How to choose polynomials

ortólogos CueRSTM y CueREC afectan la inducción residual de los genes del

regulón gol

Paralelamente a la identificación del dominio y los residuos de aminoácidos que dictan la selectividad de operador en los reguladores transcripcionales parálogos CueR y GolS, se comparó la respuesta a metales y el reconocimiento del ADN de CueR de S. Typhimurium (CueRSTM) con el de su ortólogo en E. coli (CueREC). Si bien ambos reguladores poseen un 91% de identidad y desde la hélice-α1 a la hélice-α4 sólo 4 residuos varían en el dominio de unión al ADN (Figs. 17-A y 31), estas diferencias podrían definir afinidades diferentes para los mismos operadores, o influir en los cambios conformacionales requeridos para la activación de los promotores reconocidos por estos reguladores. Alternativamente, diferencias en la concentración intracelular de estos dos reguladores podría provocar variaciones en los niveles de inducción de sus

genes blanco, ya que el efecto regulatorio no sólo depende de la afinidad por el operador, sino también de la concentración intracelular del sensor (Alon, 2007; Balleza y col., 2009). Por lo tanto, estabilidades proteicas diferentes o distintos niveles transcripcionales entre estos dos reguladores podría contribuir a la alteración del perfil de activación de los regulones.

Los promotores de cueRSTM y cueREC no han sido aún caracterizados y sólo se conoce el sitio de inicio de la transcripción para cueR de Salmonella (Kröger y col., 2012). Además, y a pesar del alto grado de homología entre las regiones codificantes para estos dos genes ortólogos, las regiones corriente arriba de los mismos no presentan conservación de secuencia (Fig. 32). Esta diferencia de secuencia entre las regiones promotoras de cueRSTM y de cueREC podría resultar en una disparidad en la transcripción de estos genes manifestándose en diferencias en la concentración efectiva de ambos reguladores.

Para analizar el comportamiento de CueRSTM y CueREC en la inducción de los genes del regulón cue y del regulón parálogo gol, en una cepa de E. coli MC4100 se sustituyó el promotor y/o la región codificante de cueREC por la región equivalente de

cueRSTM de Salmonella, de manera tal de expresar el regulador nativo de E. coli CueREC

o su ortólogo CueRSTM desde sus respectivas secuencias promotoras o desde el promotor del otro regulador, pero siempre en un mismo entorno celular (Fig. 33) (estos constructos se hicieron en colaboración con el Lic. Mauricio Grisolía). Estas cepas fueron transformadas con plásmidos derivados del vector pMC1871 que contienen al gen reportero lacZ bajo el control de los promotores de copA y golB, y crecidas toda la noche a 37 °C con agitación en medio LB sin metal o suplementado con 10 μM AuHCl4 o 1 mM CuSO4. El nivel de activación de los genes reporteros se determinó mediante ensayos de actividad β-galactosidasa.

El comportamiento de CueRSTM frente a PcopA resultó ser similar al de CueREC, tanto en ausencia como presencia de ambos metales, independientemente del promotor bajo el cual se expresara (PcueRSTM o PcueREC). Sin embargo, a pesar del alto grado de identidad entre estos dos reguladores, sólo CueRSTM fue capaz de reconocer el promotor PgolB (secuencia blanco de GolS), aunque con baja afinidad y sólo en presencia de AuHCl4(Fig. 34). Este mismo resultado se obtuvo sobre-expresando ambos reguladores bajo el control del promotor Plac inducible por IPTG, desde un plásmido de número de copias medio (pSU36::cueREC y pSU36::cueRSTM) en una cepa de E. coli W3110 ∆lacZ

∆cueR transformada con los mismos vectores reporteros que expresan lacZ bajo el control transcripcional de los promotores PcopA y PgolB. A bajas concentraciones de inductor se observó esencialmente el mismo comportamiento que cuando los reguladores están codificados en el cromosoma. Nuevamente, CueREC fue incapaz de activar la transcripción del gen reportero lacZ a partir del promotor de golB, aún en altas concentraciones de inductor. Estos resultados descartan diferencias en los niveles transcripcionales del regulador. Las diferencias en la inducción de PgolB mediada por CueREC o por CueRSTM podrían explicarse, en parte, por variaciones en la estabilidad proteica y consecuente discrepancia en la concentración intracelular efectiva de regulador. Por el Principio de Le Châtelier, un aumento en la concentración del regulador libre desplaza al mismo hacia la formación del complejo regulador-promotor produciendo, en consecuencia, un aumento en la actividad transcripcional del promotor blanco. Alternativamente, la diferente capacidad de inducción de PgolB podría ser causada por las diferencias en la secuencia de aminoácidos de estos dos reguladores

(Fig. 31), que podrían estar modificando o la afinidad por el ADN, o la capacidad de transducir intramolecularmente la señal inductora desde el dominio sensor al dominio de unión al ADN, o la capacidad para formar el complejo abierto.

Se analizó la capacidad de los reguladores CueRSTM y CueREC para activar la transcripción de reporteros bajo control de PcopA y de PgolB, en una cepa de Salmonella delecionada en golS y en cueRSTM. A diferencia de lo observado en E. coli, la sobre-expresión plasmídica de CueREC activó la expresión del gen reportero desde el promotor heterólogo PgolB de manera similar a lo observado con CueRSTM en ambos entornos celulares, esto es en E. coli y en Salmonella (Fig. 35). En ambos casos, el agregado de altas concentraciones de inductor de expresión plasmídica (IPTG) afecta negativamente la expresión del gen reportero, posiblemente debido a una disminución de la concentración del metal inductor libre en el citoplasma, producto del secuestro por

parte del exceso del regulador que es a su vez proteína de unión al metal, o bien a un efecto tóxico provocado por el exceso de regulador.

Esta diferencia de actividad transcripcional entre CueRSTM y CueREC podría deberse a variaciones en la concentración intracelular de metal entre E. coli y Salmonella, y/o a factores estructurales intrínsecos a dichos reguladores, tales como la afinidad por la secuencia promotora blanco o por el ión metálico inductor. Para poder discernir entre estas dos posibilidades, se construyeron reguladores quimeras fusionando el dominio N-terminal de unión al ADN (desde Met-1 a Asn-68) de CueRSTM al fragmento C-terminal (dominio de unión al efector metálico) de CueREC y viceversa. Estas quimeras se clonaron en el vector de expresión pSU36, bajo el control

un promotor inducible por IPTG, como se describió anteriormente para los reguladores silvestres. El nivel de actividad transcripcional se determinó in vivo por medio de ensayos de actividad -galactosidasa en una cepa de E. coli (W3110) ΔlacZ ΔcueR transformada con los plásmidos reporteros derivados del vector pMC1871 que expresan el gen lacZ bajo el control de los promotores de copA y golB, y los vectores que expresan los reguladores silvestres CueREC y CueRSTM y quiméricos CueREC-CSTM y CueRSTM-CEC. Como se muestra en la Fig. 36, el comportamiento de los reguladores quiméricos se asemeja al del regulador silvestre del cual proviene su dominio N- terminal. Es decir, CueREC-CSTM manifiesta un perfil de inducción similar al del regulador silvestre CueREC, lo que indica que es el dominio N-terminal de unión al ADN y no el dominio sensor C-terminal el responsable de conferir la respuesta transcripcional característica de este regulador. Lo mismo se observó con los reguladores CueRSTM y CueRSTM-CEC. Por lo tanto, las diferencias entre CueRSTM y CueREC podrían ser consecuencia, al menos en parte, de sutiles diferencias en sus afinidades por el ADN, o en la transducción intramolecular de la señal, y no parecieran ser debidas a la detección del metal inductor.

Discusión

1. CueR y GolS: evolución selectiva

Los factores transcripcionales deben ser capaces de localizar sus operadores a lo largo de todo el cromosoma, impidiendo su unión improductiva o incluso dañina a sitios ectópicos. Esto resulta particularmente relevante cuando proteínas regulatorias similares que reconocen operadores casi idénticos coexisten en una misma célula. Salmonella posee dos metalo-reguladores estructuralmente relacionados pero funcionalmente diferentes, pertenecientes a la familia de reguladores transcripcionales MerR, y que modulan la respuesta celular a la presencia de cantidades tóxicas de iones metálicos monovalentes en el medio ambiente (Checa y Soncini, 2011). Por medio del re- ensamblaje de la detección de la señal y de las secuencias operadoras reconocidas, el sensor de oro GolS, adquirido probablemente por transferencia horizontal, es capaz de inducir la expresión de sus genes blanco sin interferir con la función de la homeostasis de cobre del regulón cue, controlado por el regulador ancestral enterobacteriano CueR. En el trabajo publicado por Pérez Audero y colaboradores (2010) se demostró que la selectividad en el reconocimiento de los operadores blanco de cada regulón por sus reguladores innatos se logra por medio de modificaciones sutiles de las secuencias operadoras (bases nucleotídicas determinantes de especificidad de sensor correspondientes a las posiciones 3´ y 3 del operador). Esto también sugiere cambios sutiles en el motivo de unión al ADN en dichos reguladores transcripcionales, tal como se muestra en este Capítulo de Tesis.

Construimos proteínas híbridas entre GolS y CueR para identificar la región que dirige el reconocimiento de operador (Fig. 23). Estos estudios permitieron focalizarnos en la hélice-α2 (desde el residuo 14 al 22), que puede definirse como la mínima unidad estructural necesaria para la discriminación de operador entre los regulones gol y cue. Experimentos in vitro confirmaron estas observaciones mostrando que el sólo reemplazo de dicho motivo en cada regulador disminuye su afinidad por los operadores innatos e incrementa la afinidad por los operadores parálogos (Fig. 27).

No se dispone actualmente de información estructural de ningún sensor de metal del tipo MerR unido a su secuencia operadora, y en base a la información bioquímica y

genética disponible, se postuló que el mecanismo de distorsión del ADN para la activación transcripcional está conservado entre todos los miembros de la familia (Brown y col., 2003; Ma y col., 2009; Summers, 2009; Chen y col., 2010). Es por este motivo que asumimos que tanto CueR como GolS interaccionan con sus secuencias blanco de manera similar a como lo hacen homólogos MerR que no unen metal para los cuales se dispone de la estructura cristalográfica del complejo proteína-ADN (Zheleznova Heldwein y Brennan, 2001; Newberry y Brennan, 2004). Esto es, el eje de simetría del dímero de CueR y GolS se dispone enfrentado al surco menor en el centro del palíndromo (posición 1), mientras que la hélice-α2 se acerca al ADN en un segundo surco menor cercano a los surcos mayores adyacentes, en donde se localizan las bases nucleotídicas 3´ y 3. Un modelado in silico realizado para ambos reguladores, CueR y GolS, destaca a los residuos 16 y 19 como posibles candidatos para dirigir selectividad de reconocimiento de operador (Fig. 28-C). El intercambio de estos residuos de aminoácidos demostró que el residuo 16 es clave para reconocimiento selectivo de la base operadora de la posición 3 (Fig. 28). En presencia de iones de cobre la mutante CueRA16M imitó a GolS en la inducción de la expresión de PgolB::lacZ y PcopA::lacZ (Fig. 28-B). El cambio inverso en el perfil de inducción se detectó con GolSM16A. PcopA::lacZ alcanzó mayores niveles de inducción con GolSM16A que con GolS, en tanto que se logró una menor inducción por cobre de PgolB::lacZ con GolSM16A que con el sensor nativo de oro.

La contribución del residuo en posición 19 fue auxiliar al cambio del residuo en la posición 16. Los reguladores CueRF19Y y GolSY19F exhibieron un patrón de activación intermedio entre el regulador parental y el mutante con su hélice-α2 reemplazada. Sin embargo, su participación al ajuste fino en la interacción sensor/operador se corrobora por la observación de que los reguladores mutantes CueRA16M-F19Y y GolSM16A-Y19F fueron tan efectivos como los reguladores híbridos CueR-α2S y GolS-α2R, respectivamente, para activar los promotores controlados por los reguladores parálogos

(Fig. 28-B). Además, CueRA16M-F19Y y GolSM16A-Y19F activaron con mayor eficiencia la transcripción del gen reportero desde los promotores con sus bases 3´ y 3 sustituidas que desde los promotores silvestres (Fig. 30). Nuestra hipótesis es que la incapacidad de GolS de reconocer operadores con sustituciones C/G en las posiciones 3´ y 3 se deba a la formación de un tercer puente de hidrógeno entre los pares de bases C-G, que resultan ser menos deformables que los pares A-T. Esto podría resultar en interferencias

estéricas o electrostáticas en la interacción de GolS, el cual presenta un residuo de metionina en la posición 16, más voluminoso e hidrofóbico que un residuo de Ala, Ser o Thr. La presencia de un residuo distintivo de Met en la hélice-α2 del dominio de unión del ADN de GolS se extiende a todas las proteínas homólogas a GolS cuyas secuencias operadoras en sus genes blanco putativos conservan las bases 3´ y 3 A-T (Fig. 29; Pérez Audero y col., 2010). En cambio, los homólogos de CueR que reconocen promotores con las bases 3´ y 3 C/G-C/G conservan una Ala, Ser o Thr en la posición 16 y, de hecho, el reemplazo del residuo Ala16 de CueR por Thr no afecta su selectividad de operador (Fig. 28-B). Como era de esperar, el residuo en la posición 19 no muestra el mismo grado de conservación pero, interesantemente, los homólogos más cercanos a GolS presentan una Tyr en dicha posición, mientras que todos los homólogos a CueR poseen una Phe. De hecho, El recientemente caracterizado sensor de oro CupR de Cupriavidus metallidurans CH34, que controla la expresión de genes con operadores del tipo 3´ y 3 A-T (Jian y col., 2009), conserva los residuos Met y Phe distintivos de GolS en su dominio N-terminal de unión al ADN. Notoriamente, varios homólogos MerR que reconocen secuencias pseudopalindrómicas con un espaciamiento de 1 pb y que presentan las bases C/G-C/G típicas de los operadores reconocidos por CueR (por ejemplo los sensores BmrR, Mta y TipA, y los metalo-reguladores CadR y PbrR) conservan una Ala o una Thr en la posición 16, pero nunca una Met, mientras que poseen una Phe o una Tyr en la posición 19 (Watanabe y col., 2008). Por lo tanto, es evidente que el reconocimiento específico de operador entre reguladores del tipo CueR y GolS depende de la interacción del residuo de aminoácido en la posición 16 con la base nucleotídica distintiva en la posición 3 del operador.

En resumen, estos estudios sugieren que, a lo largo de la evolución, el re- ensamblado de ambos reguladores transcripcionales GolS y CueR, y de los elementos regulatorios en sus genes blanco, confiere una nueva habilidad para detectar diferentes señales ambientales, evitando, al mismo tiempo, la regulación cruzada que podría poner en riesgo la respuesta adecuada a una situación de estrés específica.