Conclusions – surveys

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PRACTICA No 9 TEMA: PRUEBAS BIOQUIMICAS

COMPETENCIAS

 Conocer el fundamento de las diferentes pruebas bioquímicas  Siembrar en los diferentes medios para las pruebas bioquímicas  Aprender a interpretar algunas pruebas bioquímicas

MARCO TEÓRICO:

Se trata de un conjunto de reacciones basadas en el metabolismo de los microorganismos. En otros aspectos se analiza la acción de las bacterias sobre los hidratos de carbono, la presencia de enzima en los diferentes microorganismos y su acción sobre los distintos compuestos químicos presentes en los medios de cultivos. A partir del conocimiento del metabolismo, las pruebas bioquímicas nos permiten determinar el género y la especie de la bacteria en estudio.

Casi todas las reacciones que tiene lugar en una ruta bioquímica están catalizadas por una enzima específica. Los catalizadores son sustancias que pueden acelerar una reacción química sin sufrir ellas mismas alteración, aumentando la frecuencia de las colisiones o disminuyendo la energía necesaria de activación.

Las enzimas son catalizadores biológicos. Actúan siempre de forma específica, es decir, cada enzima afecta solamente a un sustrato específico, debido a la estructura específica de cada enzima.

Esta identificación debe hacer a partir de un cultivo puro y fresco (18-24 horas). Hay que considerar, además, que las características metabólicas en los microorganismos pueden variar en función de distintos factores de manera que para realizar una caracterización confiable es necesario realizar las pruebas en condiciones estandarizadas (en cuanto al inóculo, los reactivos, las condiciones de incubación y el tiempo de lectura) y utilizar más de una prueba en cada caso.

La elección de las pruebas bioquímicas se hará en base a la familia en estudio, lo cual se irá determinando en el curso del aislamiento.

MATERIALES MEDIOS REACTIVOS EQUIPOS

Algodón Agua de Peptona Alcohol Mechero

Fósforos Agar Urea Kovacs Refrigeradora

Lápiz graso Agar Citrato Incubadora

Gradilla Agar hierro triple azúcar

Tubos Agar Lisina

Cajas de Petri Agar Mio Pipetas

78 Asa de

Inoculación Hilo de Inoculación

Elaborado por: QF. Mariana Rendón M. MSc.

PROCEDIMIENTO

Vamos a estudiar diversas enzimas que pueden tener los distintos microorganismos, los que nos permitirán clasificarlos e identificarlos.

1. PRUEBA DEL CITRATO

Únicamente las bacterias capaces de metabolizar citrato podrán multiplicarse en este medio, al utilizar los fosfatos presentes liberan iones amonio (básicos) que junto con la eliminación de citrato (ácido) generará que el medio se vuelva muy alcalino, lo que se demuestra con un cambio de color del indicador de pH de verde a azul.

Fundamento:

Esta prueba determina la capacidad que presenta el microorganismo problema para utilizar el citrato como única fuente de carbono. Este medio indica la capacidad de las bacterias de metabolizar el citrato. Contiene citrato como única fuente de carbono, fosfato de amonio como única fuente de fosfato y azul de bromotimol como como indicador de pH. Técnica:

a. A partir de un cultivo puro y reciente del microorganismo problema se tomará una muestra con un hilo.

b. Sembrar en picadura y estría en un tubo con citrato de Simmons. c. Incubar a 37o_{C durante 18-24 horas.}

Interpretación de los resultados:

Prueba positiva. Citrato positivo (+): si aparece crecimiento en el slam y si el medio vira de verde a azul (debido a la producción de amoniaco que lo alcaliniza y cambia el color del indicador), el microorganismo es citrato positivo. Prueba negativa. Citrato negativo (-): no vira el indicador. No hay cambio del color del medio.

79 El indol es uno de los productos de degradación metabólica del aminoácido triptófano. Las bacterias que poseen la triptofanasa son capaces de hidrolizar y desaminar el triptófano con producción de indol, ácido pirúvico y amoníaco. La producción de indol es una característica importante para la identificación de muchas especies de microorganismos. La prueba de indol está basada en la formación de un complejo rojo cuando el indol reacciona con el grupo aldehído del p-dimetilaminobenzaldehído. Este es el principio activo de los reactivos de Kovacs y Ehrlich. El medio de cultivo utilizado debe ser rico en triptófano y puede ser suministrado por una peptona adecuada

La práctica va a consistir en observar si el microorganismo es capaz de producir indol cuando está en presencia de agua de peptona. El indol producido es detectado por indol de Kovacs que produce una coloración al reaccionar con él.

Fundamento:

Esta prueba se basa en que ciertos microorganismos poseen una enzima llamada triptofanasa que puede degradar el triptófano a indol.

Técnica:

a. A partir de un cultivo puro y reciente del microorganismo problema se tomará una muestra con asa de siembra.

b. Sembrar en un tubo con agua de peptona. c. Incubar a 37o_{C durante 18-24 horas.}

Pasado el tiempo de incubación se sacan los tubos de la estufa y se les añade 1 ml de reactivo de Kovacs o de Erlich y se deja reposar.

Prueba positiva. Indol positivo (+): si aparece un anillo rojo en la capa etérea, indica que la prueba es positiva, el microorganismo produce indol. Prueba negativa. Indol negativo (-): no hay cambio de color del medio.

3. PRUEBA DE SCREENING DE PRODUCCIÓN DE ÁCIDO Y GAS

Se aplica para averiguar la capacidad degradativa de un microorganismo de un cierto hidrato de carbono. Se puede realizar sobre distintos hidratos de

80 carbono, esta prueba orienta para posteriormente realizar otras más selectivas, como la de rojo o metilo o Voges Proskauer.

Fundamentos:

Se basa en el viraje de color de un indicador de pH al producirse ácidos. La formación de gas se observa en una campana de campana de Durham

Técnica:

a. Rotular cada tubo con el nombre del azúcar correspondiente (lactosa, glucosa, maltosa, sucrosa, etc.)

b. Agregar con una pipeta 0.5 ml de los diferentes azúcares en el tubo correspondiente.

c. Tomar la cepa bacteriana con el asa de cultivo puro del microorganismo problema.

d. Incubar a 37o_{C durante 24 horas.}

Interpretación de los resultados:

La formación de ácido se verá por el viraje de incoloro a fucsia. Si se formará gas, éste se verá en el interior de la campana de Durham.

La campana de Durham debe estar perfectamente llena de agua de peptona con indicador de Andrade en el momento de incubar la muestra pues una sola burbuja induciría a error.

4. PRUEBA DE HIERRO TRIPLE AZUCAR

Esta prueba se recomienda para la identificación de patógenos entéricos Gram negativos. Se emplea para detectar la fermentación de lactosa, sacarosa y glucosa, con formación de ácido y gas, y también para detectar producción de ácido sulfhídrico.

Procedimiento

Realice una estría en la superficie y una punción en la profundidad del medio. Incube a 37°C. Observar a las 18-24 horas, ni menos ni más.

Resultados

1. Profundidad ácido (amarillo): Glucosa fermentada.

Superficie ácido (amarillo): Lactosa y/o sacarosa fermentada. 2. Profundidad ácido (amarillo): Glucosa fermentada.

Superficie alcalino (rojo): Lactosa y/o sacarosa no fermentada. 3. Profundidad alcalino (rojo)

Superficie alcalino (rojo): Ninguno de los tres glúcidos es fermentado 4. La aparición de burbujas en la profundidad del medio indica que la

fermentación se ha efectuado con producción de gas.

81 A B C D A Glucosa, lactosa y/o sacarosa fermentada

B Glucosa fermentada con producción de ácido sulfhídrico y gas C Glucosa fermentada con producción de ácido sulfhídrico D Ninguno de los tres azúcares es fermentad

Se reporta como un quebrado a) A/A

b) K/AG+ c) K/A+ o SH2 d) No cambio