ganglionectomizados
FIG. 38: Disminución de la marca de Tuj1 en la GP de animales GCSx
A-B) IHQ para Tuj1 (rojo). Se puede apreciar la disminución y la discontinuidad de las fibras nerviosas en la GP de animales GCSx. Microscopía confocal. A y B) 60X.
121 Hemos observado que en las glándulas de animales GCSx la población intersticial VIM positiva aumenta en número y forman grandes grupos celulares que no son frecuentes en las controles (FIG. 39). Este aumento en el número de células podría originarse por migración desde regiones vecinas o por división y diferenciación intraglandular. El aumento de esta población celular podría generar un desbalance en la proporción normal de tipos celulares lo cual podría influir en toda la fisiología de la glándula. Tanto la población de precursores Pax6+/RGABAB1+/VIM+ como las células GABAérgicas VIM+ podrían estar afectadas en las GP de animales GCSx, sería necesario un análisis más exhaustivo para corroborar este aspecto.
FIG. 39: Cambios en el patrón de células VIM+ en glándulas GCSx.
A-B) IHQ para VIM (rojo). Núcleos marcados con DAPI (azul). Se puede apreciar el aumento y las agrupaciones de las células VIM+ en la GP de animales GCSx. Microscopía confocal. A-B’’) 60X.
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La marcación de actina en la glándula pineal de animales
ganglionectomizados pone en evidencia la formación de
grandes aglomerados de celulares con morfología atípica
Observamos que la marcación del citoesqueleto de actina también nos permite ver diferencias entre las glándulas GCSx y las controles (FIG. 40). En las pineales GCSx aparecen ramilletes de células que presentan un citoesqueleto de actina muy marcado. Como mostramos anteriormente en la FIG. 36, estas células serían del tipo microglial, lo cual es indicativo que las GP de estos animales estarían bajo un proceso inflamatorio y/o transformación que iría más allá de la pérdida de ritmicidad.
FIG. 40: Aumento de células microgliales activas ricas en actina en glándulas pineales GCSx.
A-B’’) IHQ para actina (verde). Núcleos marcados con DAPI (azul). Se puede apreciar el aumento de células tipo microglía con fuerte expresión de actina en la GP de animales GCSx. Las regiones señaladas por las cabezas de flechas se ven amplificadas (2X) en los recuadros inferiores. Microscopía confocal. A-B’’) 60X.
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NeuroD1 como determinante de fenotipo
En nuestro laboratorio se caracterizó la distribución y dinámica del factor de transcripción NeuroD1 en la GP de rata en el desarrollo embrionario, neonatal y adulto. Este trabajo recientemente publicado formó parte de la Tesis doctoral de la Dra. Analía Castro, junto a la cual estandarizamos la detección del NeuroD1 [192]. Este bHLH se expresa en el primordio pineal desde los primeros estadíos embrionarios y se mantiene hasta el estado adulto, en donde se localiza principalmente en pinealocitos, aunque también fue observado en una subpoblación de células intersticiales. En el desarrollo embrionario y los primeros estadíos neonatales, la localización subcelular de este factor de transcripción es nuclear. A partir de P10 y en la GP adulta se encontró que la localización del NeuroD1 varía según el ZT analizado; durante la fase de luz (ZT6) NeuroD1 es principalmente citoplasmático mientras que en la noche temprana (ZT14) se localiza a nivel nuclear. Además, la localización nuclear nocturna del NeuroD1 en pinealocitos fue afectada por la disrupción de la inervación simpática de la glándula pineal vía la GCSx y por la administración invivo de antagonistas específicos de los receptores adrenérgicos α1 y β. El hecho de que NeuroD1 se exprese tan temprano en el desarrollo y que en el adulto su localización sea susceptible a regulación circadiana, avalaría su rol modulatorio en el establecimiento y mantenimiento del fenotipo pineal. En nuestro laboratorio trabajamos con la hipótesis de que en los estadíos embrionarios tendría un rol como determinante fenotípico y en la adultez podría estar involucrado en funciones específicas como el ritmo circadiano de síntesis y secreción de melatonina.
En el presente trabajo de Tesis buscamos relacionar la localización subcelular de la proteína NeuroD1 con las células GABAérgicas detectadas en la GP. Nuestro interés surgió a partir del análisis del transcriptoma de GP de ratones KO totales para NeuroD1, donde se observa que el gen que más aumenta su expresión es Gad1 [191]. Como mencionamos en la Introducción, en la región regulatoria del gen Gad1 se han identificado secuencias E-box que serían compatibles con las secuencias nucleotídicas de reconocimiento del NeuroD1.
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Los núcleos de las células GABAérgicas en la glándula adulta
presentarían niveles bajos o nulos de NeuroD1
Mediante IHQ doble para NeuroD1 y GAD67 se observó que las células intersticiales GAD67 positivas mostraban una señal reducida o nula del factor de transcripción en sus núcleos (FIG. 41). En algunos casos se detecta NeuroD1 bien marcado en el citoplasma de estas células, indicando que se expresaría pero no cumpliría su rol de regulador transcripcional en dichas células. Dicha heterogeneidad podría estar indicando dos mecanismos de regulación de la actividad de NeuroD1, uno a nivel de la expresión de mensajero y proteína, y otra, a nivel de la translocación al compartimiento nuclear. Las imágenes de la FIG. 41 se obtuvieron de GP adultas colectadas a ZT14, cuando la localización del NeuroD1 en pinealocitos es principalmente nuclear.
127 Estos resultados estarían de acuerdo con el rol inhibitorio que hipotetizamos para NeuroD1 sobre la expresión del gen Gad1. Nosotros planteamos que en pinealocitos el NeuroD1 nuclear silenciaria directa o indirectamente a Gad1. Por lo tanto, al no estar NeuroD1 en los núcleos de una subpoblación de células intersticiales, la región regulatoria del gen Gad1 estaría libre de la inhibición por el bHLH con la consecuente expresión de GAD67 y la producción de GABA por parte de estas células. De esta manera, NeuroD1 podría estar relacionado a la diferenciación y mantenimiento de fenotipos celulares dentro la glándula pineal, específicamente entre el fenotipo glutamatérgico y GABAérgico de pinealocitos y células intersticiales, respectivamente. Similares interpretaciones fueron hechas por Roybon y cols. [196] durante la especificación diferencial de subtipos neuronales en el desarrollo del cerebro anterior.