Conclusion – flexibilisation of limits and accumulation by restoration?

Para evitar la degradación del RNA, todo el material utilizado fue libre de RNasas. Las soluciones preparadas se trataron con DEPC (DiEtil PiroCarbonato; Sigma) siguiendo las instrucciones del fabricante. El material de vidrio se trató a 150ºC durante un mínimo de 3 h y todo el material fungible utilizado estaba libre de RNasas.

3.4.1. Extracción de RNA

Las extracciones de RNA se realizaron a partir de los sedimentos de 10 ml de un cultivo en la fase de crecimiento exponencial (DO600 de 0,6) del microorganismo a estudiar en

las condiciones adecuadas. Los sedimentos se resuspendieron en una solución de TE con lisozima (10 mg/ml; Sigma) y se incubaron 10 min a 37ºC. Para la extracción de RNA se utilizó el RNeasy Mini Kit (Qiagen), siguiendo las instrucciones del fabricante. La eliminación de los restos de DNA se llevó a cabo durante el tratamiento mediante la

RNase-free DNase (Qiagen) y posteriormente mediante la DNase Turbo (Ambion),

siguiendo las instrucciones del fabricante. Para la eliminación de los restos de proteínas y de sales tras el tratamiento con la DNasa, los RNAs se purificaron con una RNeasy

mini column (clean up), siguiendo las instrucciones del fabricante (Qiagen). La

concentración y la integridad del RNA se determinaron mediante la absorbancia a 260 nm (A260) y la electroforesis en geles de agarosa al 1%, respectivamente. En todos los

casos, la ausencia de DNA en las muestras de RNA se determinó por PCR.

3.4.2. RT-PCR

Los análisis de RT-PCR (Reverse Transcription-Polymerse Chain Reaction) se realizaron mediante el Titan One Tube RT-PCR System (Roche). Esta técnica permite un análisis rápido, sensible y reproducible del RNA, realizando la transcripción inversa del RNA generando cDNA (DNA complementario) y la posterior amplificación del cDNA mediante PCR. Las enzimas Expand High Fidelity PCR System y AMV Reverse

Transcriptase (Roche) permiten la realización de ambas reacciones en un solo paso.

utilizando oligonucleótidos internos de la región codificante de los genes de estudio (Tabla 4).

Tras unir las dos mezclas se añadieron 100 ng del RNA de estudio. Para la realización de la retrotranscripción, el programa utilizado del termociclador incluyó un paso previo de 30 min a 50ºC. Posteriormente se utilizó un programa normal de PCR.

3.4.3. RT-PCR a tiempo real

La RT-PCR a tiempo real se utiliza para cuantificar la expresión génica mediante el análisis del RNA. En este estudio se ha utilizado el LightCycler RNA Master SYBR

Green I (Roche) usando el LightCycler Instrument (Roche).

El LightCycler-RNA Master SYBR Green I realiza una amplificación a alta temperatura, utilizando la Tth DNA polimerasa combinada con aptámeros. Estas moléculas son oligonucleótidos que se unen al centro activo de la polimerasa impidiendo la unión de otros ácidos nucleicos a temperaturas inferiores a la óptima para la Tth polimerasa. Cuando se aumenta la temperatura, los aptámeros son liberados por la enzima y se puede iniciar la transcripción inversa y la subsiguiente amplificación. Esta polimerasa es termoestable, tiene actividad transcriptasa inversa dependiente de RNA y actividad DNA polimerasa dependiente de DNA, por lo que permite la realización de la RT y de la PCR en una sola reacción.

El SYBR Green I es un fluoróforo específico para el DNA de doble cadena. Está incluido en la mezcla de reacción del kit y actúa uniéndose a los productos de PCR en cada uno de los pasos de amplificación.

Mezcla II

Tampón (5×) 10 μl

Enzimas 1 μl

Agua MQ tratada con DEPC Hasta 25 μl

Mezcla I

dNTPs (10 mM c.u.) 5 μl Oligonucleótido directo (10 pmol/μl) 2 μl Oligonucleótido reverso(10 pmol/μl) 2 μl

DTT (100 mM) 2,5 μl

El equipo LightCycler permite cuantificar los productos de PCR durante cada ciclo de amplificación, monitorizando la fluorescencia a una longitud de onda de 521 nm. Es un termociclador rápido, combinado con un fluorímetro de microvolumen, que permite cambios de temperatura rápidos entre los diferentes ciclos.

Con los datos que se obtienen se puede realizar un análisis paso a paso de la amplificación permitiendo cuantificar el RNA de interés. Además, es posible determinar el punto de fusión de los fragmentos amplificados y descartar amplificaciones inespecíficas. Los datos obtenidos se analizaron en un ordenador mediante el

LightCycler Software (Roche).

Esta mezcla se transfirió a un capilar frío y se selló colocándose en el rotor del aparato. El programa que se utilizó comprende diferentes fases que se describen a continuación:

Programa Temperatura (Cº) Tiempo (s) Pendiente (Cº/s) Nº de ciclos

Transcripción inversa 61 1200 20 1 Desnaturalización 95 30 20 1 Amplificación 95 58 72 76 1 10 15 5 20 20 20 20 45 Curva de fusión 95 68 95 5 18 0 20 20 0,1 1 Enfriamiento 40 30 20 1

Todos los oligonucleótidos utilizados tanto en RT-PCR como en RT-PCR a tiempo real (Tabla 4) fueron diseñados con el programa Primer Select (DNA Star, Inc.) con la

Mezcla de RT-PCR a tiempo real

Mn(OAc)2 1,3 μl

LightCycler-RNA Master SYBR Green I 7,5 μl Oligonucleótido directo (10 pmol/μl) 0,6 μl Oligonucleótido reverso(10 pmol/μl) 0,6 μl

Muestra de RNA 2 μl

misma temperatura de hibridación (58ºC) y se comprobaron sus respectivas amplificaciones a esta temperatura mediante PCR con DNA cromosómico antes de su utilización en los ensayos de RNA.

Tabla 4. Oligonucleótidos utilizados en las RT-PCR y/o RT-PCR a tiempo real Oligonucleótido Secuencia Aplicación

103.up 5’- GCTTCGACAAATTTACCGCTGAC

Oligonucleótido directo usado en RT-PCR a tiempo real y RT-PCR

103.dw 5’- TAAGAGAAGGCTGTATGTTGAGTGAC

Oligonucleótido reverso usado en RT-PCR a tiempo real

173.up 5’- TCACAACTGCCAACCAAAGAA Oligonucleótido directo usado en RT-PCR a tiempo real y RT-PCR

173.dw 5’- GCCATCGCAATCCAAACAC

Oligonucleótido reverso usado en RT-PCR a tiempo real

174.up 5’- CAATTGACAACGGCAGATACAGAAGC Oligonucleótido directo usado en RT-PCR a tiempo real y RT-PCR

174.dw 5’- GCAAAACCGAGAGCGCGATAGATTA

Oligonucleótido reverso usado en RT-PCR a tiempo real y RT-PCR

175.up 5’- TATCATCATCGGCCTCATCCTT

Oligonucleótido directo usado en RT-PCR a tiempo real y RT-PCR

175.dw 5’- GAACGGCAAACCAAATCTACCC Oligonucleótido reverso usado en RT-PCR a tiempo real y RT-PCR

176.up 5’- TTTCGAGCATGCTGTCTGGTAT

Oligonucleótido directo usado en RT-PCR a tiempo real

176.dw 5’- GGTAATCCGCCTTTCACG

Oligonucleótido reverso usado en RT-PCR a tiempo real y RT-PCR

1237.up 5’- CATAGTGGGGAGAGGCATAG

Oligonucleótido directo usado en RT-PCR a tiempo real

1237.dw 5’- ATCTTCATCCGCAGCAACAC

Oligonucleótido reverso usado en RT-PCR a tiempo real y RT-PCR

1238.up 5’- TTGACGAGGATACGGCATTTGT Oligonucleótido directo usado en RT-PCR a tiempo real y RT-PCR

1238.dw 5’- GCACTCGCTGGGGTTTCTG

Oligonucleótido reverso usado en RT-PCR a tiempo real y RT-PCR

1239.up 5’- AAGGTTGGTTTCGTCGTTTGA

Oligonucleótido directo usado en RT-PCR a tiempo real y RT-PCR

1239.dw 5’- GTCCCTGCATCCATCCCTGTTGTC

Oligonucleótido reverso usado en RT-PCR a tiempo real y RT-PCR

1240.up 5’- GATTTTGGTTGGTTCTTGTC

Oligonucleótido directo usado en RT-PCR a tiempo real y RT-PCR

1240.dw 5’- GTATGCGCGTGATGATGAG Oligonucleótido reverso usado en RT-PCR a tiempo real feoA.up 5’- ACACTTAGCGCACTTGGGTTTA

Oligonucleótido directo usado en RT-PCR a tiempo real

feoA.dw 5’- GCCTAGGGGAGCGACTTTTT

Oligonucleótido reverso usado en RT-PCR a tiempo real

feoB.up 5’- CTGGCTGGCTACAATCTCTGGT

Oligonucleótido directo usado en RT-PCR a tiempo real

feoB.dw 5’- TTTTCGGTCCTGTTCATTTTCA

Oligonucleótido reverso usado en RT-PCR a tiempo real

309.up 5’- CAATTTCCTCGGTTTCCTCA

Oligonucleótido directo usado en RT-PCR a tiempo real

309.dw 5’- ACTCTGGTAATTCCGCATCAAG

Oligonucleótido reverso usado en RT-PCR a tiempo real

1390.up 5’- GCGTAAAACCAATCCCTAACAC Oligonucleótido directo usado en RT-PCR a tiempo real 1390.dw 5’- AAAACCAATCGAAGACCCTCAC

Oligonucleótido reverso usado en RT-PCR a tiempo real

1352.up 5’- ATCAAAAATGGCACGCTATCAG

Oligonucleótido directo usado en RT-PCR a tiempo real

1352.dw 5’- GAAGGTAATCCGACTCACAC

Oligonucleótido reverso usado en RT-PCR a tiempo real

1103.up 5’- GAACATCGCCTATCCGCAGAC

Oligonucleótido directo usado en RT-PCR a tiempo real

1103.dw 5’- GACCATTGGCTATCGCACTAT Oligonucleótido reverso usado en RT-PCR a tiempo real

cys.up 5’- GGTAACACTGGTATCGGTCTTG

Oligonucleótido directo usado en RT-PCR a tiempo real

cys.dw 5’- CCTGTCCTGTTGTATCTTCGTG

Oligonucleótido reverso usado en RT-PCR a tiempo real