Coffee Production Method in the Study Area

4.1.1. GANANCIA DE PESO ASOCIADA A LA EDAD

Con el objetivo de determinar los cambios moleculares que tienen lugar en el WAT durante la ganancia de peso asociada a la edad, en primer lugar definimos el rango de edades en el que se iba a realizar el estudio. Para ello, en base a estudios previos (Borghjid and Feinman, 2012; Boucher et al., 2012; Guo et al., 2009; Lee et al., 2014a; Wolf et al., 2014), se pesaron ratones macho de la cepa de C57/BL6j de 3-4 meses y de 8-10 meses de edad. El peso de los ratones macho incrementaba desde los 31,7 ± 1,2 g (en ratones de 3-4 meses de edad) hasta los 43,3 ± 3,7 g (en ratones de 8-10 meses de edad) (Figura 4A), indicando que la ganancia de peso asociada a la edad tiene lugar de forma progresiva y comienza en etapas tempranas durante la vida del ratón.

Figura 4. Ganancia de peso asociada a la edad.

(A) Peso de ratones de 3-4 meses (n=11) y 8-10 meses (n=10) mantenidos con dieta normal (B) Peso de eWAT de ratones de 3-4 meses (n=11) y 8-10 meses (n=10) mantenidos con dieta normal. La línea representa la media del conjunto de datos. Para el análisis estadístico se aplicó T-Student (***, p<0,001).

Además, estas diferencias en el peso del animal completo también se tradujeron en un aumento tanto en la masa del tejido adiposo blanco epididimal (eWAT) (Figura 4B), como en el tamaño de los adipocitos del eWAT de ratones de 8-10 meses respecto a ratones de 3-4 meses (Figura 5). La elección del eWAT como modelo de estudio se fundamenta en que, por una parte, es uno de los acúmulos de grasa que más se expande durante el envejecimiento y, por otra, su expansión se ha asociado con el desarrollo de enfermedades metabólicas (Lee et al., 2013). A la vista de los resultados obtenidos, focalizamos nuestro trabajo en la comparativa entre ratones de 3-4 meses, a

los   que   denominaremos   “jóvenes”   y   ratones   de   8-10 meses, a los que llamaremos “envejecidos”   que nos permitirán estudiar los desencadenantes moleculares de la expansión del WAT asociada a la edad relacionados con el metabolismo de los adipocitos.

Figura 5. Cambio en el tamaño de los adipocitos durante la ganancia de peso asociada a la edad.

(A) Media del tamaño de adipocitos y (B) distribución de frecuencias de tamaño de los adipocitos en el WAT de ratones de 3-4 meses (n=7) y ratones de 8-10 meses (n=5). Los valores representan la media ± error estándar. Para el análisis estadístico se aplicó T-Student (*, p<0,05; **, p<0,01; ***, p<0,001).

4.1.2. CAMBIOS MOLECULARES ASOCIADOS A LA EXPANSIÓN DEL eWAT

Para ahondar en el estudio de los cambios moleculares que tienen lugar durante el envejecimiento en el eWAT nos centramos, en primera instancia, en la mitocondria puesto que se ha descrito que juega un papel fundamental en la biología del adipocito blanco (Bournat and Brown, 2010; Kusminski et al., 2012; Rosen and Spiegelman, 2014; Villarroya et al., 2009) así como durante el envejecimiento (Lopez-Otin et al., 2013). En primer lugar se comparó el contenido mitocondrial de adipocitos aislados del eWAT de ratones jóvenes y envejecidos, pero no se encontraron diferencias significativas entre ambos grupos (Figura 6).

Figura 6. Contenido mitocondrial en adipocitos blancos.

Se analizó el contenido mitocondrial (cantidad de ADN mitocondrial frente a cantidad de ADN genómico) en ratones jóvenes y envejecidos. Los valores representan la media ± error estándar. Para el análisis estadístico se aplicó T-Student (ns significa diferencia no significativa).

En segundo lugar, se analizó la expresión de marcadores de diferentes complejos de la cadena de transporte de electrones (ETC) en adipocitos aislados del eWAT de ratones jóvenes y envejecidos. Tanto las imágenes de western blot (Figura 7A), como las cuantificaciones los mismos (Figura 7B) muestran que los niveles de expresión de la subunidad 9 del subcomplejo 1 alfa de la NADH deshidrogenasa (NDUFA9; complejo I), la subunidad A del complejo succinato deshidrogenasa (SDHA; complejo II), la proteína nuclear 1 de la ubiquinol-citocromo c reductasa (UQCRC1; complejo III) y el canal dependiente de la tensión de aniones 1 (VDAC1) no se alteraban significativamente durante el envejecimiento. Sin embargo, la expresión de la subunidad Vb de la citocromo c oxidasa (COX5B; complejo IV) se veía reducida de manera muy significativa en los adipocitos blancos de ratones envejecidos y, además, esta disminución en la expresión de COX5B se tradujo en una disminución en la actividad del complejo IV (Figura 7C).

En conjunto, estos datos indican que la disminución en la expresión y actividad del complejo IV correlaciona con la expansión del eWAT asociada a la edad.

Figura 7. La cantidad y actividad del complejo IV disminuye en adipocitos blancos de ratones envejecidos.

(A) Western blot representativo y (B) cuantificación de los niveles de expresión de diferentes subunidades de complejos mitocondriales COX5B, UQCRC1, SDHA, NDUFA9 y VDAC1 en adipocitos aislados de eWAT de ratones jóvenes (n=12) y envejecidos (n=10). La cuantificación de western blot se llevó a cabo mediante el software ImageJ. (C) Actividad del complejo IV en adipocitos aislados de eWAT de ratones jóvenes (n=6) y envejecidos (n=10). Los valores representan la media ± error estándar. Para el análisis estadístico se aplicó T-Student (**, p<0,01;***, p<0,001; ns significa diferencia no significativa).

Por último, con el objetivo de determinar si la disminución del complejo IV asociada a la expansión del eWAT implicaba variaciones en la expresión de todas sus subunidades, se analizaron los niveles de ARNm de las 10 subunidades de complejo IV codificadas en el núcleo (Figura 8). Sorprendentemente no todas ellas se afectaban por igual, sino que los niveles de expresión de Cox5b, Cox8a, Cox6c y Cox6a1 se veían reprimidos durante el envejecimiento; mientras que el del resto de subunidades permanecía sin cambios (Figura 8).

Figura 8. Cox5b, Cox8a, Cox6c y Cox6a1 son más sensibles al envejecimiento en adipocitos que el resto de subunidades del complejo IV.

Análisis de niveles de ARNm mediante RT-PCR de las 10 subunidades de complejo IV codificadas en el núcleo en adipocitos aislados del eWAT de ratones jóvenes y envejecidos (n=7). Los valores representan la media ± error estándar. Para el análisis estadístico se aplicó T- Student (*, p<0,05; ns significa diferencia no significativa).

En conjunto, estos resultados indican que no todos los componentes mitocondriales son igual de sensibles a la expansión del WAT asociada a la edad, siendo el complejo IV especialmente sensible al envejecimiento en adipocitos blancos y, más concretamente, 4 de sus subunidades: Cox5b, Cox8a, Cox6a1 y Cox6c.