Computation of Economic Value Added

Los anteriores estudios realizados mediante transcriptómica e hibridación Northern de la expresión de genes relacionados con la respuesta a la infección han indicado la relevancia del ET en la regulación de la expresión de algunos de los genes implicados en este proceso. Para profundizar más en esta cuestión, primeramente se hizo un estudio sobre el comportamiento debido a la herida o como respuesta a la infección, de aquellos genes implicados en la síntesis de ET.

Ya se había observado cómo la infección de frutos de mandarina ‘Clemenules’ por el patógeno P. digitatum, supone la inducción en la expresión de al menos tres de los genes implicados en los dos últimos pasos de la biosíntesis de ET: CsACS1, CsACS2 y CsACO (Figura 17). Por otro lado, al estudiar la identidad de los genes pertenecientes a las bibliotecas de cDNA utilizadas durante esta tesis (RindPdig24, PostharvP1 y RindPdigS) se encontraron genes que forman parte de las rutas de síntesis de ET a partir de metionina, ciclo de la metionina y ciclo de SAM. El estudio mediante hibridación Northern permitió observar una regulación diferencial de estos genes por el propio ET y en respuesta a la infección (Figura 45).

Tanto el gen que codifica una cistationina sintasa (CBS) como el de una adenosil homocisteinasa (AHCY) codifican proteínas que forman parte de rutas que proveen de homocisteína, precursor de la síntesis de metionina (Figura 35). El gen AHCY tiene una inducción baja en respuesta a herida y algo mayor en infección, con un pico de expresión a las 16 horas (Figura 45). La metionina sintasa (MetH) es la enzima que sintetiza metionina a partir de homocisteína y adenosina. La infección induce, aunque de manera bastante leve, la expresión del gen que codifica esta enzima, el cual muestra inducción en respuesta a herida después de las 24 h. Según muestran los resultados de hibridación, su expresión no está inducida por la aplicación de ET. La S-adenosil-L-metionina sintetasa (SAMS) cataliza la síntesis de S-adenosil-L-metionina a partir de metionina. Este gen tiene unos niveles de expresión muy bajos pero se aprecia una leve inducción por la infección a partir de las 16 horas. Su expresión tampoco está inducida por la aplicación de ET. Por último, la S- adenosil-L-metionina descarboxilasa (SAMDC) dirige SAM hacia el

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metabolismo de las poliaminas (Kakkar y Sawhney, 2002). El gen que codifica esta enzima, sin embargo, está inducido por el ET, la herida y la infección, antes de las 24 horas.

El estudio del efecto de los tratamientos con aire, ET y 1-MCP aporta información sobre el efecto autorregulador del ET sobre su propia síntesis inducida por la herida o la infección, y, además, sobre la regulación por ET de la expresión de diferentes genes. Los estudios de hibridación Northern se han llevado a cabo analizando tres experimentos de pre-tratamientos de frutos ‘Clemenules’, realizados durante las campañas 03/04 y 04/05 (Figura 46). Los genes UGT, CBS, L- asparaginasa (LAS) y pectato liasa (PL) son ejemplos de genes cuya expresión se induce con el tratamiento con ET. POX y CYP79A1 tienen el comportamiento opuesto, reprimiéndose su expresión por el tratamiento con ET. En general, el patrón de expresión de un gen se mantiene, variando los niveles de expresión, entre réplicas.

Figura 45. Análisis Northern de genes relacionados con la síntesis de ET y el

metabolismo de la S-adenosilmetionina (SAM). El análisis se realizó sobre filtros con RNA de frutos Clemenules. (véase detalles en el pie de la Figura 41). Las sondas utilizadas para la hibridación se sintetizaron a partir de genes con homología con: S-adenosilmetionina descarboxilasa (SAMDC, C06015C04), metionina sintasa (MetH, N14F01), S-adenosilmetionina sintetasa (SAMS, C06010A02), adenosilhomocisteinasa (AHCY, C06004F08) y cistationina sintasa (CBS, C06018F11).

Sin embargo, en algunos casos las diferencias entre réplicas biológicas son bastante grandes. El caso más llamativo es el del gen que codifica una dicianina (DCN), que solamente se indujo por ET en el experimento 1, pero no mostró inducción en los otros dos. De hecho, es este experimento el que presentó las diferencias más significativas cuando se comparó con los otros dos. Los genes POX y CYP79A1 muestran un patrón general de represión por ET; sin embargo, en el experimento 1 los niveles de expresión de ambos genes después de cada tratamiento son muy parecidos. Los genes CBS y LAS muestran unos patrones de

Figura 46. Análisis Northern de genes con expresión diferencial en respuesta

a ET en frutos Clemenules recién recogidos del campo (0), pretratados con aire (A), ET (10 ppm) (E) y 1-MCP (500 ppb) (M) en tres réplicas diferentes. (véase detalles en el pie de la Figura 41). Las sondas utilizadas para la hibridación se sintetizaron a partir de genes con homología con: peroxidasa (POX, C06015A10), UDP- glucosil transferasa (UGT, C06020A02), citocromo P450 79A1 (CYP79A1, N04D08), cistationina sintasa (CBS, C06018F11), dicianina (DCN, N11B04), L-asparaginasa (LAS, C06014A10), pectato liasa (PL, C06024G01). Los valores de pretratamientos están referidos al valor del control sin pretratar en la campaña 2 (Pretratados 2, 0).

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expresión de inducción por el tratamiento con ET, con cierto nivel de expresión en las muestras sin pretratamiento para las réplicas 2 y 3, pero no para la réplica 1.

Los resultados de expresión génica mediante la hibridación de macro- y micromatrices nos han permitido descubrir una serie de genes con inducción o represión en cada una de las condiciones de estudio o por combinación de ellas mediante la elaboración de diagramas de Venn (Figura 23 y Figura 33). Estos resultados no reflejan, sin embargo, la presencia de genes con patrones de expresión más complejos, con inducción en alguna condición y represión en otras. En este sentido, habría que destacar la presencia de genes relacionados con la respuesta del fruto a la infección que muestran diferentes comportamientos en respuesta al tratamiento con ET. Basándonos en estas respuestas, se pueden establecer cuatro patrones de comportamiento de los genes según la respuesta conjunta a la infección y al tratamiento con ET: genes inducidos tanto por el tratamiento con ET como por la infección (Patrón 1), genes que se inducen por el tratamiento con ET, pero que no se inducen por la infección (Patrón 2), genes que no se inducen por el ET, pero que sí se inducen durante el proceso de infección (Patrón 3), y, por último, genes que no se inducen con ET ni en respuesta a la infección (Patrón 4).

A partir de los resultados de hibridación de las macro- y micromatrices, se seleccionaron una serie de genes que presentaban un perfil de expresión diferencial en respuesta a herida, infección y ET. La hibridación Northern con sondas obtenidas a partir de estos genes ha permitido confirmar la expresión diferencial de cada uno de ellos. En la Figura 47 y la Figura 48 se muestran ejemplos de genes con cada uno de los patrones de expresión mencionados, tanto en naranjas ‘Navelate’, como en mandarina ‘Clemenules’, respectivamente.

En el caso de naranjas ‘Navelate’ (Figura 47), los genes que codifican una proteína celular implicada en apoptosis o “cellular apoptosis susceptibility protein” (CAS) y una EMB tienen un perfil de expresión muy semejante, con inducción por ET y por infección, y unos niveles de inducción más bajos en respuesta a herida. El gen que codifica una cistinosina (CTNS) y el que codifica una ciclasa (CFP) tienen inducción por

Figura 47. Análisis Northern de genes de naranjas ‘Navelate’ con expresión

diferencial en respuesta a la infección y al tratamiento con ET siguiendo cuatro tipos de patrones: genes inducidos tanto por el tratamiento con ET como por la infección (Patrón 1), genes que se inducen por el tratamiento por ET pero que no responden a la infección (Patrón 2), genes que no responden al ET pero que se inducen en respuesta a la infección (Patrón 3), y genes que no responden ni al tratamiento con ET ni como respuesta a la infección (Patrón 4). Se utilizaron filtros con RNA de frutos ‘Navelate’. (véase detalles en el pie de la Figura 41). Las sondas utilizadas para la hibridación se sintetizaron a partir de genes con homología con: proteína celular implicada en apoptosis (CAS, N13E10), Proteína abundante embrionaria (EMB, N04D11), Ecaroteno hidroxilasa (BCH, N03B01), cistinosina (CTNS, N17G03), ciclasa (CFP, N06H10), P0468B07.6 (P-21, N03A05), sin proteína semejante (P-02, N02H01), acuaporina (AQP, N13F07).

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ET y, sin embargo, sus niveles de expresión por infección no están inducidos respecto a los frutos control sin tratamiento. El gen BCH que codifica una Ecaroteno hidroxilasa muestra también inducción de la expresión por ET, pero su expresión durante la infección está reprimida. Los genes que codifican una proteína con homología a P0468B07.6 (Contig P-21) y una proteína sin homología en A. thaliana o “No blast

match” (Contig P-02) muestran altos niveles de expresión durante la

infección, pero no responden al tratamiento con ET. Finalmente, el gen de la acuaporina (AQP) sufre una represión de su expresión en respuesta al tratamiento con ET y también en respuesta a la infección a partir de las 48 horas después de la inoculación.

En el caso de mandarinas ‘Clemenules’ también se han encontrado genes que cumplen los patrones de expresión que hemos descrito (Figura

Figura 48. Análisis Northern de genes de mandarinas ‘Clemenules’ con

expresión diferencial a la infección y al tratamiento con ET siguiendo cuatro tipos de patrones: genes inducidos tanto por el tratamiento con ET como por la infección (Patrón 1), genes que se inducen por el tratamiento por ET pero que no responden a la infección (Patrón 2), genes que no responden al ET pero que se inducen durante el proceso de infección (Patrón 3), y genes que no responden ni al tratamiento con ET ni como respuesta a la infección (Patrón 4). Se utilizaron filtros con RNA de frutos ‘Clemenules’. (véase detalles en el pie de la Figura 41). Las sondas utilizadas para la hibridación se sintetizaron a partir de genes con homología con: L-asparaginasa (LAS, C06014A10), pectato liasa (PL, C06024G01), ciclofilina (CyP, C06022E12), P0468B07.6 (P-21, N03A05) y acuaporina (AQP, N13F07).

48). El gen que codifica una L-asparaginasa (LAS) sufre una leve inducción de la expresión en respuesta a herida, que aumenta considerablemente por la infección, y también se induce significativamente por el tratamiento con ET. El gen que codifica una pectato liasa (PL) muestra una inducción como respuesta al ET, pero no parece estar implicada en las respuestas a la herida ni a la infección. El gen que codifica una ciclofilina (CyP) y una P0468B07.6 (P-21) son dos genes que no responden al tratamiento con ET y, sin embargo, se inducen claramente durante la infección, siendo su respuesta a la herida baja o muy baja. Un gen que codifica acuaporina (AQP) en naranjas también mostró represión por ET y por infección, apreciándose disminución de la expresión a las 24 horas.

5.3. Comparación de la respuesta de naranjas ‘Navelate’ a la