Las herramientas analíticas más utilizadas son las cromatográficas. La cromatografía es un método físico de separación para la caracterización de mezclas complejas. Se basa en el principio de retención selectiva. El objetivo de esta técnica es separar los distintos componentes de una mezcla, permitiendo identificar y determinar las cantidades de dichos componentes presentes en una muestra.
Las técnicas cromatográficas [155] son muy variadas, pero en todas ellas hay una fase móvil que consiste en un fluido (gas, líquido o fluido supercrítico) que arrastra la muestra a través de una fase estacionaria. Esta fase estacionaria consiste en un sólido o un líquido fijado en un sólido. Los componentes de la mezcla interaccionan de distinta forma con la fase estacionaria. De este modo, los componentes atraviesan la fase estacionaria a distintas velocidades y se van separando. Después de que los componentes hayan pasado por la fase estacionaria, separándose, pasan por un detector que genera una señal que puede depender de la concentración y del tipo de compuesto.
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Diferencias sutiles en el coeficiente de reparto de los compuestos da como resultado una retención diferencial sobre la fase estacionaria y por tanto una separación efectiva en función de los tiempos de retención de cada componente de la mezcla.
Las distintas técnicas cromatográficas se pueden dividir según cómo esté dispuesta la fase estacionaria:
Cromatografía plana. La fase estacionaria se sitúa sobre una placa plana o sobre un papel. Las principales técnicas son:
Cromatografía en papel
Cromatografía en capa fina
Cromatografía en columna. La fase estacionaria se sitúa dentro de una columna. Según el fluido empleado como fase móvil se distinguen:
Cromatografía de líquidos
Cromatografía de gases
Cromatografía de fluidos supercríticos
La cromatografía de gases es útil para gases o para compuestos relativamente volátiles, lo que incluye a numerosos compuestos orgánicos. En el caso de compuestos no volátiles se recurre a procesos denominados de "derivatización", a fin de convertirlos en otros compuestos que se volatilicen en las condiciones de análisis.
Dentro de la cromatografía líquida destaca la cromatografía líquida de alta resolución (HPLC, High Performance Liquid Chromatography), que es la técnica cromatográfica más empleada en la actualidad, normalmente en su modalidad de fase reversa, en la que la fase estacionaria tiene carácter no polar, y la fase móvil posee carácter polar (generalmente agua o mezclas con elevada proporción de la misma, o de otros disolvente polares, como por ejemplo metanol). El nombre de "reversa" viene dado porque tradicionalmente la fase estacionaria estaba compuesta de sílice o alúmina, de carácter polar, y por tanto la fase móvil era un disolvente orgánico poco polar.
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Análisis de lípidos neutros mediante HPLC-ELSD
La cromatografía es un método físico de separación basado en la distribución de los componentes de una mezcla entre dos fases inmiscibles, una fija o estacionaria y otra móvil. La cromatografía líquida de alta resolución (HPLC) es un tipo de cromatografía en la que la fase móvil es un líquido que fluye a alta presión a través de una columna que contiene una fase estacionaria con partículas de tamaño muy pequeño.
La cromatografía de fase normal utiliza una fase estacionaria polar y una fase móvil apolar. Esta técnica se caracteriza por separar los compuestos en base a los grupos funcionales polares presentes en la molécula, no teniendo apenas relevancia en la separación, las cadenas alquílicas o grupos hidrófobos. Este hecho posibilita la separación de clases de lípidos independientemente de la longitud y grado de insaturación de la cadena hidrocarbonada. No obstante, la estructura total de la molécula afecta a la separación, y aunque el efecto de los grupos alquilo sobre el tiempo de retención es limitado, también se debe tener en cuenta. Además, los efectos estéricos tienen también influencia en la retención, haciendo posible la separación de isómeros cis y trans. Por lo tanto, este tipo de cromatografía es la de elección cuando se tienen que analizar mezclas comerciales de aceites, debido a la presencia de una mezcla compleja de especies químicas.
El sistema de detección evaporativo de dispersión de luz ha revolucionado el análisis de lípidos mediante HPLC desde su introducción sobre el año 1978 [156]. Este tipo de detector trabaja mediante la dispersión de luz que producen las partículas sólidas de los solutos que permanecen en la muestra después de la evaporación de la fase móvil. El detector evaporativo de dispersión de luz (ELSD) ha permitido un gran avance en la detección de clases de lípidos mediante HPLC. Este detector no está limitado por la naturaleza del disolvente, su flujo o temperatura ambiente. Una de las principales ventajas del ELSD frente a otros detectores como los de fluorescencia, UV-visible o fotodiodos es su enorme versatilidad, ya que es un detector de masa y permite la detección y la cuantificación de metabolitos, tengan o no grupos cromóforos en su estructura. Esta característica hace que el ELSD ofrezca normalmente una cuantificación mucho más rápida y directa, ya que no es necesario derivatizar los compuestos para que sean detectados, y proporciona una respuesta cuantitativa. En el análisis de lípidos por HPLC el detector evaporativo de dispersión de luz puede ser usado para aquellos solutos que tengan volatilidad inferior a la de la fase móvil. El ELSD tiene gran aplicación en análisis farmacéutico,
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ya que permite la detección directa de todos los compuestos no volátiles, siendo indiferente su estructura química.
Figura 6. Diagrama del detector evaporativo de dispersión de luz (ELSD).
Análisis de lípidos por cromatografía de gases
El primer trabajo en el que se hace pasar una fase móvil gaseosa a través de una columna data de 1951, dando lugar a la técnica conocida como cromatografía de gases. Esta técnica, descrita por Martin y James en 1952, es en la actualidad un método usado ampliamente para la separación de los componentes volátiles y semivolátiles de una muestra. La combinación de altas resoluciones, sensibilidad y tiempos de análisis cortos la ha convertido una técnica de rutina usada en la mayoría de los laboratorios. Respecto a la cromatografía líquida, la cromatografía de gases tiene la ventaja de disponer de detectores mucho más universales (por ejemplo, el de ionización de llama). Además, para numerosas aplicaciones, los métodos son más simples, más rápidos y más sensibles que los correspondientes a la cromatografía líquida de alta
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resolución. La instrumentación requerida para cromatografía de gases también es mucho más sencilla y económica que la empleada en HPLC.
Sin embargo, en cromatografía de gases, la influencia de la temperatura sobre la distribución del equilibrio es considerable, a diferencia de la cromatografía líquida. Por ello, la cromatografía de gases presenta limitaciones en tres casos: compuestos poco volátiles, generalmente los de peso molecular superior a 300 u.m.a., compuestos sensibles a una elevación de la temperatura y compuestos que se encuentran en forma iónica (puesto que son en general poco volátiles).
Por esta razón, la cromatografía de gases se emplea cuando los componentes de la mezcla problema son volátiles o semivolátiles y térmicamente estables a temperaturas de hasta 350- 400ºC. En cambio, cuando los compuestos a analizar son poco volátiles y/o termolábiles, la técnica separativa adecuada suele ser la cromatografía líquida de alta resolución (HPLC).