C Mel. Implante C Mel. Inyecc. Vacunados V + Mel. Implante V + Mel. Inyecc. * * * * *& *& *& * * * * * *& *& *& *&
Figura 27.- Evolución de los niveles de melatonina, expresados en pg/ml de suero en los diferentes grupos experimentales a lo largo del estudio. Las barras indican la media ± E.E.M.
*p<0,05, comparados con el Día 0 y &p<0,05 comparados con la aplicación de melatonina en
104
Debido a que el estudio estadístico se ha realizado por una vía no paramétrica, las correlaciones existentes entre los títulos de anticuerpos frente a ambos serotipos de D. nodosus y los niveles de melatonina en suero se han determinado mediante el coeficiente de correlación de Rho de Spearman.
En este sentido, existió una correlación positiva muy significativa (p<0,01) entre ambos títulos de anticuerpos en el grupo de animales vacunados. Además, se observó una correlación positiva muy significativa (p<0,01) entre los dos títulos de anticuerpos y los niveles de la hormona en sangre cuando ésta fue administrada junto con la vacuna, bien en forma de implantes o bien en forma de inyección.
105 Estudio de la población linfocitaria
El porcentaje total de linfocitos, expresados como la media ± E.E.M, obtenido el día 0 del estudio de todos los animales utilizados en la experiencia (Tabla 18) fue de 54,90 ± 0,98%. Dicho porcentaje es considerado como el valor fisiológico, ya que el día de inicio de la experiencia aún no se había instaurado ninguno de los tratamientos.
Análisis de los linfocitos T
Estudio de las subpoblaciones de linfocitos T (CD4+ y CD8+).
Los marcadores de superficie de los linfocitos T fueron analizados mediante citometría de flujo utilizando para ello anticuerpos monoclonales frente a CD4 y CD8.
Tabla 18.- Estadísticos descriptivos del porcentaje de linfocitos totales obtenido el día 0 del estudio de todos los animales utilizados.
N Rango Mínimo Máximo Media Desv. típ.
Estadístico Estadístico Estadístico Estadístico Estadístico E.E.M. Estadístico
Linfocitos
106
En nuestro estudio, los valores obtenidos el día de inicio de la experiencia de todos los animales utilizados obtenidos para las poblaciones CD4+ y CD8+ fueron 18,01 ± 6,85% y 6,51 ± 2,51% (expresados como la media ± D.E. del porcentaje de dichas poblaciones con respecto a la población total de linfocitos) respectivamente.
Debido a que no se pudo disponer del anticuerpo frente a CD3 específico de oveja, el cual se expresa en la superficie de la totalidad de los linfocitos T, y a la gran variabilidad observada en los porcentajes de estas poblaciones celulares a lo largo del estudio, los resultados se han expresado como el porcentaje de linfocitos CD4+ y CD8+ referidos a la población total de linfocitos T (CD4 + CD8).
a) Estudio de la subpoblación de linfocitos T CD4+
La media ± E.E.M. del porcentaje de linfocitos T CD4+ obtenido de todos los grupos experimentales el día 0 de la experiencia (Tabla 19), puede ser considerada, en nuestras condiciones experimentales, como el porcentaje fisiológico de linfocitos T CD4+ con respecto al total de linfocitos T en sangre periférica de oveja Merina habiéndose obtenido un valor de 71,79 ± 1,71%.
En la Tabla 20 se muestra el porcentaje de células T CD4+ obtenida en cada uno de los grupos experimentales en los diferentes días de muestreo. Como se puede observar el porcentaje de células T CD4+ permaneció estable a lo largo de todo el estudio en el grupo de los animales control.
Tabla 19.- Estadísticos descriptivos de los porcentajes de linfocitos T CD4+ referidos a la población total de linfocitos T obtenidos el día 0 del experimento en el total de animales utilizados
en el estudio.
N Mediana Mínimo Máximo Media Desv. típ.
Estadístico Estadístico Estadístico Estadístico Estadístico E.E.M. Estadístico
107
Tabla 20.- Porcentajes de expresión de CD4 en la superficie de los linfocitos T en cada uno de los grupos experimentales en los distintos días de muestreo.
Los resultados se expresan como la media ± E.E.M. referidos a la población total de linfocitos T. *p<0,05, comparados con el Día 0.
+p<0,05 comparados con el control de su día. &
p<0,05 comparados con la aplicación de la vacuna.
La administración de melatonina en forma de implantes produjo un aumento significativo de la población CD4+ a los 21 días del comienzo de la experiencia con respecto al día 0 y al grupo control de su mismo día (p<0,05). La administración de la misma cantidad de melatonina en forma de inyección subcutánea aumentó significativamente el porcentaje de células CD4+ el día 21 con respecto al día 0 (p<0,05) y los días 21 y 42 con respecto al grupo control de su mismo día.
La vacunación per se produjo cambios significativos en esta población de linfocitos los días 21 y 42 con respecto al grupo control del mismo día (p<0,05).
Algo similar se observó con la administración conjunta de vacuna y melatonina en forma de implantes aumentando significativamente la población CD4+ los días 21 y 42 respecto al grupo control de su propio día. Además, en este mismo grupo de animales, el porcentaje de linfocitos T CD4+ fue superior de forma significativa con respecto a los animales que sólo habían recibido la vacuna el día 21 del estudio (Fig. 28). % CD4+ D0 D21 D42 D60 D90 D120 Control 66,83 ± 2,19 69,49 ± 1,91 63,11 ± 2,22 65,82 ± 2,13 64,45 ± 2,51 65,72 ± 2,76 Control Mel. Implante 66,21 ± 2,15 82,05 ± 2,38*+ 66,35 ± 1,19 67,47 ± 1,67 66,51 ± 2,56 64,47 ± 2,21 Control Mel. Inyecc. 74,42 ± 2,58 83,98 ± 1,17*+ 74,32 ± 1,98+ 66,03 ± 2,61 74,38 ±1,62 64,44 ± 1,71 Vacunados 72,82 ± 2,18 78,44 ± 1,33+ 70,32 ± 4,36+ 70,97± 0,86 70,57± 1,37 68,34 ± 1,31 V + Mel. Implante 80,50 ±1,90 83,64 ± 1,16+& 74,83 ± 3,26+ 72,69 ± 2,01 70,08 ± 2,54 68,23 ± 0,75 V + Mel. Inyecc. 74,88 ±1,33 81,44 ± 1,40* 71,78 ± 0,79+ 70,62 ±1,12 69,29 ±1,66 69,04 ±1,92
108
Por otro lado, esta población linfocitaria sólo se vio aumentada significativamente el día 21 con respecto al día 0, y el día 42 con respecto al grupo control de su mismo día en el grupo de animales a los que se les administró la vacuna y la melatonina en forma de solución inyectable.
Figura 28.- Evolución del porcentaje de la población de linfocitos T CD4+ en sangre periférica de los distintos grupos experimentales a lo largo de la experiencia. Las barras indican la media
± E.E.M del porcentaje de linfocitos T CD4+ referido a la población total de linfocitos T.
*p<0,05, comparados con el Día 0, +p<0,05 comparados con el control de su día y &p<0,05
comparados con la aplicación de la vacuna.
b) Estudio de la subpoblación de linfocitos T CD8+
Del mismo modo que en el caso anterior, la media ± E.E.M. del porcentaje de linfocitos T CD8+, obtenida de todos los grupos experimentales el día 0 del estudio puede ser considerada como el valor fisiológico de linfocitos T CD8+, con respecto a la población total de linfocitos T, en sangre periférica de oveja y en nuestras condiciones experimentales resultó ser de 27,36 ± 2,18%. En la Tabla 21 se pueden observar los estadísticos descriptivos correspondientes.
109
El porcentaje de la población de linfocitos T que expresaron en su membrana el marcador de superficie CD8 en cada uno de los grupos experimentales a lo largo de la experiencia se muestra en la Tabla 22, y se puede observar que al igual que en el caso anterior, el grupo de animales control mostró unos valores estables a lo largo del estudio.
Tabla 22.- Porcentajes de expresión de CD8 en la superficie de los linfocitos T en cada uno de los grupos experimentales en los distintos días de muestreo. Los resultados se expresan como la media ±
E.E.M. referidos a la población total de linfocitos T.
Los resultados se expresan como la media ± E.E.M. referidos a la población total de linfocitos T. *p<0,05, comparados con el Día 0.
+p<0,05 comparados con el control de su día.
En general, se observa una disminución generalizada significativa de la población CD8+ en todos los grupos experimentales tratados, a los 21 días del inicio de la experiencia con respecto al día 0 y al control de su mismo día, que se corresponde con el aumento general de la población CD4+ ese mismo día (Fig. 29). No se
Tabla 21.- Estadísticos descriptivos del porcentaje de linfocitos T CD8+ referido a la población total de linfocitos T obtenidos el día 0 de la experiencia en el total de animales utilizados en el
estudio.
N Mediana Mínimo Máximo Media Desv. típ.
Estadístico Estadístico Estadístico Estadístico Estadístico E.E.M. Estadístico
% CD8+ 56 26,75 19,52 33,68 27,3633 2,18239 5,34574 % CD8+ D0 D21 D42 D60 D90 D120 Control 33,12 ± 2,19 30,51± 1,91 36,88 ± 2,22 34,17 ± 2,13 35,54 ± 2,51 34,27 ± 2,76 Control Mel. Implante 33,78 ± 2,15 17,94 ± 2,38*+ 33,02 ± 1,19 32,53 ± 1,77 33,48 ± 2,56 35,52 ± 2,21 Control Mel. Inyecc. 25,57 ± 2,58 16,01± 1,17*+ 25,67 ± 1,98 33,96 ± 2,61 25,61± 1,62 31,55 ± 1,71 Vacunados 27,18 ± 2,18 21,55 ± 1,33*+ 29,67 ± 4,36 29,02 ± 0,86 29,42 ± 1,37 31,65 ± 1,31 V + Mel. Implante 19,50 ± 1,90 16,35 ± 1,16+ 25,16 ± 3,26 27,30 ± 2,01 29,91 ± 2,54 31,76 ± 0,75 V + Mel. Inyecc. 25,11 ± 1,34 18,55 ± 1,40*+ 28,21 ± 0,79 29,37 ± 1,12 30,70 ± 1,66 30,95 ± 1,92
110
observaron diferencias significativas en la distribución de la población CD8+ de ninguno de los grupos experimentales a lo largo del resto del experimento.
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 0 21 42 60 90 120 % Lin fo cit os T C D8 +
Días del estudio