
uracilo, en medio mínimo suplementado con uracilo y 1g/L de ácido 5-fluoroorótico (5-FOA) ya que este compuesto es tóxico para las células que mantienen íntegra la ruta de síntesis del uracilo (ver apartado 2.2 de Materiales y métodos). A continua- ción se llevó a cabo una segunda transformación en la que se integró el gen ura4+ en
su locus endógeno en cada una de las cepas. Este paso fue necesario ya que en las cepas auxótrofas para uracilo no era posible la parada de las células en G1 necesaria para la posterior meiosis sincrónica. Los diploides se obtuvieron por fusión de proto- plastos. Los genotipos de las cepas construidas fueron: h-/h- mbs1::C5/mbs1::C5pat1
-114/pat1-114 leu1-32/leu1-32 ade6M210/ade6M216 y h-/h- mbs1::R3/mbs1::R3
pat1-114/pat1-114 leu1-32/leu1-32 ade6M210/ade6M216.
Analizamos en ambas cepas la presencia de DSBs en el fragmento que contenía la región intergénica correspondiente a mbs1 y pudimos comprobar que se formaban DSBs en ambos casos (FIGURA 20B). Este resultado nos permitía concluir que la secuencia de mbs1 no era necesaria para la formación de DSBs en esa región.
En la FIGURA 21 se muestran los mapas de todas las integraciones llevadas a cabo en la región mbs1 en este trabajo.
Fig.20 A. Mapas de la región mbs1 tras la integración de los fragmentos C5 y R3. Los genes se indican con rectángulos blancos y las flechas muestran el inicio de la transcripción. Las líneas verticales indican los fragmentos de restricción analizados por Southern blot para el análisis de DSBs y las sondas utilizadas se muestran con rectángulos verdes. B. Southern
blot de las regiones C5 y R3 en la región mbs1. El análisis reveló la presencia de DSBs du-
rante la recombinación meiótica en estas regiones.