Coefficient of performance

II.1 Materiales:

La α- (≥70%) y la β-caseína (>98%) de leche bovina fueron adquiridas desde Sigma Aldrich (St Louis, MO) y empleadas sin purificar. La ditirosina (diTyr) y la N-formilquinurrenina (NFK) fueron obtenidas desde la empresa Toronto Research Chemicals (Toronto, CA). La 3,4-dihidroxifenil-alanina (DOPA) y la quinurrenina (Kyn) fueron obtenidas de Sigma Aldrich. La tripsina Gold y la Glu-C para secuenciación fueron adquiridas de Promega (Madison, USA). El anticuerpo anti-ditirosina fue obtenido desde el Instituto del control del envejecimiento (Japan Institute for the Control of Aging, JaICA, Haruoka, Japan). El AAPH, la riboflavina (RF), el tricoloroacético (TCA), el ácido trifluoroacético (TFA), el ácido deoxicólico, el ácido metasulfónico (MSA) 4M con triptamina 0.2% p/v, la metionina sulfóxido (MetSO), la solución estándar de aminoácidos, el reactivo o-ftalaldehído (OPA) y el 2-mercaptoetanol fueron obtenidos de Sigma Aldrich. El azul de coomassie coloidal y el patrón de masas moleculares fueron obtenidos de Bio-Rad (California, USA). El resto de los reactivos necesarios para realizar SDS-PAGE y western-blotting fueron obtenidos de la empresa Termo Fisher. Todos los solventes empleados fueron grado HPLC.

II.2 Incubación de caseínas con AAPH

Se prepararon soluciones de las caseínas 3 mg/mL (α o β) con el AAPH (20 o 100 mM) en tampón fosfato (75 mM) pH 6,8. Estas muestras fueron incubadas a 37 °C durante 180 minutos. Durante la primera hora de incubación se tomaron alícuotas cada 15 minutos y luego cada 30 minutos.

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Durante la incubación, las muestras fueron burbujeadas con aire para mantener una concentración de O2 mínima que asegure la formación de los ROO● durante la termólisis del AAPH.

II.3 Iluminación de caseínas en presencia de la RF

Se prepararon soluciones de las caseínas 3 mg/mL (α o β) con la RF (35 μM) en tampón fosfato (75 mM) pH 6,8. Estas soluciones fueron iluminadas empleando un proyector de diapositivas Leica P150 empleando un filtro óptico de vidrio Schott BG-18 (Schott, Mainz, Alemania) el cual permite el paso de luz en la región 350-600 nm acorde a lo descrito por Leinisch y colaboradores (2017) [69]. La iluminación fue realizada durante 60 minutos a temperatura ambiente tomando alícuotas cada 15 minutos. Las muestras fueron iluminadas bajo un flujo de aire o bajo una atmósfera de N2. Los experimentos control fueron desarrollados incubando las soluciones descritas en la oscuridad.

II.4 SDS-PAGE y western blotting

Las modificaciones en la masa molar de las caseínas (α y β) expuestas a los ROO• derivados del AAPH (20 y 100 mM) y a los procesos fotoquímicos sensibilizados por la RF (35 μM) fueron estudiadas mediante electroforesis en gel de poliacrilamida con dodecilsulfato sódico (SDS-PAGE, por sus siglas en inglés). Las alícuotas (75 μL) de cada solución de las caseínas expuestas a las fuentes oxidantes fueron tratadas con 25 μL una disolución desnaturalizante compuesta de tampón Tris (62,5 mM) pH 6,8 que contiene 2% dodecilsulfato sódico (SDS), 10% glicerol, 300 µL de β-mercaptoetanol y trazas de azul de bromofenol. Estas muestras fueron calentadas en un baño de agua a 100 °C durante 5 minutos y una vez finalizado el proceso,

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enfriadas rápidamente para evitar una mayor oxidación de la proteína. Se emplearon estándares de pesos moleculares pre-teñidos para identificar el tamaño de la proteína nativa y de las proteínas oxidadas. La electroforesis fue efectuada a 100V durante 1-2 horas y la separación de las proteínas fue llevada a cabo empleando un gel de resolución (8-12% poliacrilamida) en tampón de corrida compuesto por Tris (25 mM), glicina (400 mM) y SDS (0,1%) pH 8,3. Una vez concluida la electroforesis los geles fueron teñidos con azul de Coomassie coloidal o se realizó una transferencia a membranas de PVDF empleando el instrumento iBlot 2 (Thermo Fisher, 25 V, 6 min). Concluida la transferencia, las membranas fueron incubadas con 1% BSA/TBST durante una hora a temperatura ambiente y posteriormente incubadas con el anticuerpo monoclonar anti-diTyr diluido 1000 veces con 1% BSA/TBST a 4 °C por 16 horas. Una vez concluido el paso anterior, se removió el anticuerpo primario y se incubó con un anticuerpo secundario conjugado a HRP diluido 5000 veces en 1% BSA/TBST a temperatura ambiente durante 1 hora. Finalmente se determinó la quimioluminiscencia originada al añadir una solución comercial de luminol (ECL Plus Solution, Thermo Fisher) a la membrana. Esta fue determinada empleando un equipo Syngene G Box con el obturador en modo automático [69,72,73].

II.5 Análisis densitométrico de geles SDS-PAGE

Los geles SDS-PAGE teñidos con azul de Coomassie coloidal fueron desteñidos con agua ultrapura y escaneados empleando el equipo GelMax® Imager, UVP o, en su defecto, en un escáner de impresora multifuncional marca Konica Minolta Bizhub C280. Se realizó una cuantificación de los pixeles de los geles escaneados empleando el software Image J®.

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II.6 Consumo de los monómeros de las caseínas determinado por cromatografía líquida acoplada a detector UV.

Se tomaron alícuotas (200 μL) de las muestras de las caseínas (control y oxidadas) a las cuales se les adicionaron 400 μL de una solución desnaturalizante (Tris 165 mM, Urea 8 M, citrato de sodio 44 mM y 0.3 % v/v de 2-mercaptoetanol). Posteriormente, las muestras desnaturalizadas fueron transferidas a viales de HPLC y analizadas en un cromatógrafo líquido de alta eficiencia (HPLC) acoplado a un detector con arreglo de diodos (Agilent 1200 series) y a un sistema de inyección automático (Multisampler Agilent 1260 series, Infinity II) el cual fue mantenido a 4 °C durante el análisis. La separación cromatográfica fue realizada bajo un flujo de 0,8 mL/min empleando como fase estacionaria una columna Jupiter® C4 (5 μm, 300 Å, 250 x 4.6 mm, Phenomenex, Torrance, CA, USA) la cual fue mantenida a 40 °C. Las fases móviles y el gradiente utilizado son descritos en la tabla 1. La muestras fueron monitorizadas a una longitud de 210 nm y se utilizaron estándares comerciales de ambas proteínas, los cuales fueron analizados en las mismas condiciones cromatográficas. Todos los análisis de datos fueron llevados a cabo empleando el programa OpenLAB (Santa Clara, CA, USA).

Tabla 1: Gradiente de fases móviles A (0,1% TFA en agua) y B (0,1 % TFA en acetonitrilo) empleada en la separación cromatográfica de las muestras de las caseínas oxidadas.

Tiempo (min) % A % B

0 65 35

25 50 50

26 65 35

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II.7 Determinación de la composición aminoacídica mediante cromatografía líquida con detector de fluorescencia (HPLC-FLD)

La composición aminoacídica de las caseínas oxidadas y no oxidadas fue determinada empleando el método descrito por Hawkins y colaboradores (2009) con modificaciones menores [74]. A una alícuota de 200 μL de las muestras de las caseínas (control y oxidadas) se le adicionaron 50 μL de una solución de TCA al 50% p/v. Seguida de una incubación por cinco minutos en un baño con hielo para facilitar la precipitación de las proteínas. Una vez precipitadas, las muestras fueron centrifugadas durante dos minutos a 9.000 g (4 °C). Se descartó el sobrenadante y el precipitado obtenido fue lavado dos veces con acetona fría y centrifugado durante dos minutos a 9.000 g (4 °C). Luego, se descartó el sobrenadante y el precipitado fue secado empleando un flujo de N2 gaseoso previo a ser resuspendido en 150 µL de MSA con triptamina 0,2 % p/v. Posteriormente las muestras fueron incubadas a 110 °C durante 16 horas. Posteriormente las muestras fueron neutralizadas con NaOH 4 M, filtradas y diluidas con agua ultrapura. Las muestras fueron conservadas a -20 °C hasta su análisis por HPLC-FLD empleando la derivatización pre-columna con el reactivo OPA [74,75]. La activación del OPA fue realizada adicionando 5 µL de 2- mercaptoetanol a 1 mL del reactivo incompleto de OPA [76].

La derivatización de las muestras fue realizada adicionando 20 µL de OPA activado a 40 µL de muestra con un tiempo de incubación de 1 minuto a temperatura ambiente. Estas fueron inyectadas en el HPLC-FLD empleando una longitud de onda de excitación de 340 nm y una longitud de onda de emisión de 440 nm para la detección por FLD. La concentración de los aminoácidos fue obtenida utilizando una curva de calibrado realizada mediante la adición de 10 µL de una solución madre de aminoácidos (Sigma-Aldrich), 5 µL de MetSO (1 mM) y 980µL de agua ultrapura. A partir de esta solución se realizó una curva de calibrado para cada aminoácido bajo estudio. Todos los picos cromatográficos correspondientes a la señal

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de aminoácidos derivatizados fueron normalizados al pico cromatográfico correspondiente del aminoácido Leu. Esto permite relativizar cualquier pérdida de material durante el proceso de hidrólisis. Finalmente los datos fueron presentados como n° de residuos por molécula de proteína.

La separación cromatográfica fue realizada empleando una columna de HPLC RP-18 Purospher® Merck (250 x 4.6 mm) la cual permite determinar los residuos de Lys (análisis de aminoácidos en las muestras incubadas con el AAPH) o una columna C-18 Phenomenex Kinetex® 2.6 µm EVO (150 × 3 mm) en la cual no es posible cuantificar los residuos de Lys (análisis aminoacídico de las caseínas iluminadas en presencia de la RF), la fase móvil y las fases móviles y condiciones cromatográficas son las descritas en la tabla 2.

Tabla 2: Gradiente de fase móvil A (NaAc 100 mM pH 5,3; THF 2,5% v/v; metanol 20% v/v en agua ultrapura) y B (NaAc 100 mM pH 5,3; THF 2,5% v/v; metanol 80% v/v en agua ultrapura) empleada en la separación cromatográfica de los aminoácidos derivatizados con el reactivo OPA. Tiempo (min) % A % B 0 100 0 2,5 100 0 11,3 75 25 13,5 60 40 14,5 45 55 17,5 32 68 18 0 100 21 0 100 21,5 100 0

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II.8 Estudios espectroscópicos de fluorescencia

Los estudios de fluorescencia fueron realizados en un fluorímetro Perkin Elmer LS55. Se estudió la cinética de consumo del Trp (λex: 295 nm, λem: 350 nm), así como también la formación de sus productos de oxidación; la NFK (λex: 325 nm; λem: 434 nm) y la Kyn (λex: 365 nm; λem: 480 nm) en las muestras de caseínas (3 mg/mL) incubadas con distintas dosis de radicales peroxilo derivados de la termólisis del AAPH (20 y 100 mM). Adicionalmente, se determinó la formación de la diTyr (λex: 280 nm; λem: 410 nm) [77,78].

II.9 Estudios acerca de la agregación de las caseínas por dispersión dinámica de luz (DLS)

Los experimentos de DLS fueron realizados empleado el instrumento Zeta sizer S-590 (Malvern Instrument, USA). La temperatura del instrumento fue ajustada a 25 °C (viscosidad del agua = 0,883 cP, índice de refracción = 1,330). Las muestras de caseínas (control y oxidadas) fueron transferidas a cubetas desechables de policarbonato y analizadas. Los valores presentados corresponden al tamaño promedio de las partículas (Z- average) e índice de polidispersidad (PdI) los cuales fueron obtenidos luego de medir durante 400 segundos.

II.10 Detección y cuantificación de los grupos carbonilos en las caseínas

La detección de los carbonilos en banda fue realizada empleando el kit de productos de oxidación de proteínas (OxyblotTM_{, S7150, Millipore, USA). El} procedimiento es similar al empleado en los experimentos de western

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blotting para detectar la diTyr con modificaciones menores. Alícuotas (10

μL) de las muestras control y oxidadas de la α- y la β-caseínas fueron transferidas a tubos eppendorf. Se añadieron 10 μL de SDS (12 % p/v) para obtener una concentración final 6% p/v de SDS. Una vez desnaturalizadas, se añadieron 20 μL de una solución 1x DNPH a cada tubo y estos fueron incubados durante 20 minutos en oscuridad a 21 °C. La reacción fue detenida añadiendo 15 μL de una solución de neutralización. Las muestras derivatizadas fueron separadas mediante SDS-PAGE y transferidas a membranas de PVDF. La detección de los carbonilos en banda fue lograda incubando la membrana con el anticuerpo primario anti-DNP (diluido 1:150) durante 24 horas a 4°C y luego con el anticuerpo secundario conjugado a peroxidasa de rábano (diluido 1:300) durante 2 horas a 21 °C. Una vez transcurrido este período se añadió una solución con luminol (ECL Plus®) y se procedió a determinar la quimiolumiscencia de este empleando el instrumento G-box Imager.

La cuantificación de carbonilos totales fue realizada empleando el método descrito por Hawkins y colaboradores (2009) [74]. Previo a la derivatización, las muestras fueron diluidas a 1 mg/mL. A cada alícuota (250 μL de muestra) se le adicionaron 250 μL de una solución de DNPH 10 mM incubándolas a temperatura ambiente durante 20 minutos en oscuridad. Posteriormente las proteínas fueron precipitadas añadiendo 125 μL de TCA 50% (p/v) y centrifugando a 9000 g a 4 °C. Los pellet de proteínas fueron resuspendidos en clorhidrato de guanidina 6 M. La absorbancia de las muestras derivatizadas fue medida a 370 nm empleando un espectrofotómetro UV-Vis modelo UVD 2950 (Labomed Inc, Los Angeles, CA, USA).

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II.11 Determinación y cuantificación de los productos de oxidación del Trp y la Tyr mediante cromatografía líquida acoplada a detector de fluorescencia (UPLC-FLD)

Las muestras de caseínas (control y oxidadas) fueron hidrolizadas empleando ácido metasulfónico (sección II.7) y neutralizadas según lo descrito por Hawkins y colaboradores (2009) [74]. Dado que el proceso de hidrólisis se realiza bajo condiciones ácidas, la NFK uno de los productos de oxidación del Trp, es hidrolizada a la Kyn. Por ello, la cuantificación de la Kyn representa la suma de ambas especies (NFK + Kyn) [79]. Se tomaron 4 μL de muestra los cuales fueron inyectados en un sistema UPLC- FLD empleando una columna de fase reversa (Phenomenex Kinetex 2.6 µm EVO 150 × 3 mm) mantenida a 30 °C. Las fases móviles y condiciones cromatográficas son descritas en la tabla 3. El análisis de los resultados fue realizado empleando el programa Shimadzu Lab Solutions Browser

software. La asignación de cada pico cromatográfico y la cuantificación de

los productos de oxidación de la Tyr (DOPA, diTyr) y el Trp (NFK + Kyn) fue lograda luego de realizar una curva de calibrado empleando los estándares comerciales para cada uno de los productos (figura S1).

Tabla 3: Gradiente de fase móvil A (Perclorato de sodio 100 mM, ácido fosfórico 10 mM) y B (metanol 80% v/v en agua ultrapura) empleada en la separación cromatográfica de los productos de oxidación de la Tyr (DOPA y diTyr) y del Trp (NFK + Kyn).

Tiempo (min) % A % B Ch1 λex / λem Ch2 λex / λem 0 100 0 280 / 320 370 / 510 10 100 0 260 / 450 280 / 410 15 100 0 280 / 350 21 82 18 23 40 60 23,5 35 65 27 5 95 27,5 100 0

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II.12 Hidrólisis básica y detección del diTrp y la diTyr mediante espectrometría de masas.

Para detectar el diTrp y la diTyr en las caseínas oxidadas, se prepararon muestras de estas proteínas incubándolas con el AAPH (100 mM) a 37 °C durante 180 minutos. Adicionalmente, soluciones compuestas por la α- o la β-caseína (3 mg/mL) y el AAPH (100 mM) fueron iluminadas a 365 nm durante 5 minutos en un foto-reactor (SolSim Photoreactor, Luzchem Research Inc.) equipado con 8 lámparas (Luzchem LZC-UVB lamp) con una energía de 1 mW (Powermeter ThorlabTM _{PM100 con un detector} S120UV 200-1100 nm). Alícuotas de estas muestras fueron sometidas a una hidrólisis alcalina para liberar los dímeros del Trp y de la Tyr de acuerdo a la metodología descrita por Carroll y colaboradores (2017) [67]. Las soluciones de trabajo (250 μL) fueron liofilizadas y luego resuspendidas en 100 μL de NaOH (5 M) con 3% (v/v) de β-mercaptoetanol. Se removió el O2 mediante ciclos de vacío y purga con N2 gaseoso previo a incubar las muestras a 110 °C durante 5 horas. Estas muestras fueron enfriadas, neutralizadas añadiendo 100 μL de HCl (5 M) y filtradas empleando filtros Nanosep 0,2 µm (Millipore) previo a los análisis por espectrometría de masas. Las muestras hidrolizadas fueron analizadas empleando un cromatógrafo líquido UPLC Ultimate 3000 RSLC system acoplado a un espectrómetro de masa con trampa de iones Ion Trap Mass Spectrometer LTQ XL (Thermo scientific). Las muestras fueron separadas en una columna de fase reversa HP Inertsil® ODS-4 (3 µm, 2,1 x 100 mm, GL Sciences) la cual fue mantenida a 30 °C. Se utilizó un flujo de 0,2 mL/min y la fase móvil empleada fue ácido fórmico 0,1% v/v en agua ultrapura (fase A) y ácido fórmico 0,1% v/v en metanol 50% v/v en agua ultrapura (fase B). El gradiente de estas fue el siguiente: La fase B fue mantenida en 0% durante un minuto antes de subir hasta un 80% a los 10 minutos de corrida. Luego B fue mantenido a un 80% constante durante 10 minutos antes de volver a 0% en un período de 3 minutos. Finalmente se equilibró el sistema durante 7 minutos con 0% de B antes de realizar la siguiente corrida

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cromatográfica. La detección de masas fue realizada empleando ionización por electrospray (ESI) con un voltaje de 3000V (a 350 °C). La detección de los productos fue realizada en modo full scan en el rango de masas correspondiente a 100-1000 m/z en modo positivo. Los espectro de masa MS2 _{y MS}3 _{fueron obtenidos empleando He como gas de colisión (CID) con} una energía de colisión normalizada a 35 unidades y detección de los fragmentos en modo full scan. Los enlaces de diTrp fueron detectados empleando el modo SRM (selected reaction monitoring) con parámetros de búsqueda de fragmentos e iones padre asignados de acuerdo a lo reportado en literatura [67,68].

II.13 Modificaciones en la secuencia primaria de la β-caseína inducidos por los ROO●. Estudios por MALDI-TOF.

Dada la formación de fragmentos de ambas caseínas durante su oxidación mediada por los ROO● o reacciones sensibilizadas por la RF, se realizó un estudio por MALDI-TOF para dilucidar su origen. La oxidación de ambas caseínas llevó a la formación de fragmentos, sin embargo, debido a la imposibilidad de separar el fragmento de la α-caseína con respecto a la banda monomérica de ésta proteína, estos estudios se desarrollaron sólo con la β-caseína.

Para realizar una secuenciación de la β-caseína ésta fue sometida a digestión enzimática en geles o en solución. Se emplearon las enzimas tripsina y GluC para obtener una mayor cobertura de la secuencia de la proteína. Las muestras control e incubadas con AAPH (20 mM) durante 60 minutos a 37 °C fueron corridas en geles SDS-PAGE o almacenadas a -80 °C. La preparación de las muestras para realizar la digestión en geles fue llevada a cabo empleando la metodología descrita por Shevchenko y colaboradores (2007) sin modificaciones [80]. Brevemente, las bandas de interés fueron cortadas desde los geles SDS-PAGE con un bisturí y se procedió a desteñir estas incubándolas con una solución de bicarbonato de amonio (100 mM) y ACN (1:1) durante 30 minutos a temperatura ambiente.

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Posteriormente se removió la solución con precaución de no dañar los geles y se procedió a reducir y alquilar las proteínas en las bandas cortadas. Para ello se realizó en primer lugar una incubación con DTT (10 mM) a 56 °C durante 30 minutos. Se removió el líquido y se adicionaron 50 μL de una solución de cloroacetamida (55 mM) y se incubó a temperatura ambiente (en oscuridad) durante 20 minutos. Finalmente, los geles fueron deshidratados añadiendo 500 μL de ACN. Se removió el ACN y las bandas fueron re-hidratadas con el volumen suficiente de una solución de tripsina (0,1 μg/μL) para tener una razón final 20:1 de proteína:enzima. Las bandas cortadas fueron incubadas durante 2 horas para permitir el ingreso de tripsina al gel. Una vez realizado este procedimiento, el tratamiento de muestras fue el mismo que se realiza con las muestras digeridas en solución (vide infra). La digestión en solución (alícuotas almacenadas a -80 °C) fue llevada a cabo luego de realizar un cambio de tampón empleando filtros con punto de corte de 10 kDa para dejar las muestras en bicarbonato de amonio (100 mM). Posteriormente, al igual que en la digestión en geles, las muestras fueron reducidas y alquiladas con DTT y cloroacetamida, respectivamente. Una vez listas las muestras, se añadió una cantidad suficiente de GluC o tripsina para tener una razón 50:1 de proteína:enzima. Las muestras fueron incubadas durante 18-20 horas a 37 °C [81].

Una vez digeridas las muestras, se procedió con el tratamiento de estas para eliminar sales, así como también restos de proteína no hidrolizada empleando una resina C-18 y empleando como eluyente TFA 0,1% en ACN (60% v/v). Finalmente se tomó 1 μL de muestra al cual se le adicionó 1 μL de la matriz compuesta por ácido α-ciano-4-hidroxicinámico para formar cristales en la placa del instrumento MALDI-TOF [82].

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II.14 Análisis estadístico

Todos los datos presentados en esta tesis corresponden al promedio (con sus respectivas desviaciones estándares) de al menos tres experimentos realizados de forma independiente. Los datos (en gráficos) representados con un asterisco sobre ellos corresponden a aquellos con una diferencia estadística (p<0,05) respecto a sus controles. Las diferencias estadísticas fueron determinadas mediante la aplicación del test ANOVA de un factor con una prueba post hoc con el test de Tukey empleando el programa computacional Origin 8®.

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