Conclusions and implications

 Obtención y test de viabilidad del polen

Para obtener el polen de las variedades que actuarían como genitor masculino, se recogieron, cerca de 200 flores en estadio D (Felipe, 1977) de las variedades: ‘Constantí’; ‘Ferraduel’; ‘Francolí’; ‘Glorieta’; ‘Guara’; ‘Marinada’; ‘Masbovera’, ‘Tarraco’ y ‘Vairo’ (fig.1.1), todas ellas presentes en las colecciones de almendro del IRTA Mas de Bover.

Fig. 1.1: Flores en estadio D recogidas para la extracción del polen.

Las flores se llevaron al laboratorio donde se procedió a extraer las anteras y dejarlas a temperatura ambiente durante 24 horas (fig.1.2A) para su secado (previamente se eliminó cualquier posible resto de pétalo u otra parte de la flor que pudiera dificultar este proceso). Transcurridas las 24 horas (fig. 1.2B) se procedió a tamizar las anteras presionándolas sobre una fina malla metálica colocada sobre un pequeño bote de cristal que actuaba como receptor del polen que se iba desprendiendo (fig.1.2C).

~ 30 ~

Fig. 1.2: Distintos pasos del proceso de obtención del polen de almendro. A. Anteras secándose en placas de Petri. B. Anteras tras 24h a temperatura ambiente. C. Tamizado de las anteras para la

extracción del polen.

Una vez obtenido el polen de cada variedad, éste, se conservó en el congelador a una temperatura de -18ºC hasta su utilización Estudios anteriores han demostrado que en estas condiciones el polen de almendro se conserva sin problemas (Grasselly y Crossa-Raynaud, 1980; Martínez-Gómez et al., 2002).

Antes de realizar la polinización se comprobó que el polen que se iba a utilizar era viable y capaz de germinar. Para ello se realizaron 2 test de control.

o Test de reacción fluorocromática (FCR): El test FCR (Heslop-Harrison y Heslop- Harrison, 1970) indica de una manera sencilla y rápida, la integridad del plasmalema de las células vegetativas, al demostrarse para distintas especies que existe una elevada correlación entre la integridad de la membrana y la germinación del polen (Helsop-Harrison et al., 1984), se puede utilizar como una aproximación a la capacidad germinativa del polen como ha sido comprobado para diversas especies en distintos estudios (Shivanna y Heslop- Harrison, 1981; La Porta y Roselli, 1991). El protocolo del test consiste en preparar una solución de sacarosa al 17%, mezclarla gota a gota con una solución de acetato de fluoresceína disuelto en acetona (0.1g/50ml) hasta que ésta se vuelva opaca (justo antes de la saturación), colocar una gota de dicha solución sobre un portaobjetos, espolvorear sobre ella un poco de polen con un pincel, y tapar la preparación con un cubreobjetos. La observación al microscopio consiste en realizar un conteo de los granos bajo luz normal y bajo luz fluorescente. Los granos viables aparecen fluorescentes. Por consiguiente, el porcentaje de granos de polen viables se estima como: nº granos fluorescentes/nº granos total)*100 (Helsop-Harrison y Heslop-Harrison, 1970). Para cada muestra de polen se observa el número de campos necesarios hasta contar un total de 100 granos de polen.

o Prueba de germinación: Como medio de cultivo para la germinación del polen de las variedades a testar (tabla1), se preparó una solución de agua destilada con agar (1.2%) y

~ 31 ~

sacarosa (15%) solución utilizada en especies de Prunus (Parfitt y Ganeshan, 1989), en melocotonero (Arbeloa y Herrero, 1987), en albaricoquero (Andrés et al., 1999) y en almendro (Parfitt y Almehdi, 1984; Martínez-Gómez et al., 2000; Vargas, comunicación personal). La solución se depositó en placas de Petri, y sobre ella, se espolvoreó una pequeña cantidad de polen, de las distintas variedades, con la ayuda de un pincel. Transcurridas 48h se observó el polen al microscopio (Andrés et al., 1999). Se consideró que un grano de polen había germinado cuando la longitud del tubo polínico fue igual o superior al diámetro del grano de polen (Ducon, 1968).

 Recolección y tratamiento de las flores femeninas

Se recolectaron aproximadamente, 200-300 flores en estadio D (Felipe, 1977), de cada variedad de almendro que se utilizó como genitor femenino (‘Constantí’, ‘Francolí’, ‘Guara’, ‘Marinada’ y ‘Vairo’). y se llevaron al laboratorio.

Las flores se llevaron al laboratorio, donde se emascularon las flores y se colocaron sobre una rejilla, en bandejas de plástico llenas de agua, de forma que el pedúnculo de la flor estuviera sumergido en ella (fig.1.3). Este método es utilizado habitualmente en este tipo de ensayos para evitar a la desecación de las flores y favorecer su desarrollo normal.

Fig. 1.3: Aspecto de las flores emasculadas en las bandejas donde se polinizarían.

Transcurridas 24 horas desde la colocación de las flores en las bandejas de plástico, tiempo necesario para que la flor termine de madurar y el estigma se encuentre en el periodo de máxima receptividad (Estadio Ff1) (Socias i Company y Felipe, 1993b), las flores se polinizaron mediante el uso de pinceles (una vez comprobado que el polen a utilizar para los cruzamientos era viable y germinaba sin problemas).

~ 32 ~

Se polinizaron alrededor de 100 flores por cada cruzamiento a estudiar (para el ensayo se necesitarían 80 flores).

Durante todo el tiempo que duró el ensayo, desde la entrada de las flores en el laboratorio hasta la fijación de las muestras, para disponer de una referencia de las condiciones ambientales en que se trabajaba en el laboratorio, se dispuso de un sensor HOBO (HOBO® H8 Pro Series), que cada 15min, tomaba datos de la temperatura (ºC) y la humedad relativa (HR%).

 Preparación y conservación de las muestras

Desde el momento de la realización de las polinizaciones, hasta transcurridas 96 horas de la polinización, cada 12 horas (12h, 24h, 36h, 48h, 60h, 72h, 84h y 96h) se recogían 10 flores que se conservaban en una solución fijadora, FAA (10% Formol, 10% Ácido acético glacial y 80% de Alcohol absoluto) hasta el momento de prepararlas para su observación bajo el microscopio de luz fluorescente (fig.1.4).

Fig. 1.4: Flores de almendro conservadas en solución FAA. A. Flores de varios cruzamientos en FAA. B. Detalle del etiquetaje de cada grupo de flores recogido.

 Metodología de observación al microscopio

El protocolo seguido en la preparación de las flores para su observación al microscopio de fluorescencia fue el desarrollado por Martin (1959) con algunas modificaciones específicas para las flores de almendro (Socias i Company, 1979; Rovira et al., 1998).Este método se basa en la tinción de la calosa, sustancia resultante de la rotura de tejidos celulares, que se produce durante el crecimiento de los tubos polínicos a través del pistilo (Kho, 1968; Currier, 1975).

Una vez sacadas las flores de la solución fijadora (FAA) se introducían en cilindros de cristal que se cerraban por ambos extremos con pequeños trozos de malla fijados al tubo

~ 33 ~

mediante hilo metálico. Cada tubo se etiquetaba en un extremo del hilo indicando la polinización realizada y el tiempo transcurrido desde la misma (fig. 1.5).

Fig. 1.5: Flores extraídas de la solución de FAA y preparadas para el proceso de tinción.

Los tubos se colocaban en vasos de precipitados y se procedía a lavar la muestra con agua corriente durante 3-4h aproximadamente. El sistema de malla permitía que el agua pasase a través de los tubos y lavase la muestra sin correr el riesgo de que alguna de las flores fuera arrastrada por la corriente de agua.

Una vez lavadas las flores, se procedía a ablandar el pistilo. Para ello se sumergían las flores en una solución al 5% de sulfito sódico, y se colocaban en una autoclave durante 10min a 1 atmósfera de presión.

Transcurridos los 10min de autoclave las muestras, se volvían a lavar durante otras 2h y tras ello, se teñían, durante 4h, con una solución de azul de anilina al 0.1% mezclada con una solución de fosfato tripotásico 0.1N (Thompson, 1979). De esta forma los granos de polen germinados y los tubos polínicos aparecen fluorescentes bajo la luz UV del microscopio (fig. 1.6).

~ 34 ~

Una vez teñidos, los pistilos se preparaban para su observación al microscopio. Para ello, se colocaban sobre el portaobjetos, se retiraba con cuidado la pilosidad que recubría el pistilo y se realizaba un “squash” con el cubreobjetos. La preparación se sellaba para evitar su deshidratación (fig.1.7). Para la observación del crecimiento de los tubos polínicos se utilizó un microscopio Leitz Dialux 20 EB con lámpara de mercurio HBO 50W y con bloqueo de filtros H-2 Leitz para excitación de luz azul.

Fig. 1.7: Flores montadas para su observación al microscopio.

Una explicación más extensa del protocolo de observación de tubos polínicos a mediante microscopio de fluorescencia, puede consultarse en el anexo V.

 Observación de las muestras al microscopio y toma de datos

En cada observación se registraban, los granos de polen presentes (germinados o no), la cantidad de tubos polínicos y la posición del tubo polínico en el órgano femenino: Estigma, 1/3 del estilo, 2/3 del estilo u ovario (fig. 1.8)

Fig. 1.8: Esquema de las secciones en que se dividió el pistilo para el ensayo y aspecto que ofrecerían el polen y los tubos polínicos bajo el microscopio de luz ultravioleta en 3 de dichas

~ 35 ~

Las observaciones se realizaron mediante un microscopio Leitz Dialux 20 EB con lámpara de mercurio HBO 50W y con bloqueo de filtros H-2 Leitz para excitación de luz azul.

 Análisis de los datos

Los datos obtenidos de las observaciones del crecimiento de los tubos polínicos, se analizaron estadísticamente, utilizando el procedimiento glimmix, del programa estadístico SAS, el cual, transforma modelos no lineales de datos no paramétricos, en modelos lineales generalizados mixtos. Para realizar el análisis se otorgó a cada parte en la que se dividió el pistilo un valor numérico (Estigma=1, 1/3 Pistilo=5, 2/3 Pistilo=10 y Ovario=15).