The Combination of Score and Reliability in a Single Com-

- E1A: es un plásmido que contiene el mini-gen adenoviral E1A, habitualmente empleado como reportero de splicing (Cáceres et al., 1994) ya que proporciona un patrón de bandas de mRNA (denominadas 13S, 12S, 11S, 10S y 9S) que resulta de la selección de los distintos sitios de splicing presentes en este mini-gen. Concretamente, los mRNAs 13S, 12S y 9S resultan de la selección alternativa de los tres sitios de splicing 5’, mientras que los 11S y 10S implican el uso de un sitio aceptor de splicing interno 3’.

- FN: es un plásmido reportero de splicing que contiene un mini- gen de fibronectina (Caputi et al., 1994) que dentro del exón EDA (extra domain A) posee la secuencia ESE (exonic-splicing enhancer) que puede reclutar principalmente al factor SR SF2/ASF y también en menor medida a 9G8 (Lavigueur et al., 1993). Cuando estos factores se unen, el fragmento EDA es incluido, detectándose un incremento de los mRNAs conteniendo EDA (EDA+) frente a aquellos que no lo poseen (EDA-). Por tanto, se emplea para el estudio del splicing mediado específicamente por factores SR.

- FNmt: es un plásmido reportero de splicing similar al anterior pero donde la secuencia EDA de unión de proteínas SR está mutada y por tanto estas proteínas no se pueden reclutar.

- pLCS-EDAwt: es un plásmido reportero de la traducción que posee unida a un ORF de luciferasa la secuencia ESE, derivada del exón alternativo EDA del gen de fibronectina, bajo el control del promotor SV40. Como hemos comentado para el plásmido FN, dicha secuencia actúa como sitio de unión para factores SR, que al ser

reclutados producen un aumento de la producción de luciferasa (Sanford et al., 2004).

- pLCS-EDAmt: es un plásmido reportero de la traducción similar al anterior pero donde la secuencia para la unión de proteínas SR está mutada y por tanto estas proteínas no se pueden reclutar. Se utiliza como control para evitar aquellos incrementos de luciferasa que puedan ser debidos a efectos inespecíficos no relacionados con la unión de las proteínas SR (Sanford et al., 2004).

- pGL4.70 (Promega): es un plásmido carente de promotor que contiene una secuencia para luciferasa renilla y que se emplea como control de la eficiencia de transfección.

Todos los plásmidos, a excepción del pGL4.70 que fue cedido por A. Fernández-Álvarez (IBV), fueron obtenidos del laboratorio del Dr. Javier Cáceres. Dichos plásmidos se utilizaron para transformar bacterias competentes de Escherichia Coli JM109 (Promega) por choque térmico (42ºC durante 50 segundos), tras lo cual se sembraron en placas de medio LB-agar con el antibiótico ampicilina para la selección de cada plásmido. Las placas se incubaron toda la noche a 37ºC y al día siguiente se prepararon pre-cultivos líquidos (5 mL de LB con ampicilina) a partir de colonias individuales obtenidas en las placas correspondientes. Tras unas 6 horas de crecimiento, todo el pre- cultivo fue pasado a un cultivo de mayor volumen (150 mL de LB con ampicilina) que se creció durante 12-16 horas a 37ºC con agitación. Tras ese tiempo, se procedió a la extracción de DNA plasmídico empleando el Plasmid Midi Kit (Qiagen) y siguiendo las instrucciones del fabricante. Una vez cuantificado el DNA mediante absorbancia a 260 nm y que el ratio A260/A280 era mayor de 1,8, se comprobó su

integridad y tamaño molecular en un gel de agarosa con tinción con bromuro de etidio.

13.2. Métodos de transfección

El plásmido E1A se transfectó usando el agente Escort V (Sigma) cuando las células SH-SY5Y se encuentran en fase de crecimiento exponencial. Para ello, entre 30 min y 1 hora antes de comenzar la transfección, se cambia el medio a las células por otro DMEM sin FBS ni antibióticos, únicamente suplementado con 2 mM L-glutamina. En un tubo se añaden 300 μL de tampón Escort V y 4 μg del plásmido E1A por cada placa P-60 de células SH. Por otro lado, en otro tubo se añaden 300 μL de tampón Escort V y 10,5 μL del agente Escort V también por cada placa P-60 a transfectar. Tras dejar reposar 5 min a temperatura ambiente, la disolución de DNA se añade a la de agente Escort V. Esperamos 20 min y a continuación se añade gota a gota 600 μL de la mezcla a cada una de las placas. Finalmente, entre 3-4 horas después, se añade al medio FBS al 1%.

Los plásmidos FN, FNmt, pLCS-EDAwt, pLCS-EDAmt y pGL4.70 fueron transfectados usando el agente Lipofectamina2000 (Invitrogen) pues mostró eficiencias de transfección mejores para estos plásmidos que empleando el sistema Escort V anteriormente descrito. Igualmente, las células han de ser transfectadas cuando se encuentran en fase de crecimiento exponencial. Antes de comenzar la transfección, se cambia el medio a las células por otro Opti-MEM (Gibco). En un tubo se añaden 250 μL de medio Opti-MEM y 4 μg del plásmido EDAwt o EDAmt, según corresponda, junto con 1 μg del plásmido pGL4.70. En otro tubo se añaden 250 μL de medio Opti- MEM y 10 μL del agente Lipofectamina2000. Estos volúmenes se emplean por cada pocillo de placa de 6 pocillos a transfectar. Para los

plásmidos FN y FNmt, se empleó 8 μg de DNA y 20 μL de Lipofectamina2000 en volúmenes de 500 μL de medio Opti-MEM, ya que la transfección se hizo en placas P-60. Tras dejar reposar 5 min a temperatura ambiente, la disolución de DNA se añade gota a gota a la de Lipofectamina. Esperamos 30 min y a continuación se añade gota a gota 500 μL de la mezcla a cada una de los pocillos. Finalmente, entre 3-4 horas después, se añade al medio FBS al 1%.

14. ENSAYO DE SPLICING IN VIVO CON EL PLÁSMIDO E1A