Una vez estudiados los extractos etanólicos de isoflavonas de soja en distintas matrices se estudió la estabilidad del extracto etanólico liofilizado de la proteína de soja. Se eligió esta matriz debido al mayor número de isoflavonas presentes en ella. La preparación de los extractos se describe en el apartado 3.3.2, siguiendo el esquema de la figura 26 para su almacenamiento.
El perfil cromatográfico del extracto liofilizado de proteína de soja inicial (0 meses) obtenido mediante análisis por HPLC-DAD a la longitud de onda de 254nm se muestra en la figura 54.
Figura 54. Cromatograma del extracto liofilizado de isoflavonas de proteína de soja.
La concentración a tiempo cero de las isoflavonas detectadas en este extracto de referencia y sus espectros UV que permiten identificarlas se muestran en la tabla 48 y la figura 55 respectivamente.
Tabla 38. Concentración de las isoflavonas en el extracto liofilizado inicial de la muestra de proteína de soja y su desviación estándar (sd). mg/Kg±sd
Isoflavona Concentración Di 323 ± 26,4 Gly 26,9 ± 4,10 Gi 340 ± 27,0 MDi 226 ± 16,3 MGly 10,5 ± 1,51 MGi 273 ± 21,4 ADi 285 ± 19,4 AGly 14,0 ± 1,61 De 14,5 ± 1,13 Gle 23,9 ± 1,24 AGi 271 ± 22,1 Ge 19,9 ± 0,87
Resultados y discusión
Para este extracto las isoflavonas mayoritarias siguen siendo los glucósidos (38%), seguido por los derivados acetiles (31%) y los maloniles (28%). Las agluconas son las formas isoflavónicas minoritarias (3%). Para cualquiera de las isoflavonas estudiadas sus concentraciones son menores a las encontradas en los extractos etanólicos de proteína de soja vistas en el apartado anterior.
Figura 55. Espectros UV de las isoflavonas detectadas en el extracto liofilizado de proteína de soja.
Como ocurría en los extractos etanólicos de la proteína de soja, las concentraciones de la acetil glicina, la malonil glicitina y las tres agluconas son bajas y próximas a los límites de cuantificación en la muestra, lo que se tiene que tener en cuenta a la hora de sacar conclusiones con los estudios estadísticos realizados.
Como hemos visto en la tabla 38, los valores obtenidos al analizar el extracto liofilizado inicial son menores que los encontrados en el extracto etanólico (tabla 29), por lo que antes de la realización del estudio de almacenamiento de estos extractos liofilizados se estudió el efecto de la liofilización en dicho extracto. Para ello se realizó el estudio de recuperación de compuestos en los extractos tras liofilizarlos para comprobar si existen pérdidas debidas a la liofilización.
En la figura 56 se muestran superpuestos los cromatogramas del extracto etanólico de proteína de soja (negro) y el mismo extracto liofilizado (rojo). No se observan pérdidas completas de ninguna de las isoflavonas detectadas, aunque sí que se observa cierta disminución en todos los picos, mayor en los picos más lábiles, como son los derivados malonil y acetil de las isoflavonas. Las magnitudes de estas
Figura 56. Cromatogramas superpuestos a 254 nm del extracto etanólico (en negro) y el extracto liofilizado (en rojo) de proteína de soja.
Tabla 39. Recuperación (% Rec.) de las isoflavonas detectadas en los extractos de proteína de soja al someterse al proceso de liofilización y su desviación estándar relativa (RSD), ambas en porcentaje (% RSD) Isoflavona % Rec. % RSD Di 93,2 6,79 Gly 87,2 8,56 Gi 95,9 4,08 MDi 93,6 7,95 MGly 82,9 5,41 MGi 92,8 7,77 ADi 98,0 8,26 AGly 86,3 7,86 De 100,8 7,36 Gle 104,7 1,54 AGi 96,5 1,37 Ge 93,2 8,06
Sólo en los casos de los derivados de la isoflavona glicitina se obtienen recuperaciones inferiores al 90%, algo que como ya hemos visto durante el estudio de la estabilidad con los extractos etanólicos son las isoflavonas más lábiles, pero aun así su recuperación no es inferior al 85%; por lo que se puede trabajar con estos extractos sabiendo que inicialmente hay una variación menor del 15% en algunas isoflavonas desde el principio del estudio respecto del extracto líquido de partida.
La resolución cromatográfica que se consigue entre los derivados malonil y acetil de las isoflavonas genistina y daidzina, respectivamente, es baja, al igual que ocurría en el extracto etanólico de proteína de soja (figura 42 y figura 53) por tanto, como anteriormente, se tendrá en cuenta este hecho a la hora de discutir los resultados. A medida que se van produciendo las interconversiones entre las isoflavonas las concentraciones de estos derivados van disminuyendo y debido a su escasa resolución la precisión en su cuantificación puede disminuir. En todo momento
Resultados y discusión
se ha podido proceder a la cuantificación de estas isoflavonas en el extracto etanólico de proteína de soja.
Sin embargo en el caso de los extractos liofilizados, debido a que se realizaron con posterioridad al estudio de los extractos etanólicos y con la misma columna cromatográfica, se observó que el envejecimiento de la columna, provoca una mayor pérdida de resolución entre estas dos isoflavonas a partir de los dos meses de almacenamiento, tal y como se observa en la figura 57, lo que hace que sea imposible estudiar su estabilidad sin cometer errores significativos en su cuantificación.
Figura 57. Cromatograma de isoflavonas del extracto liofilizado de proteína de soja a los dos meses de almacenamiento. En rojo se muestran las dos isoflavonas que se van a ignorar en el estudio por no ser capaces de resolver ambos picos cromatográficos.
Por lo tanto en este caso las isoflavonas a estudiar son 10: tres agluconas con sus tres derivados glucósidos, los derivados malonil daidzina y malonil glicitina, y los derivados acetil glicitina y acetil genistina.
Aunque no ha sido posible su cuantificación, se observa durante el estudio de almacenamiento que la acetil daidzina se comporta del mismo modo que en los extractos etanólicos de proteína de soja puesto que se degrada desde el principio del estudio, hasta que desaparece al final del mismo. En cambio, la malonil genistina se degrada en menor medida, tal y como se observa en el extracto etanólico de proteína de soja.