Chapter 24: Justice, freedom and security

Este método de análisis se puso a punto con la intención de valorar in vivo la capacidad antioxidante de los diferentes extractos de alcachofa a utilizar en esta Tesis (extracto A y extracto B). La utilización de la impedancia eléctrica para la medida de la capacidad antioxidante, presenta la ventaja de medir directamente la capacidad del agente y no del alimento sobre el que actúa éste, a diferencia de lo que ocurre en el resto de métodos in vitro descritos en la bibliografía, donde se determina un producto de reacción que resulta de la interacción antioxidante-alimento (Kuskoski y col., 2005).

Sin embargo al tratarse de un método que se basa en la medida del efecto antioxidante sobre un microorganismo vivo, tiene la desventaja que aquellos compuestos que presentan actividad antimicrobiana, además de la propia actividad antioxidante a evaluar, no son susceptibles de ser evaluados por este método.

En primer lugar se procede a la determinación de la posible capacidad antimicrobiana de los extractos de alcachofa, como se describe en la sección capítulo 3.1.4 de materiales y métodos, sobre cepas de Sacharomices cerevisiae, utilizando la medida indirecta de impedancia. En todos los casos (extracto A y B), se hicieron ensayos de control de cepa y medio. El control de cepa sin la adición de ningún antimicrobiano, nos indica el tiempo al que se inicia el crecimiento del microorganismo, así como la viabilidad del mismo. En cuanto al control de medio, en todos los casos el resultado debe ser negativo, es decir, no debe detectarse crecimiento alguno, ya que si lo hubiera, indicaría contaminación del medio. Tras someter a las células de levadura a estrés con peróxido de hidrógeno, se adicionó el agente antioxidante extracto A y extracto B al 2%. Se utiliza el doble de concentración que se utilizará en los siguientes ensayos, para asegurar que no tiene capacidad antimicrobiana y que no interfiere en la determinación de la capacidad antioxidante, mayor protección frente al estrés cuanto mayor sea la concentración del antioxidante.

Los resultados obtenidos (Tabla 13), muestran que ambos extractos presentan el mismo tiempo de crecimiento que la levadura sin adición de extracto, lo que implica que este compuesto no inhibe su crecimiento y por lo tanto no tiene poder antimicrobiano para levaduras.

Tabla 13. Tiempo necesario para el crecimiento en horas de Sacharomices cerevisiae Extracto A 2% (𝑿±𝑺𝑫) Extracto B 2% (𝑿±𝑺𝑫) Sig Cepa (horas) 7,54 6,65 NS Potasa (horas) 1,49 + 0,02 1,26 + 0,02 NS

Cepa + Extracto (horas) Significación 6,46 + 0,01 NS 5,81 + 0,02 NS NS NS: No significativo

De manera gráfica en la Figura 13, se observa que la curva de crecimiento de la levadura se superpone prácticamente con la curva de crecimiento de la levadura a las que se le añadió en la misma cantidad los dos extractos A y B, de alcachofa. La aplicación del test ANOVA con un nivel de significación superior al 5%, indica que no existen diferencias significativas entre el tiempo de crecimiento de Sacharomices cerevisiae en el que se añadió extracto de alcachofa A y B. Así mismo, no se encontraron diferencias significativas, entre el crecimiento de la levadura con y sin adición de extractos.

Figura 13. Gráficas del tiempo de crecimiento de Sacharomices cerevisiae a los que se añadió el 2% de extracto de alcachofa A (gráfica 1) y B. (gráfica 2)

Una vez determinado que los extractos no poseen capacidad antimicrobiana, se hace viable utilizar la técnica “in vivo” por impedancia eléctrica para determinar la capacidad antioxidante de los extractos de alcachofa obtenidos, para lo que se utiliza el equipo BacTrac 4000 Series, de acuerdo al método descrito en el capítulo 3 de materiales y métodos de esta tesis. Tras someter a las células de levadura a estrés con

GRÁFICA 1 GRÁFICA 2

• GRÁFICA 1. Tiempo necesario para el crecimiento de Sacharomices cerevisiae en extracto de alcachofa A 2%.

• GRÁFICA 2. Tiempo necesario para el crecimiento de Sacharomices cerevisiae en agente antioxidante extracto de alcachofa B 2 %.

con el propósito de verificar que el método funciona correctamente (mayor protección frente al estrés cuanto mayor sea la concentración del antioxidante).

Se preparan cinco viales (por triplicado), partiendo de un cultivo de levaduras (Sacharomices Cerevisiae) a una concentración de 106 ufc/mL:

 Vial 1: Control de potasa 1mM  Vial 2: Control cepa Sacharomices

 Vial 3: Cepa oxidada (800 μL de cepa + 100 μL H2O2).

 Vial 4: Control Extracto Alcachofa A directo (800 μL de cepa +100 μL H2O2 +

100 μL) a diferentes concentraciones (2%, 5% y 10%).

 Vial 5: Control Extracto Alcachofa B directo (800 μL de cepa +100 μL H2O2 +

100 μL) a diferentes concentraciones (2%, 5% y 10%).

Tabla 14. Tiempo necesario para el crecimiento en horas de Sacharomices cerevisiae Extracto A (𝐗±𝐒𝐃) 0,2% 0,5% 1,0% Sig. Cepa (horas) 7,46 7,46 7,46 NS Cepa+Peróxido (horas) 10,18+0,02 10,18+0,03 10,18+0,03 NS Cepa+extracto (horas) 9,59+0,01 8,95+0,02 8,80+0,01 * Extracto B (𝐗±𝐒𝐃) 0,2% 0,5% 1,0% Sig. Cepa (horas) 7,46 7,46 7,46 NS Cepa+Peróxido (horas) 10,18+0,01 10,18+0,02 10,18+0,02 NS Cepa+extracto (horas) 9,76+0,02 9,16+0,02 9,08+0,02 * Significación entre A y B NS NS NS NS: No significativo;*Diferencias significativas P<0,05

En la Tabla 14 y la Figura 14, se muestran los resultados y gráficas, obtenidos para la capacidad antioxidante del extracto de alcachofa referidos como el poder para permitir

el crecimiento de la levadura Sacharomices cerevisiae, sometida a un estrés oxidativo (H2O2). Los resultados muestran que hay diferencias significativas entre las diferentes

concentraciones de extracto utilizadas, sin embargo no encuentra diferencias significativas entre el extracto A y B para la misma concentración. Como se observa en la Tabla 14, al añadir el extracto se minimiza el estrés oxidativo y disminuye el tiempo de crecimiento, aproximándose al tiempo normal de crecimiento del microorganismo. Esta capacidad antioxidante es mayor cuanto mayor es la concentración de extracto añadida, es decir menos tiempo tarda la levadura en crecer, siendo mayor este poder antioxidante en el extracto A, que es el que tiene mayor concentración de compuestos fenólicos.

Figura 14. Gráficas del tiempo de crecimiento de Sacharomices cerevisiae a los que se añadió el 0,2%, 0,5% y 1% de extracto de alcachofa A y B

GRÁFICA 3 _{GRÁFICA 4}

GRÁFICA 5

• GRÁFICA 3. Tiempo necesario para el crecimiento de Sacharomices cerevisiae en agente antioxidante extracto de alcachofa 0,2%.

• GRÁFICA 4. Tiempo necesario para el crecimiento de Sacharomices cerevisiae en agente antioxidante extracto de alcachofa 0,5 %.

• GRÁFICA 5. Tiempo necesario para el crecimiento de Sacharomices cerevisiae en agente antioxidante extracto de alcachofa 1 %.

Se puede concluir que los extractos de alcachofa tienen capacidad antioxidante, corroborando los resultados obtenidos mediante técnicas in vitro FRAP y ABTS, datos que coinciden con distintos estudios publicados por Larrosa y col., (2012). Dueñas y col., (2009) y Mabeau y col., (2006), sobre la capacidad antioxidante del subproducto que se obtiene en la industria transformadora de conservas de alcachofa.

4.2. CARACTERIZACIÓN DEL EXTRACTO DE AJO

En la Región de Murcia se pueden encontrar fábricas que elaboran especias y utilizan el ajo como materia prima para obtener productos como el ajo en polvo, obteniendo un gran volumen de desechos que supone más de 50 toneladas anuales de subproducto.

El subproducto del ajo tiene la particularidad de que tiene una alta densidad, por lo que su inconveniente mayoritario es el almacenamiento y transporte, de hecho, el porcentaje en peso del subproducto con respecto a la materia es del orden del 1-3%.

Para la obtención del extracto de ajo se sigue la metodología de extracción acuosa descrita por Navarro (2007) para bulbos de ajo. Durante la realización de los procesos de obtención del extracto a partir de subproductos se ha llevado un control de los pesos más significativos que nos han permitido determinar el rendimiento del proceso, cuyos valore medios se representan en la Tabla 15.¨

Tabla 15. Rendimiento procesos de extracción

MUESTRA RENDIMIENTO (%)

(𝐗±𝐒𝐃)