Se han de garantizar condiciones físicas y bioquímicas similares a las que encuentra el corazón en su entorno de trabajo natural, el cuerpo. Esto es, proporcionar un entorno con la misma temperatura, acidez, concentración salina, cantidad de oxígeno y con un flujo constante de perfusato que simule a la sangre. Se construyó un entorno para el experimento de Langendorff con estas características.
8. Báscula de precisión - uso durante preparación de reactivos.
9. Lupa de laboratorio, apoyo a la canulación.
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Calentador y agitador
El cabezal de baño caliente creaba las condiciones de temperatura propias del organismo (37℃) a la vez que fijaba un flujo de agua caliente para homogeneizar esta temperatura en todo el baño. Con los botones de selección ⇧, ⇩, se elige la temperatura. En la práctica, se comprobó que para el montaje específico se necesitaba una temperatura programada de 38℃, pues el corazón se encontraría sumergido en un buffer Tyrode’s HEPES, rodeado por un recipiente de cristal, y en la transferencia de calor se perdían entre uno y dos grados de temperatura.
10. Cabezal creador del medio térmico.
La temperatura del baño es regulada con el propio cabezal, y la temperatura dentro del medio Tyrode’s se monitoriza con un termómetro, que nos indica la lectura real del entorno en el que se encuentra el corazón.
Medio Tyrode’s HEPES
La solución isotónica llamada Tyrode’s es un medio que proporciona soporte vital a
órganos mediante la perfusión o baño de los órganos en el mismo. Es semejante al líquido
intersticial y también ha sido preparado en el laboratorio y debidamente oxigenado con
carbógeno. La solución Tyrode’s, además de actuar como amortiguador de pH gracias al
bicarbonato, les proporciona energía a los tejidos a causa de que uno de los solutos disueltos
más abundantes de la preparación es la glucosa. (Albiol Tortosa, 2019)
Cabezal calefactor y agitador Recipiente de cristal (vaso de precipitados) Baño de agua (intercambiador de calor) Medio Tyrode’s HEPES de aporte salino Aguja de perfusión y pinza de sujeción
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La preparación de Tyrodes HEPES se incluye en el anexo de preparación de
reactivos. El Tyrode’s preparado se compone de 5.844 g de cloruro de sodio (NaCl), 0.403 g
de cloruro potásico (KCl), 0.203 g de cloruro de magnesio (MgCl
2), 0.265 g de cloruro de
calcio di hidratado, 2.383 g de tampón HEPES y 4.504 g de glucosa (C
6H
12O
6). (Albiol
Tortosa, 2019)
Calentador y agitador
Como se ha comentado, el medio debe estar oxigenado con carbógeno para garantizar la supervivencia tisular. Es importante, no obstante, que no haya burbujas presentes en el medio (esto se comentará en el circuito hidráulico). Para ello, se recurrió a Air Liquide, que proporcionó al equipo con la bombona de carbógeno, así como el manorreductor y entubado propio para la oxigenación. Ya se disponía de un manorreductor en el laboratorio, pero los acoples no eran los adecuados, y se optó por una solución más segura. En el tratamiento con carbógeno, las bombonas soportan una presión equivalente a más de 150 kg. El manorreductor debía adecuar esto a un rango de salida equivalente de 0 a 5 kg.
11. Superior izquierda: entubado de oxigenación. Inferior izquierda: manorreductor antiguo (izq.) y nuevo (dch.). Derecha: bombona de carbógeno.
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La oxigenación de la solución se realizaba mediante la exposición a carbógeno (apertura de manorreductor equivalente a menos de 1 kg) expulsado por un difusor, directamente al recipiente del que se tomaría la solución de Tyrode’s.
Para comprobar si se está disolviendo el oxígeno en la solución, se observaba el pH de la solución. Dado que el dióxido de carbono tiene una constante de Henry mayor a la del oxígeno (3,2 × 10−2 frente a 1,3 × 10−3 𝑚𝑜𝑙 ∙ 𝑎𝑡𝑚−1∙ 𝐿−1), cabe esperar que el 𝐶𝑂
2 disuelva antes.
(Universidad de Granada, n. d.) En condiciones del laboratorio, el volumen de la solución es el mismo y conocido, y el recipiente está abierto a la atmósfera.
La disolución del dióxido de carbono se traduce en la acidificación de la solución, al formar ácido carbónico con las moléculas de agua presentes en medio, y la disociación de estas moléculas produce un aumento de la concentración de iones de Hidrógeno, lo que disminuye el pH. Se comprueba el tiempo máximo para alcanzar la máxima disolución con la estabilización del pH de la solución. Al no poder disolverse más 𝐶𝑂2, el pH se
mantiene constante. Se extendió este tiempo de oxigenación una vez alcanzado el nuevo equilibrio ácido-base de la solución, para propiciar una mayor presencia de oxígeno. Para devolver el pH a un nivel de acidez compatible con el entorno del corazón, se empleó hidróxido de sodio como elevador. Cabe destacar que este proceso no es conveniente repetirlo demasiadas veces, pues el exceso de iones de sodio genera un desequilibrio salino en la solución con respecto al tisular, pudiendo favorecer la deshidratación de los miocitos.
El medio Tyrode’s estará en constante circulación mediante un agitador magnético y mosca, tanto durante el proceso de oxigenación como durante la perfusión, para ofrecer el perfusato
más homogéneo posible y evitar gradientes salinos, de acidez o de oxigenación al corazón. Su pH se ha de revisar con frecuencia, debiéndose mantener entre 6.5 y 7.5, siendo lo ideal 7.3 según marca la literatura (Bell, Mocanu, & Yellon, 2011). La temperatura no es un factor de excesiva importancia, pues cuando el medio entre en el circuito hidráulico, su temperatura se irá aproximando a la del medio de aislamiento del corazón.