La separación espermática por citometría de flujo, en base a la diferencia en el contenido de ADN existente entre los espermatozoides portadores del cromosoma X y los portadores del cromosoma Y, es actualmente el único método fiable y eficaz para la obtención de descendencia del sexo deseado (Maxwell y col., 2004).
Figura 3: Histograma correspondiente a las poblaciones X e Y,
mostrando la zona de incertidumbre o confusión.
Y
X
Z
co
Y
Y
XX
Z
co
Z
co
Zona de Confusión Detector 0ºDesde las primeras aplicaciones de esta técnica, se han realizado continuas mejoras e innovaciones tanto en los protocolos como en el equipamiento de los citómetros utilizados, resultando en la obtención de animales de sexo deseado en diferentes especies. Aún así, y como corresponde a toda técnica nueva y en vías de desarrollo, todavía existen una serie de aspectos limitantes.
A pesar de que con las mejora en el procedimiento de separación así como en lo medios de recogida, los porcentajes de espermatozoides viables separados se han incrementado notablemente, la utilización de diferentes técnicas para evaluación de la viabilidad, motilidad o estado a acrosomal de los espermatozoides separados (Maxwell y Johnson, 1997; Centurión y cols., 2000), ha demostrado que éstos, en las condiciones y con los medios actuales, son células inestables, en un estado de capacitación o precapacitación debido al estrés del procedimiento y, sobre todo, a la alta dilución a la que se ven sometidos. Una de las mayores limitaciones de este método es la reducida vida útil que presentan los espermatozoides tras el proceso de separación, determinando que su viabilidad y capacidad fecundante en el tracto genital femenino se vea también disminuida. El diagnóstico del momento de la ovulación mediante ecografía transrectal y la realización de las inseminaciones lo más próximas posibles al mismo, para así disminuir el tiempo que los espermatozoides permanecen almacenados en el tracto genital femenino, se hacen necesarios como pasos fundamentales en los protocolos de inseminación con semen sexado (Maxwell y cols., 2004). Otra de las grandes necesidades del momento actual es el desarrollo de nuevos sistemas para la evaluación del efecto que el proceso de separación tiene sobre el espermatozoide. Un estudio detallado de estos efectos implicaría el estudio de cambios espermáticos a nivel molecular, incluyendo la detección de cambios en la arquitectura de la membrana plasmática (Gillan y cols., 2004).
Los rendimientos de los citómetros actuales son mucho mayores que los obtenidos en un principio, pero en el caso concreto de la especie porcina siguen siendo insuficientes para la utilización de los espermatozoides separados en inseminación artificial, haciendo necesaria la combinación de esta tecnología de separación, con técnicas, como la fecundación in vitro (FIV) y la transferencia de embriones (ET)
(Rath y cols., 1997,1999). Aunque un estudio reciente describe la obtención de lechones tras inyección intracitoplasmática (ICSI) de espermatozoides separados y posterior transferencia de embriones (Probst y Rath, 2003), los protocolos de fecundación in vitro y transferencia embrionaria en combinación con la separación espermática todavía necesitan ser mejorados en la especie porcina para resultar útiles desde un punto de vista comercial (Maxwell y cols., 2004). Sólo un procedimiento no invasivo de inseminación uterina profunda (DUI: deep uterine insemination) o de transferencia de embriones sería aceptable actualmente, tanto desde un punto de vista económico como de bienestar animal para la aplicación de espermatozoides sexados en esta especie.
Resultados altamente satisfactorios han sido descritos por numerosos autores tras inseminación uterina profunda en diferentes especies (Bovino: Seidel y cols., 1997, 1999a y b; Ovino: Cran y cols., 1997; Hollinshead y cols., 2002; Equino: Lindsey y cols., 2002a,b; Morris y cols., 2002), a pesar de lo cual la producción in vitro de embriones a partir de ovocitos de hembras jóvenes o adultas se perfila en la actualidad como el método más prometedor para generar descendencia con semen sexado en la mayoría de estas especies (Maxwell y cols., 2004).
La criopreservación de espermatozoides separados ha sido y está siendo también utilizada con éxito en diferentes especies de mamíferos domésticos obteniéndose descendencia tras la descongelación e inseminación de los mismos (Bovino: Schenk y cols., 1999; Seidel y cols., 1999b; Porcino: Johnson y cols., 2000a; Ovino: Hollinshead y cols., 2001; Equino: Lindsey y cols., 2002a). En este sentido recientemente (Hollinshead y cols., 2003; O’ Brien y cols., 2004) se ha descrito la obtención, in vitro, de embriones viables en ganado ovino a partir de espermatozoides previamente congelados, los cuales fueron descongelados sometidos al proceso de separación y congelados de nuevo para ser posteriormente descongelados y utilizados en FIV. La posibilidad de poder separar espermatozoides congelados-descongelados y volverlos a congelar hasta el momento de su uso, facilitaría la aplicación de la tecnología de separación espermática en aquellos casos en los que esta podría verse limitada por la distancia entre los equipos y los animales (Maxwell y cols., 2004), ya
que permiten un transporte adecuado de los mismos, antes y después de la separación, manteniendo su viabilidad y capacidad fecundante.
Si bien en el caso del vacuno, la experiencia en el proceso de congelación, la congelabilidad del espermatozoide, y la disposición anatómica de los cuernos uterinos de la vaca han permitido el nacimiento de terneros tras inseminación artificial con espermatozoides separados y congelados, en el caso del porcino sólo se han conseguido nacimientos tras la inseminación quirúrgica de las cerdas con espermatozoides de verraco separados y congelados (Johnson y cols., 2000). Sin embargo, los resultados obtenidos actualmente en congelación de espermatozoides de verraco (Roca y cols., 2004; Carvajal y cols., 2004; Eriksson y cols., 2001) y la utilización con éxito de sondas de inseminación intrauterina profunda en la cerda (Martínez y cols., 2001a y b, Martínez et al., 2002) determinan que la combinación de las tecnologías de separación y congelación espermática, junto con la aplicación de los espermatozoides resultantes mediante procedimientos no quirúrgicos representen una herramienta fundamental para incrementar la eficiencia de esta técnica en producción porcina.
Sin duda y gracias a los continuos avances en la instrumentación utilizada, así como en la manipulación de los espermatozoides separados, la eficacia del proceso se verá incrementada. Este aumento de la eficacia junto a las mejoras en los sistemas de aplicación de los espermatozoides separados, podría suponer un gran paso en la aplicación práctica de esta tecnología de manera generalizada en las diferentes especies.