Conclusions

múltiple (OM) por alelo encontrado. Diferente literal indica diferencia estadística (P<0.05)

Los resultados de la prueba de Kruskal-Wallis para el análisis de los genotipos AA, AB y CC con la variable de respuesta número de cuerpos lúteos a la palpación rectal muestran que el genotipo AB es diferente con respecto a los genotipos AA y CC (p<0.05) y entre AA y CC no hay diferencia (Tabla 8).

Tabla 8. Resultados del factor alelo con la respuesta a inducción de OM (CL).

H(2, n=31) = 7.004; p = 0.0301

Variable dependiente: Total de Cuerpos Lúteos

Genotipo n Suma Rangos Rango Medio

AA 16 246 15.3 a

AB 5 40 8.0 b

CC 10 210 21.0 a

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14.1 Variabilidad genética

El análisis por PCR-RFLP reveló la variabilidad genética existente entre los grupos estudiados al identificarse tres genotipos (AA, AB y CC). El análisis de restricción AluI permitió identificar tres alelos denominados A (243pb, 63pb), B (306p) y C (243pb, 150pb). Estos resultados difieren de los hallazgos de Campagnari (2002) y Loss et al. (2008), quienes reportaron dos alelos estudiando el FSHR/AluI en poblaciones de animales híbridos de Bos taurus y Bos indicus. De la misma manera, Marzón et al. (2005a) encontraron dos alelos en ganado híbrido de Cebú a los que llamaron CC (243 y 63 pb) CG (243/193 y 63/50 pb) y GG (193 y 63/59).

De acuerdo con Buxade (1995), en cada locus de una población puede haber dos o más alelos a los que se les conoce como alelos múltiples o serie alélica dependiendo de la ocurrencia de varias mutaciones en un mismo locus, en lugar de una mutación única que originaría un par de alelos en ese locus. Al respecto, se sabe que los alelos surgen por mutaciones y el mismo gen de distintos individuos puede sufrir diferentes mutaciones, cada una de las cuales produce un nuevo alelo (Audesirk et al., 2003) como es el ejemplo en humanos de la presencia de tres alelos del gen ApoE (apolipoproteína E4) causante de la enfermedad de Alzheimer, algunos presentes en población europea occidental y otros en la población mediterránea (Gálvez et al., 2003).

El locus polimórfico resultó homocigoto para el alelo A en los tres grupos estudiados,

mientras que el homocigoto C solo se observó en el grupo Suizo europeo. El heterocigoto B se observó tanto en Cebú como en híbridos. Con relación a esto, Buxade (1995) menciona que cada locus de un gen tiene dos alelos, uno por cada cromosoma, heredados respectivamente de la madre y del padre, considerándose homocigoto el individuo que tiene dos alelos idénticos y sólo transmite a su descendencia una clase de alelo, y heterocigoto a los distintos alelos para un mismo caracter, debido a los procesos de adaptación a las condiciones locales, asi como a factores aleatorios de cambios en las frecuencias génicas (Espasandín y Ducamp, 2004). Al respecto, Garnero et al. (2008) mencionan que entre las causas básicas de la homocigosis en una explotación se encuentra la intención por parte de los criadores de obtener animales que transmitan las

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características raciales a sus hijos con gran intensidad, y que en poblaciones pequeñas y cerradas, la consanguinidad entre los animales produce homocigosis.

El fragmento encontrado de FSHR para el alelo A (243/63 pb) fue reportado previamente en ganado híbrido brasileño (Cebú/europeo) por Marson (2005a), lo que sugiere que este peso podría ser característico de las razas cebuínas desarrolladas en el continente americano. El ganado Cebú de México se originó en Brasil, en los estados de Minas Gerais y Bahía donde se llevó a cabo su formación a partir del cruzamiento de diversas razas provenientes de India y España.

Este ganado fue traído por primera vez a México en 1923 y en 1945 se recibe una segunda remesa, introducida por el puerto de Veracruz para su distribución por toda la Costa del Golfo de México (Sanders, 1980; Saucedo, 1984) Actualmente, el ganado Cebú y sus cruzas se encuentran ampliamente extendidos en el trópico mexicano y aunque se han introducido genes de otros países, es evidente la prevalencia de rasgos de sus ancestros brasileños (Loftus et al., 1994; Bradley et al., 1996).De acuerdo con Cervantes (2005), una característica de la ganadería de la región es la existencia de varios genotipos en un mismo rebaño, aspecto importante al evaluar el comportamiento de cada grupo racial y de sus mezclas más comunes, que generalmente incluyen una raza pura.

Al respecto, Marson et al. (2005) informaron que la ventaja de la caracterización de las razas es la información esencial para desarrollar estrategias en programas de cruzamiento, conservación genética y la comprensión de conceptos genéticos cuantitativos, que permiten intensificar los métodos tradicionales de selección. Sin embargo, a pesar de la importancia evolutiva de estas razas de ganado, la literatura disponible sobre su caracterización en América es escasa.

Los hallazgos de la genética molecular sugieren que las especies europeas (Bos taurus) y Cebú (Bos indicus) provienen de diferentes subespecies de “Aurochs” o Bos primigenius (Loftus et al., 1994; Bradley et al., 1996) y se sabe que tanto el grupo taurus como el

indicus poseen diferencias morfológicas y fisiológicas que reflejan que estos animales se

han adaptado a los diferentes climas y ambientes donde son desarrollados a través de diversos métodos de selección genética aplicados a lo largo del tiempo y que ambas razas han sido seleccionadas históricamente para la producción de leche y/o carne, sometiéndolos a un proceso de adaptación para estas cualidades, pero también por sus

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características de pelaje, color, resistencia a enfermedades, fertilidad y docilidad, lo que influye en su constitución genética (Loss et al., 2008). En el trópico es común encontrar cruzamientos de ganado Bos taurus con Bos indicus debido a el mejoramiento genético que proporciona la raza europea al ganado Cebú, de ahí la la importancia de conocer las frecuencias alélicas presentes en los diferentes genes para identificar y utilizar sus variaciónes en la mejora del ganado (Metta et al., 2005), resultado de la adaptación al medio ambiente y los cruzamientos realizados.

El conocimiento de estas variaciones o polimorfismos, permitirá realizar mapas genéticos que pueden convertirse en una herramienta útil para identificar genes responsables de caracteres deseables de transmitir a la descendencia y localizar regiones del genoma donde es más probable que se encuentre el gen responsable de un carácter a estudiar (Montaldo y Meza, 1998).

Los resultados muestran que no se encontró equilibrio de Hardy Weimberg en los tres genotipos estudiados. Sin embargo, el análisis por razas demostró que los hatos cebuínos sí se encuentran en equilibrio, lo que señala que en este grupo racial el apareamiento ha sido aleatorio y con ausencia de factores sistemáticos que afecten su comportamiento genético, por lo que se mantiene estable en relación con las frecuencias génicas y genotípicas. El resultado permite considerar a este grupo como un recurso cuya diversidad genética se ha mantenido por la presión de la selección natural y con fuerte predominancia cebuína en el hato híbrido (Sanchez et al., 2007).

El análisis por razas no mostró equilibrio de Hardy-Weinberg para la raza Suizo europeo, debido a la alta proporción de homocigosis presentada por el alelo C. El desequilibrio en esta población, se explica si partimos de la premisa que este hato se formó originalmente de ganado Bos indicus y por introgresión se eliminaron las características cebuínas para alcanzar la conformación genética europea hasta hacer la raza pura.

La sustitución de la raza Cebú mediante cruzamientos absorbentes e introgresión para la introducción de genes de Suizo europeo en la población cebuína, afectó el comportamiento genético, probablemente debido al movimiento de genes de una especie dentro del fondo de genes de otra, por cruzamientos e hibridismo interespecífico. Esto concuerda con Vozzi et al. (2007), quienes indican que los programas de mejoramiento generalmente llevan a la pérdida de variabilidad genética, principalmente debido al

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incremento de la disminución de alelos de los progenitores, a través de procesos de selección genética y deriva, los que disminuyen la contribución genética de razas valiosas.

La intervención en la formación de un hato de factores sistemáticos como migración (incorporación o salida de material genético a la población) y una fuerte selección afectan la presencia de equilibrio (Gardner et al., 2002; Wunsch et al., 2007). El desequilibrio confirma el efecto de la selección ejercida sobre algún alelo por estar relacionado con algún caracter productivo seleccionado o que se desee eliminar, debido a la posibilidad del incremento en la presencia de ciertos alelos, que estén afectando las condiciones del equilibrio (Oliva, 2002b).

La falta de equilibrio (HW) en las tres razas, confirma el efecto de factores sistemáticos que intervinieron en su formación y concuerda con lo informado por Tambasco et al. (2000) y Vasconcellos et al. (2003), quienes mencionan que ciertos eventos tales como acumulación de algunos genotipos, subdivisión de la población, mutación, selección y migración pueden resultar en un estado de desequilibrio, resultados que también coinciden con lo encontrado por Steigleder et al. (2004), quienes analizaron una población de ganado Criollo, en la que no encontraron equilibrio poblacional lo que atribuyeron al alto grado de manejo de cruzamientos y selección de los animales.

La dinámica de las poblaciones en la naturaleza induce cambios de tamaño y estructura como parte de su evolución y sus ciclos biológicos, lo que hace difícil que las condiciones de equilibrio se den en todos los loci en una población (Oliva. 2002b). En un grupo racial, los individuos de cualquier genotipo tienen iguales tasas de supervivencia e igual éxito reproductivo. Si esto no se cumple, las frecuencias alélicas cambian de una población a la siguiente (Marson et al., 2005), debido a la selección natural y al aislamiento reproductivo, mecanismos que conducen a divergencia y finalmente a la separación de poblaciones en especies distintas (Suárez et al., 2001). Además, los cambios en una especie como respuesta al ambiente ocurren porque los distintos genotipos tienen distinta capacidad para sobrevivir, es decir dos individuos con igual genotipo pueden tener distinta tasa de supervivencia como consecuencia de procesos fortuitos (Oliva. 2002a), por lo tanto, la selección es una fuerza importante en el cambio de las frecuencias alélicas y producirá una desviación del equilibrio de Hardy-Weimberg donde todos los genotipos tienen igual viabilidad y fecundidad (Suarez et al., 2001; Thompson et al., 2004).

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El hallazgo de variantes alélicas en este estudio concuerda con lo informado por otros autores (Campagnari, 2002; Rahal et al.,2002; Marzón et al., 2005, Marzón et al., 2008) quienes reportan la existencia de diversidad genética y variables polimórficas presentes en FSHR de ganado bovino y cuyos resultados sugieren que las características del gen de FSHR tienen un papel significativo en la estimulación ovárica, y su conocimiento fisiológico puede ser utilizado para predecir diferencias en la función de FSHR y la respuesta ovárica a FSH, resultados que concuerdan con lo reportado por Simoni et al. (1997), quienes informan que polimorfismos en humanos son causantes de diversos desordenes en la maduración folicular (Allen et al., 2003; Wunsch et al., 2005;Simoni et al., 2008).

La variación en la respuesta se observa también en programas de reproducción asistida en pacientes femeninas, donde la respuesta ovulatoria a la administración exógena de FSH es muy variable, aunque se sabe que la respuesta a una estimulación gonadotrópica intensa es difícil de predecir debido a las características de la paciente así como al protocolo de estimulación gonadotrópica, factores que parecen determinar la respuesta individual (Perez et al., 2000, Kerkela et al., 2007; Achrekar et al., 2009). El hallazgo de variantes alélicas en el gen de FSHR en humanos, tiene impacto en la reproducción del individuo (Simoni et al., 1997; Wunsch et al., 2007), debido a que FSH, no actúa o actúa de manera ineficiente al unirse a su receptor específico. El gen de FSHR desempeña un papel significativo en el éxito de la estimulación ovárica (Themen y Hutanemi, 2000; Sudo et al., 2002, Simoni et al., 1997; Simoni et al., 2008).

Estos datos reflejan la variabilidad que puede ser encontrada en la respuesta ovárica (Gromoll et al, (1996) y sugieren que la fisiología interna ovárica puede verse afectada por los mutaciones presentes en el gen de FSHR las que podrían afectar severamente la gametogénesis resultando en infertilidad. Al respecto, Metta et al. (2004), confirmaron en bovinos el hallazgo de polimorfismos en las razas Ongole y Deoni de Bos indicus puros desarrollados en India y demuestran que existe diferencia genética en las dos razas a pesar de pertenecer a la misma especie. Esto indica que sus procesos de adaptación provocaron variabilidad genética.

Recientemente, se informó del efecto de estas variables alélicas de FSHR en bovinos sobre la precocidad sexual sin que se encontraran resultados significativos (Marson et al., 2007) y de polimorfismos en el exón 10 del gen de FSHR en ganado Bos indicus

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(Nelore), el cual mostró cambios en la cadena de aminoácidos que tienen un efecto directo sobre la pubertad temprana (Milazzotto et al., 2008).

Con la caracterización, determinación de los polimorfismos y posterior estimación de las frecuencias alélicas y genotípicas en las tres razas estudiadas, se contribuye al estudio relacionado del gen FSHR desarrollado en trópico, sugiriendo que el ganado Cebú desarrollado en América presenta pesos similares para FSHR, que existen diferencias polimórficas entre las tres razas estudiadas en la zona del trópico húmedo del Golfo de México, como resultado de su proceso de adaptación y que el desequilibrio encontrado muestra la fuerte selección a que fue sometida la raza Suizo europeo.

14.2 Respuesta a la ovulación múltiple

14.2.1 Cuerpos lúteos como respuesta a la ovulación múltiple

El porcentaje de animales que respondieron a la inducción de ovulación múltiple (80.6%), concuerda con el estudio de Aké et al. (1995), quienes al estudiar la respuesta ovulatoria al tratamiento de inducción de ovulación múltiple con FSH en 30 bovinos Bos indicus y

Bos taurus, tuvieron respuesta similar (80.64 vs 83.3%), datos que coinciden con Bo y

Mapletof (1999), quienes consideran que entre un 20 y 30% de las vacas tratadas no produce respuesta a los tratamientos de OM e indican que esta respuesta puede estar influenciada por factores relacionados con el tipo de tratamiento de inducción de ovulación múltiple o en mayor medida por factores individuales asociados a las características de la dinámica folicular ovárica.

Los resultados muestran que el promedio de CL en las vacas que sí respondieron al tratamiento de inducción de OM (11.32 ± 1.1) fue similar al encontrado por Díaz et al. (1999), Aké et al. (1995) y Barati et al. (2006), 9.31 ± 5.55, 12.0 ± 6.3 y 12.2 ± 0.87, respectivamente. Sin embargo, analizando los resultados por raza, se observa que el promedio de CL fue mayor para el ganado Suizo europeo (12.5 ± 1.2) que para el ganado Cebú e híbridos de Cebú (7.5 ± 1.9 y 7.3 ± 2.8, respectivamente).

Al respecto, los resultados encontrados en ganado europeo muestran diferencias. Mapletoff et al. (2002) informaron valores para dos grupos estudiados de 24.3 y 18.1 CL promedio para cada uno de los grupos, respectivamente. Gómez. (1998), encontró en las

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razas Holstein y Pardo Suizo un promedio de 11.74. En contraste Aké et al. (1995) y Assumpção et al. (1999), reportaron valores promedio para ganado Bos indicus de 14.33 y 15.1 CL, respectivamente. Peixoto et al. (2006), reportaron valores promedio de 10.6 CL por animal. Esta variabilidad individual fue observada en este trabajo y se refleja en los valores máximos y mínimos de CL por vaca encontrados, (0 a 25 CL por vaca), lo que concuerda con Santiago et al. (2002), quienes encuentran un rango de 12 a 20 CL por vaca, resultados que reflejan una alta variabilidad.

La diferencia en la respuesta al tratamiento podría deberse a factores que producen alteraciones en los mecanismos endócrinos hormonales que podrían interferir con un adecuado desarrollo folicular y que producirían varios folículos en crecimiento, pero pocos folículos capaces de ovular o luteinizarse tornándose atrésicos. Esta falla en el mecanismo de crecimiento folicular ha sido estudiada en humanos y animales de laboratorio, atribuyéndosele a diversas mutaciones en el gen del receptor de la FSH como responsable de la falta de respuesta hormonal (Jameson et al., 1994; Simoni et al., 1997).

Los diferentes tratamientos hormonales utilizados en la inducción de ovulación, asi como diferentes preparaciones gonadotrópicas, pueden afectar la respuesta debido a la capacidad del receptor para captar una señal hormonal específica. La duración y tiempo de los tratamientos son otro factor importante ya que existen estudios que demuestran que la presencia de cambios polimorficos de FSHR puede afectar la señalización y requerir diferentes tiempos y diferentes dosis hormonales. Otras causas importantes de variabilidad en la respuesta son las inherentes al animal y su medio ambiente, como son el efecto del estrés calórico y nutricional (Bo 2002; Cobanov y Schnitkey 2003).

Diversos estudios han demostrado que el estrés calórico y nutricional inhibe el desarrollo del folículo dominante durante el periodo preovulatorio en vacas. Como consecuencia, se reducen también las concentraciones de estradiol séricas y se retrasa la declinación de la fase luteal tardía lo que incrementa la presencia de tres ondas de crecimiento folicular (Wilson et al., 1998).

Existe una situación más grave durante la época de sequía, en la cual disminuye considerablemente la oferta y calidad de forrajes debido a que estos dependen principalmente de la distribución de las lluvias y el manejo y características de los suelos, llegando a ser crítico el aporte de nutrientes para cubrir los requerimientos del animal.

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Estas deficiencias nutricionales afectan negativamente la función hormonal (Mapletoff et al., 2002; Gutiérrez et al., 2006). Sumada a la variabilidad de especie, la variabilidad individual es un factor presente y no controlable en los tratamientos para inducir OM y está fuertemente influenciada por factores como la raza, la edad y las características genéticas de cada animal (Montaño y Ruiz, 2005). Se sabe también que el momento de presentación de la oleada folicular podría afectarse por alteraciones físiológicas de los mecanismos dentro del ovario, lo que provocaría disrupción de los mecanismos endócrinos normales que podrían interferir con un adecuado desarrollo folicular y ovulación (Santiago et al., 2002).

De acuerdo con Ireland et al. (2000), en bovinos existen diversos procedimientos para manipular artificialmente la duración del ciclo estrual, el momento de ovulación o número de folículos que crecen y ovulan, con la finalidad de disminuir la variación existente, sin que hasta el momento existan resultados consistentes en el número de folículos, CL o en la calidad del ovocito después de programas de inducción de ovulación. Sin embargo, a pesar de los avances genéticos y moleculares que han permitido progresos como la clonación, conocer e incluso seleccionar el sexo del producto por nacer y modificar el ADN de la célula germinal para controlar enfermedades genéticas, los mecanismos precisos que participan en la regulación no son aún del todo entendidos (Prieto y Velázquez, 2002).

Se sabe que la dinámica folicular es uno de los procesos mas importantes en la fisiología ovárica, y ha sido ampliamente estudiada en la especie europea (Bos taurus) (Ginther et al., 1989; Knopf et al., 1989; Badinga et al., 1994). Sin embargo, el número de reportes

en Bos indicus y sus cruzas son limitados (Perea et al., 1998; Chase et al., 1998). La

fisiología reproductiva del Bos indicus presenta diferencias con respecto al Bos taurus, el diámetro folicular al momento de la ovulación es menor en Bos indicus, tiene una gran sensibilidad a las gonadotropinas, una menor duración del estro (Medrano et al., 1996) y comúnmente expresa estro durante la noche (Baruselli et al., 2006). Además, presenta diferencias en las características del área del tejido luteal (Pathiraja et al., 1986), en el diámetro del folículo dominante (Barros et al., 1995), y el momento de la ovulación (Pinheiro et al., 1998; Roa et al., 2006).

El conocimiento de esas diferencias es muy importante para el establecimiento de parámetros adecuados de evaluación, manejo de los procedimientos de ambos tipos

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raciales, así como también para el desarrollo de nuevas tecnologías que incrementen la eficiencia reproductiva del hato.

Bo y Mapletoff (1999) informan que el tratamiento de inducción de ovulación debe iniciarse al comienzo de una onda de desarrollo folicular, antes de la selección del folículo dominante, en la fase luteal media, cuando se produce la segunda onda folicular (Mapletoff et al., 2002), lo que involucra el desarrollo sincrónico de un grupo de folículos, que inician su crecimiento al ocurrir una pequeña elevación en las concentraciones de FSH y que los tratamientos de inducción de ovulación provocan un desarrollo uniforme de los folículos reclutados a través de la administración exógena de FSH (Vázquez et al., 2004).

El rango de variación encontrado en este trabajo concuerda con los datos de obtenidos por Seidel y Moore (2001) yKanitz et al. (2002), quienes informaron que existe un alto grado de variación en la respuesta en programas de transferencia embrionaria, a pesar de que existen protocolos modernos basados en un profundo conocimiento del control