TESTS OF RED BLOOD CELLS
Normal 11. 5–14.5 coefficient of variation (CV) of red cell size Procedure
El grupo de AO enzimáticos cataliza la transferencia de electrones desde un sustrato hacia los RL. Posteriormente los sustratos a agentes reductores empleados en estas reacciones se regeneran para ser nuevamente activos y lo hacen a expensas del NADPH producido en las diferentes vías metabólicas (Chaudiere, et al, 1999). Frente a una situación de exposición prolongada a ROS puede ocurrir una disminución en las concentraciones del NADPH necesario en otros importantes procesos fisiológicos (Miller, et al, 1993), a pesar de que algunos AO enzimáticos no consumen cofactores.
Dentro de los antioxidantes enzimáticos se destacan:
La superóxido dismutasa (SOD): es una enzima compuesta de metaloproteinas, presente en las células aerobias y fluidos extracelulares. Su función es catalizar la dismutación de RL superóxido a peróxido de hidrogeno, lo que no requiere cosustratos (Bandyopadhayay, et al., 1999)
Esta reacción puede representarse como las siguientes semireacciones:
• M(n+1)+− SOD + O2−→ Mn+ − SOD + O2
• Mn+− SOD + O2− + 2H+→ M(n+1)+ − SOD + H2O2. Donde M = Cu (n=1); Mn (n=2); Fe (n=2); Ni (n=2).
En ella el estado de oxidación del catión metálico oscila entre n y n+1.
En humanos existen tres isoformas de SOD, dependiendo del metal que contenga. Las isoformas predominantes son la SOD1 se encuentra en el citoplasma como SOD-Cu y SOD- Zn, localizadas preferentemente en el citosol. Ver figura 6.
Figura 6:Estructura de la CuZn-SOD. Tomado de: Muller, et al., 2006
La isoforma SOD2 o SOD-Mn se encuentra en la matriz mitocondrial y SOD3 en el líquido extracelular. La primera es un dímero (consiste en dos subunidades), mientras que las otras son tetrámeros (cuatro subunidades) (Chaudiere, et al., 1999).
La biosíntesis de estas enzimas se encuentran fuertemente regulados por la concentración del sustrato sobre el cual actúa SOD1 y SOD3 contienen cobre y zinc, mientras que SOD2 tiene manganeso en su centro reactivo. Los genes se encuentran localizados en los cromosomas 21, 6 y 4, respectivamente (21q22.1, 6q25.3 y 4p15.3-p15.1) (Yu, 1994).
El citosol de la mayoría de las células eucariotas contiene una enzima SOD con cobre y zinc (Cu-Zn-SOD). Por ejemplo, la Cu-Zn-SOD disponible comercialmente es purificada habitualmente de eritrocitos de bovinos: PDB 1SXA, EC 1.15.1.1. Esta enzima es un homodímero con peso molecular de 32,5 kDa (Figura 6). Las dos subunidades están unidas por interacciones hidrofóbicas y electrostáticas. Los ligandos de cobre y zinc son cadenas laterales de histidina.
Mitocondrias de hígado de pollo (y casi todos los demás) y numerosas bacterias (por
ejemplo, E. coli) contienen una isoforma con manganeso (Mn-SOD). Ésta se localiza en
mitocondrias humanas: PDB 1N0J, EC 1.15.1.1. Los ligandos de los iones de manganeso son tres cadenas laterales de histidina, una de aspartato y una molécula de agua, o un ligando hidroxilo dependiendo del estado de oxidación del Mn (II y III respectivamente).
E. coli y muchas otras bacterias contienen una isoforma que contiene hierro (Fe-SOD: PDB 1ISA, EC 1.15.1.1), algunas, Mn-SOD, y otras, ambas. Los sitios activos de las superóxido dismutasas de Mn y Fe contienen el mismo tipo de cadenas laterales de aminoácidos.
La SOD protege a la célula de las reacciones dañinas del superóxido. La reacción de superóxido con especies no radicales no es permitida por spin según las reglas de selección. En sistemas biológicos esto significa que sus principales reacciones son con sí mismo (dismutación) o con otro radical biológico como el óxido nítrico (NO). El anión radical de
superóxido (O2-) espontáneamente dismuta a O2 y peróxido de hidrógeno (H2O2) de forma
bastante rápida (~105 M-1 s-1 a pH 7). SOD es biológicamente necesaria porque el superóxido reacciona aún más rápido con algunos blancos como el radical de NO, que forma peroxinitrito. De forma similar, la tasa de dismutación es de segundo orden con respecto a la concentración inicial de superóxido. Aunque la vida media del superóxido es muy corta en concentraciones muy elevadas (e.g. 0,05 segundos a 0,1mM) es bastante larga en bajas concentraciones (e.g. 14 horas a 0,1 nM). En contraste, la reacción de superóxido con SOD es de primer orden con respecto a la concentración de superóxido. Además, la SOD tiene el mayor número de recambio (tasa de reacción con su sustrato) de ninguna enzima conocida (~109 M-1 s-1), esta reacción está solamente limitada por la frecuencia de colisiones de la enzima con el superóxido. Es decir, la tasa de reacción está limitada por la difusión.
Superóxido es una de las principales especies reactivas del oxígeno en la célula y la SOD tiene un papel fundamental como antioxidante. La importancia fisiológica de la SOD es ilustrada por las severas patologías que se evidencian en ratones genéticamente
modificados para que carezcan de esta enzima. Los ratones sin SOD2 mueren a los pocos días de nacer por estrés oxidativo masivo (Li, et al., 1995). Los ratones sin SOD1 desarrollan una gran variedad de patologías, incluyendo hepatocarcinoma (Elchuri, et al., 2005). La acelerada pérdida de masa muscular relacionada con la edad, la temprana incidencia de cataratas y una esperanza de vida reducida. (Muller, et al., 2006). Los ratones carentes de SOD3 no muestran deficiencias obvias y tienen una esperanza de vida normal (Sentman, et al., 2006).
Glutatión peroxidasa (GPx): es una selenoproteina que, en las células animales, se ubican en la matriz mitocondrial y en el citosol. En presencia de GSH, como agente reductor,
cataliza la reducción del peróxido de hidrogeno y otros hidroperóxidos orgánicos en agua y alcohol, respectivamente (Powers, et al., 1999). Al igual que otras selenoproteínas, el sitio activo de GSH-Px contiene selenio (Se) bajo la forma de residuos de selenocisteína incorporada a una cadena polipetidica conformada por 21 aminoacidos (Figura7) (Stadtman, 1996).
Figura 7:Estructura de la (Se-GPx). Tomado de Fersht, 1998
Las intervenciones de la GPx pueden evidenciarse en las siguientes reacciones:
Se han descrito cuatro isofromas de la GSH-Px que difieren tanto en su ubicación como en la especificidad del sustrato (Holben, et al., 1999), tres de las cuales presentan estructura tetramérica (Arthur, 2000; Alan, et
al., 1999). La primera de ellas, GSH-Px celular o
clásica, está prácticamente en todas las células, puede reducir el peróxido de hidrogeno e hidroperóxidos orgánicos libres y convertirlos en agua y alcoholes la alta correlación existente entre su actividad sanguínea y la concentración plasmática de Se (selenio) ha permitido emplearla como indicador para evaluar el balance metabólico nutrimental de este mineral en diferentes
especies, principalmente bovinos lecheros (Ceballos, et al., 1999; López, et al., 1997) y ovinos (Grace, 1994).
La segunda isoforma es la GSH-Px plasmática o extracelular, es una glicoproteína purificada, caracterizada a partir de plasma humano que se sintetiza en las células tubulares proximales del riñón.
El tercer tipo es la GSH-Px fosfolípido hidroperóxido, cuya función biológica primaria es proteger contra la LPO reduciendo hidroperóxidos de ácidos grasos en las membranas celulares y previniendo la oxidación de lipoproteínas de baja densidad. Es la única isoforma cuya estructura es monomérica; es decir, contiene un solo residuo de selenocisteína (Arthur, 2000; Allan, et al., 1999).
El último tipo se denomina GSH-Px gastrointestinal y representa la principal peroxidasa dependiente de glutatión en el tracto gastrointestinal. Es importante en la reducción de hidroperóxidos de colesterol y en la protección contra la toxicidad por ingestión de hidroperóxidos lipídicos (Holben, et al., 1999).
Catalasa: es una enzima que encuentra en organismos vivos; es una hemoproteína que contiene cuatro grupos hem. De amplia distribución intracelular, se concentra principalmente en peroxisomas y mitocondrias (Powers, et al., 1999; Murray, et al., 1994),
para catalizar la descomposición del peróxido de hidrogeno –proveniente de la dismutación del superóxido- en agua y oxigeno. Esta función es compartida con la enzima glutatión peroxidasa que no requiere el cofactores. (Figura 8)
Figura 8: Estructura de la catalasa
Tomado de Fersht, 1998
El mecanismo completo de la catalasa no se conoce, aun así la reacción química se produce en dos etapas:
H2O2 + Fe(III)-E → H2O + O=Fe(IV)-E H2O2 + O=Fe(IV)-E → H2O + Fe(III)-E + O2
Donde Fe-E representa el núcleo de hierro del grupo hemo unido a la enzima. En general las bajas concentraciones de peróxido de hidrógeno estimulan la actividad de peroxidasas, mientras que altas concentraciones de peróxido son preferentemente catalizadas por la catalasa (Yu, 1994).