Comparison with Models

Un método de PCR debe contar con características propias para ser utilizado y recomendado en un Laboratorio de Diagnóstico y de Control de Calidad. Inicialmente, la PCR debe responder exclusivamente a las características del analito de interés, esto se llama especificidad. Para los métodos de detección de OGM, esta característica es de vital importancia debido al amplio universo de posibilidades de anillamiento y posterior amplificación en el ADN de una planta. Si el método no es específico, genera falsos positivos lo cual representa un baja o poca confiabilidad en los resultados.

Otra característica importante es la Sensibilidad, la cual corresponde a la respuesta a una baja concentración de un analito (Griffiths K. et. al., 2004). Técnicamente, la medición de

la sensibilidad se fundamenta en la determinación del Límite de Detección (LOD por sus siglas en inglés, Limit of Detection) y del Límite de Cuantificación (LOQ por sus siglas en

ingles Limit of Quantification). El Límite de Detección es la menor cantidad o

concentración de un analito el cual puede ser detectado, pero no necesariamente cuantificado (ENGL, 2011b). Por su parte, el Límite de Cuantificación es la menor cantidad o concentración de un analito que puede ser cuantificado con un nivel aceptado de

precisión y veracidad (ENGL, 2011b). Para el caso de los métodos de detección de OGM, los métodos deben ser suficientemente sensibles para poder detectar o cuantificar en función de los umbrales dispuestos en la legislación de cada país.

Por su parte, la exactitud es la proximidad de la concordancia entre una medición y el valor verdadero, lo cual corresponde a una relación entre la precisión y la veracidad del método. De manera más clara, la precisión es la cercanía entre los valores obtenidos por mediciones repetidas de una muestra bajo las mismas condiciones específicas, y la veracidad es la cercanía entre el promedio de las mediciones y un valor de referencia (Trapman S., et. al.,

2009). Puntualmente, debido a que los métodos de detección de OGM son utilizados para la toma de decisiones comerciales y legales, y adicionalmente la matriz de extracción genera una incertidumbre considerable a la medición, los Laboratorios de Referencia han desarrollado estudios inter-laboratorios muy fuertes para determinar la variación permitida, dando como resultado ±25% específicamente para la normalización de la curvas de cuantificación (ENGL, 2011b).

Adicionalmente, debido a que no se puede garantizar que todos los laboratorios utilicen los mismos equipos, los mismos reactivos y que el montaje de la técnica sea totalmente igual entre analistas, es necesario determinar que tanto se puede ver afectado el método analítico con pequeñas variaciones de algunos parámetros (Trapman S., et. al., 2009), esta

característica se denomina robustez. Para los métodos de detección de OGM, se cuenta con una particularidad la cual favorece la implementación de estas técnicas. Las fuentes de las cuales se toman los métodos, corresponden en algunos casos a artículos científicos, los cuales se validan el método de acuerdo a normas técnicas reconocidas; sin embargo, principalmente las fuentes de métodos validados para la detección de OGM, son informes de validación redes internacionales de laboratorios, los cuales no utilizan los mismos equipos ni reactivos, requiere la participación de al menos 100 laboratorios lo que representa 100 analistas diferentes, generando un método altamente robusto.

Las condiciones de Reproducibilidad son evaluadas de acuerdo a la Desviación Relativa Estándar de la reproducibilidad (RSDr). Se refiere a la evaluación de la amplificación utilizando el mismo método, en el mismo laboratorio, con el mismo equipo y analista y con algún intervalo de tiempo. En este caso, es importante aclarar, que en la validación inicial de la técnica se determinó la robustez del método, con otras condiciones diferentes a las del laboratorio que va a realizar una verificación, lo cual garantiza directamente la poca variabilidad de la medición en función de las pequeñas variaciones en el método.

Eficiencia de la PCR es la magnitud por la cual se puede evidenciar la tasa de amplificación de la PCR. Teóricamente a partir de una copia de la cadena a amplificar, se generan dos copias y así ciclo a ciclo (n) incrementándose exponencialmente, en la cual la cantidad de producto esperada (P) se encuentra en función de la cantidad de copias iniciales de tal manera que matemáticamente: P = (2)n T. Sin embargo, la PCR no es 100% eficiente. Existen factores limitantes como la concentración de primers, la actividad de la Taq ADN

Polimerasa, la concentración de ADN de la muestra, la difusión térmica del termociclador, el anillamiento inespecífico de primers (mispriming), dimerización de primers, la eficiencia

de la solución tampón, estructura secundaria y tamaño del amplicón (Walker J. y Gingold E, 1997). La amplificación perfecta tiene una pendiente de -3.3 al 100%. Sin embargo, existe un criterio de aceptación de la eficiencia de la amplificación para métodos cualitativos y cuantitativos por medio del valor de la pendiente de la curva estándar. Este valor se ubica en el rango -3.6 a -3.1 lo cual corresponde a una eficiencia de la amplificación de 90-100% (ENGL, 2011b). Para el cálculo de la Eficiencia de la reacción de PCR se utiliza la siguiente ecuación (ENGL, 2011b):

El Rango dinámico es el rango de concentraciones en la cual el método se comporta de manera lineal con un nivel de precisión y veracidad aceptable (ENGL, 2011b). Este rango dinámico son las mediciones límite en las cuales el método puede relacionar directamente concentraciones específicas. Si una medición genera un resultado por encima o por debajo de ese rango dinámico, es necesario informar que la concentración efectivamente se encuentra por encima o por debajo de esos límites sin necesidad de extrapolar la concentración, esto debido a que no se puede garantizar la linealidad de la medición.

R2 es el coeficiente de determinación que se calcula como el cuadrado del coeficiente de correlación a partir de la regresión lineal de una curva patrón (ENGL, 2011b). Este valor representa la linealidad de la medición y representa indirectamente los errores sistemáticos y relativos de la técnica.