Comparisons

3.3.1. Transformación

La transformación es un procedimiento por el cual se introduce material genético exógeno a una bacteria. Este proceso depende del estado de competencia bacteriano, el cual se refiere a su capacidad de incorporar material genético. La transformación se puede llevar a cabo de dos formas: química y física.

La transformación química implica la exposición del cultivo bacteriano en fase exponencial a una solución de CaCl2 100 mM a 0°C el cual le proporciona a la bacteria cationes divalentes que forman un complejo DNA-calcio que se adhiere a la pared celular y que es DNasa resistente. Este complejo puede deshacerse poniendo las células a 42°C en un baño durante 90 segundos (choque térmico) en donde se formarán poros en la membrana por donde se introducirá el DNA. Después de poco tiempo de crecimiento en medio rico, las células se recuperan y los genes transformantes se expresan, de manera que se pueden aislar las colonias transformantes en medio selectivo.

La transformación física también conocida como electroporación implica el uso de cargas eléctricas que desestabilizan la membrana bacteriana e inducen la formación de poros a través de los cuales las moléculas de DNA pueden pasar. El cierre de los poros formados parece ser un proceso estocástico que puede ser

retardado manteniendo las células a baja temperatura. Este método es más fácil, eficiente y reproducible. Para la electroporación se utilizó un electroporador GenePulser XCell de BioRad y cubetas 0.2 cm.

3.3.1.1. Transformación de E. coli

Preparación de células competentes

Procedimiento: Día 1

• Preparar un cultivo de la cepa de E. coli DH5α en medio LB e incubar 16 horas

a 37°C con agitación. Día 2

• A partir del cultivo de noche hacer una resiembra 1/100 en 100 mL de medio LB e incubar a 37°C hasta alcanzar una OD550 de 0.5-0.6.

• Poner el cultivo 10 min en hielo.

• Centrifugar el cultivo 10 min a 3000 g a 4°C en tubos estériles.

• Eliminar el sobrenadante y resuspenderlo en CaCl2 0.1 M frio (20 mL por cada 100 mL de cultivo) en condiciones de esterilidad.

• Poner el cultivo en hielo durante 30 min. • Centrifugar durante 10 min a 3000 g a 4°C.

• Desechar el sobrenadante y resuspender en CaCl2 (4 mL por cada 100 mL de cultivo) con mucho cuidado, ya que en este punto las células son extremadamente frágiles.

• Mezclar con glicerol a una concentración final de 15% (1.5 mL de glicerol 50% por cada 100 mL de cultivo).

• Alicuotar en tubos eppendorf (100, 200 y 500 µL por tubo) y congelar con hielo seco, guardar a -80C.

Transformación

Procedimiento:

• Mezclar 100µL de células competentes y 10-100 ng de DNA plasmídico e incubar durante 30 min en hielo.

• Poner la mezcla a 42°C durante un minuto y medio. • Añadir 800µL de medio LB.

• Incubar la mezcla a 37°C durante una hora.

• Sembrar en placas y suplementos requeridos durante 12-18 h a 37°C.

Soluciones

CaCl2 100 mM

CaCl2 1.47 g

Disolver en 80 mL de agua destilada y ajustar el volumen a 100 mL; esterilizar en autoclave a 121°C durante 15 min. Almacenar a temperatura ambiente.

3.3.1.2. Electroporación de Mycobacterium

Preparación de células electrocompetentes de M. smegmatis

La preparación de células electrocompetentes se realizó en condiciones de esterilidad y en hielo.

Procedimiento:

• Inocular una colonia de M. smegmatis en 10 mL de medio Middlebrook 7H9+Tween e incubar durante 2 o 3 días a 37°C en agitación.

• Hacer una resiembra 1/100 en 100 mL de medio Middlebrook 7H9 e incubar a 37°C en agitación hasta una OD600 de 0.8-1.0 (16-20h aprox).

• Poner en hielo durante 1 hora y media.

• Centrifugar en tubos estériles durante 10 min a 3000g a 4°C.

• Desechar el sobrenadante y resuspender el pellet en 50 mL de glicerol al 10% (v/v) frio.

• Centrifugar durante 10 min a 3000 g a 4°C.

• Desechar el sobrenadante y resuspender el pellet en 1 mL de glicerol al 10% (v/v) frio.

• Alicuotar en tubos eppendorf (80 µL por tubo) y congelar con hielo seco, guardar a -80C.

Electroporación de M. smegmatis

Procedimiento:

• Añadir 80µL de glicerol al 10% (v/v) y el DNA (<5 µL, no añadir cantidades superiores por que puede afectar la conductividad de la muestra).

• Poner la mezcla en hielo durante 10 min con el fin de que el DNA sea pre absorbido.

• Mantener las cubetas de electroporación en hielo durante 15 min y posteriormente secarlas muy bien.

• Homogenizar las células y transferirlas a la cubeta de electroporación.

• Someterlas a un pulso de 2.5 kV, 1000 Ω, 25 µF y constantes de tiempo de 15 ms a 25 ms.

• Añadir inmediatamente 1 mL de medio Middlebrook 7H9, resuspender con mucho cuidado y transferirlas a un tubo estéril.

• Incubar a 37°C en agitación a 200 rpm durante 3-4 horas.

• Resuspender y sembrar en placas de medio Middlebrook 7H10 suplementados con los antibióticos adecuados si se requiere.

• Incubar durante 3-4 días a 37°C.

Preparación de células electrocompetentes de M. tuberculosis

El procedimiento es similar al usado para M. smegmatis con la diferencia de que toda la preparación se hace a temperatura ambiente:

• Inocular una colonia de M. tuberculosis o 100 µL de un cultivo crecido en 10 mL de medio Middlebrook 7H9 e incubar durante 2 o 3 semanas a 37°C.

• Hacer una resiembra 1/100 en 100 mL de medio Middlebrook 7H9 e incubar a 37°C durante una semana. Asegurarse que se encuentra en fase exponencial midiendo la OD600.

• Centrifugar en tubos estériles durante 10 min a 3000 g a 15°C-20°C.

• Desechar el sobrenadante y resuspender el pellet en 50 mL de glicerol al 10% (v/v).

• Centrifugar durante 10 min a 3000 g a 15°C-20°C.

• Desechar el sobrenadante y resuspender el pellet en 25 mL de glicerol al 10% (v/v).

• Centrifugar durante 10 min a 3000 g a 15°C-20°C.

• Desechar el sobrenadante y resuspender el pellet en 12 mL de glicerol al 10% (v/v).

• Desechar el sobrenadante y resuspender el pellet en 1 mL de glicerol al 10% (v/v).

• Alicuotar en tubos eppendorf (400 µL por tubo) y electroporar inmediatamente.

Electroporación de M. tuberculosis

• Mezclar las células electrocompetentes con el DNA (<5 µL) y mezclar. • Incubar la mezcla durante 10 min a temperatura ambiente.

• Homogenizar las células y transferirlas a la cubeta de electroporación.

• Someterlas a un pulso de 2.5 kV, 1000 Ω, 25 µF y constantes de tiempo de 15 ms a 25 ms (electroporador GenePulser XCell™, BioRad).

• Resuspender las células en 1 mL de medio Middlebrook 7H9 y transferirlas a un tubo estéril que contenga 2 mL de medio Middlebrook 7H9.

• Incubar durante 12h-24 horas a 37°C.

• Resuspender y sembrar en placas de medio Middlebrook 7H10 suplementados con el antibiótico adecuado si se requiere. La siembra se puede hacer con asas de Digralsky desechables estériles o con bolas de vidrio de 0.5 cm de diámetro (Sigma) estériles extendiendo el líquido por rotación de la placa. Las bolas se desinfectan con lejía y autoclave y posteriormente se lavan de nuevo y se esterilizan para su reutilización.

• Incubar durante 3-4 semanas a 37°C.