Inicialmente, los átomos de hidrógeno fueron adicionados a los ligandos seleccionados con el programa Discovery Studio. Luego de esto fueron sometidos a una minimización de energía usando un campo de fuerza MMFF94, a partir del método de pasos descendientes. El número de pasos descendientes utilizados fue de 100. Esta fue realizada con el paquete de herramientas del paquete LigandScout (Wolber & Langer, 2012). El tratamiento de los ligandos fue efectuado a partir de la revisión de las posiciones de los átomos y todos sus enlaces, tomando como referencia la estructura 2D, caracterizada en la base de datos PDB.
4.5. Cribado virtual
Los compuestos base y sus metabolitos producto de la biotransformación fueron sometidos a un cribado virtual con las dos isoformas COX1 y COX2. En total se realizaron 2 cribados por medio del programa Autodock 4.2 desarrollado por The Scripps Research Institute, haciendo uso del lanzador Phyton. Autodock 4.2 mejora significativamente la precisión promedio de predicciones de modo vinculante en comparación con Autodock 4 (Trott & Olson, 2010). Además la velocidad de respuesta es mayor que Autodock 4. En el primer cribado se usaron los compuestos bases y sus metabolitos correspondientes con la isoforma COX1, de igual manera se seleccionaron las mismas moléculas para el segundo cribado virtual tomando como diana la isoforma COX2. Los parámetros usados para la determinación de las dimensiones de la cuadricula fueron los siguientes: para la enzima COX1 las dimensiones de la cuadricula fueron de 40 angstrom en el eje X, 40 angstrom en el eje Y y 40 angstrom en el eje Z. Por otro lado, para la enzima COX2 las dimensiones establecidas fueron de 40 angstrom para el X, 40 angstrom para el eje Y, y 40 angstrom para el eje Z. Los resultados obtenidos fueron tabulados según el valor de constate de inhibición (ki) y afinidad de unión (kd) calculado por el programa.
Para la realización del cribado virtual se estableció la siguiente matriz:
Ligando/Proteína COX1 COX2
Compuestos Cribado Categoría I (COX1 y
Compuestos)
Cribado Categoría II (COX2 y Compuestos)
Compuestos Biotransformados
Cribado Categoría III (COX1 y Compuestos
Biotransformados)
Cribado Categoría IV (COX2 y Compuestos
Biotransformados)
Tabla 2. Categorías propuestas para el tamizaje por cribado virtual de los ligandos y sus metabolitos
mayoritarios de biotransformación, con respecto a los modelos teóricos de la enzima COX1 y COX2 de Homo sapiens.
De la tabla relacionada anteriormente, se derivan cuatro categorías: el primer cribado virtual fue realizado para los 93 compuestos producto de biosíntesis en la especie Cannabis sativa L y la enzima COX1, el segundo relacionó los mismos compuestos y la enzima COX2; en la tercera categoría se efectuó el cribado virtual entre los productos de biotransformación y la COX1, y la cuarta categoría dichos productos de biotransformación fueron evaluados frente a la COX2. De cada una de las categorías se seleccionaron los cuatro menores valores de afinidad de unión (kd) y constante de inhibición (ki).
4.6. Acoplamiento molecular
Los cálculos de acoplamiento fueron llevados a cabo usando el servidor Docking Server. El campo de fuerza usado para la minimización de energía de la molécula ligando fue MMFF94 (Halgren, 1998). Cargas parciales Gasteiger fueron añadidas a los átomos del ligando. Los hidrógenos no polares fueron adicionados y los enlaces giratorios fueron definidos.
atom type”, y los parámetros de solvatación fueron adicionados con ayuda de las herramientas de AutoDock Tools (Morris & Goodsell, 1998).
Para el modelo COX1, se determinó un total de 2’048.383 puntos en la cuadricula, compuesta por 40 angstrom en el eje X, 40 angstrom en el eje Y, y 40 angstrom en el eje Z. El centro de la caja fue de 21,792 para el eje X, -23,255 para el eje Y, y -64,419 para el eje Z. El espacio de la rejilla establecido fue de 0,375 angstrom.
Por otro lado, para el modelo COX2 los puntos totales utilizados fueron de 2’048.383 en la cuadricula. El tamaño de la caja abarco también 40 angstrom en el eje X, 40 angstrom en el eje Y, y 40 angstrom en el eje Z. Para la determinación del centro se tomaron las siguientes coordenadas: 21,792 para el eje X, -23,255 para el eje Y, y - 64,419 para el eje Z. El espacio usado fue de 0,375 angstrom. La determinación de la cuadricula fue realizada a partir del uso del programa AutoGrid, desarrollado por (Morris & Goodsell, 1998).
La cuadricula abarco lo aminoácidos relacionados con la epoxidación y ciclo oxigenación del ácido araquidónico. La tabla 2 indican los aminoácidos involucrados en cada una de las reacciones, en las dos enzimas estudiadas COX1 y COX2, respectivamente.
SITIO ACTIVO PEROXIDASA SITIO ACTIVO CICLOOXIGENASA
AMINOACIDO COX1 AMINOACIDO COX2 AMINOACIDO COX1 AMINOACIDO COX2
HIS207 HIS207 ARG120 ARG120
LYS211 LYS211 GLN203 GLN203
LYS222 ASN222 HIS207 HIS207
LYS240 ARG240 TYR348 TYR348
HIS274 ILE274 VAL349 VAL349
GLU290 GLU290 TRP387 TRP387
HIS388 HIS388 SER530 SER530
MET391 LEU391 LEU531 LEU531
PHE409 TYR409
Tabla 3. Aminoácidos correspondientes al sitio activo peroxidasa y ciclooxigenasa presente en las dos
isoformas de la enzima ciclooxigenasa, COX1 y COX2.
El conjunto de parámetros de AutoDock 4.0 y las funciones dieléctricas dependientes de la distancia fueron usadas en el cálculo de las interacciones tipo van der Waals y las interacciones electrostáticas, respectivamente.
Las simulaciones de acoplamiento se realizaron utilizando el algoritmo genético Lamarckiano (LGA) y el método de búsqueda local Solis & West (Solis & Wets, 1981). Los algoritmos genéticos usan ideas basadas en el lenguaje de la genética natural y la evolución biológica. En el campo del acoplamiento molecular, la disposición particular de un ligando y una proteína puede definirse por un conjunto de valores que describen la traducción, la orientación y la conformación del ligando con respecto a la proteína: estas son las variables de estado del ligando y, en los algoritmos genéticos, cada variable de estado corresponde a un gen. El estado del ligando corresponde al genotipo, mientras que sus coordenadas atómicas corresponden al fenotipo. En acoplamiento molecular, la aptitud (fitness) es la energía de interacción total del ligando con la proteína y utiliza la función de energía. Los pares aleatorios de individuos se aparean mediante un proceso de cruce, en el que nuevos individuos heredan genes de cualquiera de los padres. Además, algunos descendientes sufren una mutación aleatoria, en la que un gen cambia en una cantidad aleatoria. La selección de los descendientes de la generación actual se produce en función de la aptitud del individuo: por lo tanto, se reproducen las soluciones más adecuadas para su entorno, mientras que los más pobres mueren (Holland, 1992). Así, la adición de métodos de acoplamiento basados en algoritmos genéticos mejora AUTODOCK y permite abordar problemas con más grados de libertad. Además, ahora es posible usar el mismo campo de fuerza que se utiliza en el acoplamiento para realizar la minimización de la energía de los ligandos (Morris et al, 1998).
corridas diferentes que se establecieron para terminar después de un máximo de 2’500.000 evaluaciones de energía. El tamaño de la población fue de 150 individuos. Durante la búsqueda se aplicó un paso de traducción de 0,2 angstrom y 5 pasos de torsión.