Continuous and dimensional affective annotation

Las hADSCs fueron aisladas a partir de tejido adiposo de pacientes sanos (edad: 21-36; Índice de Masa Corporal: 30-38) sometidos a cirugía estética de acuerdo a la reglamentación de cirugía plástica de la Universidad de Padova, Italia. De acuerdo con la Declaración de Helsinki, fue obtenido el consentimiento de todos los pacientes por escrito previa inclusión en este estudio. El tejido adiposo fue digerido y las células cultivadas de acuerdo con el procedimiento descripto en Pozzuoli y col. [56]. Cuando las hADSCs pasaje 2 (p2)

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estuvieron en confluencia, fueron tomadas mediante tratamiento con tripsina (tripsina/EDTA, EuroClone, Milan, Italia), y cultivadas.

3.4.2. Cultivo de hADSCs sobre recubrimientos nanoestructurados de HA

Lotes simultáneos de hADSCs fueron cultivados con una densidad de 3 x 104 células / cm2 por pocillo, con fondo plano, ya sea en ODM o cDMEM sobre los recubrimientos de HA y fueron analizados luego de transcurridos 7 y 21 días [57], [58]. El medio de cultivo correspondiente fue cambiado dos veces por semana. Los experimentos fueron desarrollados por triplicado.

3.4.3. Actividad metabólica mitocondrial y ensayos de viabilidad

La viabilidad de las hADSCs cultivadas sobre recubrimientos de HA1 y HA2 fue evaluada luego de 7 y 21 días ya sea en ODM o cDMEM mediante el ensayo de toxicidad basado en MTT, como se describió en Denizot y Lang [59]. Las hADSCs con un metabolismo activo, tienen la capacidad de reducir el MTT en un producto de coloración azul-violácea que puede ser solubilizado y cuantificado por medios espectrofotométricos. Cuando las células mueren, esta capacidad se pierde, por lo que esta técnica es un marcador de células metabólicamente activas [60], [61]. Este ensayo se llevó a cabo con el objetivo de evaluar la actividad metabólica mitocondrial (del inglés mitochondrial metabolic activity, MMA) de las hADSCs e, indirectamente, su viabilidad cuando son cultivadas en presencia de los materiales preparados [61]. Luego del período de cultivo, (7 o 21 días), las células fueron incubadas con 1 mL de una solución 0,5 mg / mL de MTT-PBS por 3 horas a 37°C en ambiente controlado (5% CO2). Luego de ello, la solución fue removida y cada una de las

muestras se extrajo con 0,5 mL de una solución DMSO 10% en IprOH por 30 minutos a 37°C. Para cada muestra, alícuotas de 200 μL, por duplicado, fueron usadas para medidas de densidad óptica (DO) obtenidas a 570 nm mediante un Lector de Multiplaca Multidetectores (Victor 3, Perkin Elmer, Milano, Italy). La absorbancia de los pocillos recubiertos fue utilizada como blanco.

3.4.4. Análisis del crecimiento y morfología de hADSCs: proliferación, localización y adhesión

La distribución homogénea y adhesión de los nanomateriales de HA en el fondo de los pocillos luego del sembrado de las células fue comprobado a través de microscopía óptica (Leica DM IRB). Células sembradas en pocillos sin recubrimiento fueron utilizadas como control (C).

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3.4.5. Estudio de la actividad de fosfatasa alcalina

La actividad intracelular de la fosfatasa alcalina (del inglés Alkaline Phosphatase, ALP) de las ADSCs cultivadas en contacto con los recubrimientos de los diferentes nanorodillos por 7 y 21 días en ODM o cDMEM, fue estudiada utilizando el kit de ensayo colorimétrico Fosfatasa Alcalina (Abcam). De acuerdo al protocolo del fabricante, las células sobre el material fueron lavadas con PBS, homogeneizadas con buffer de ensayo ALP (300 μL en total para cada grupo), luego centrifugadas a 13000 rpm por 3 minutos para remover el material insoluble. Posteriormente, diferentes volúmenes de las muestras fueron colocados en placas de 96 pocillos llevando, con buffer de ensayo, a un volumen final de 80 μL, a cada una de las muestras. A continuación, fueron añadidos 50 μL de p-nitrofenil fosfato (pNPP) 5 mM a cada uno de los pocillos e incubados por 60 minutos a 25°C y en oscuridad. Una curva de calibrado de 0, 4, 6, 12, 16 y 20 nmol / pocillo fue generada a partir de una solución estándar 1 mM de pNPP llevando a un volumen final de 120 μL con buffer de ensayo. Luego de la detención de todas las reacciones con 20 μL de solución Stop los valores de DO fueron tomados a max = 405 nm en un lector de placas (Victor 3, Perkin Elmer, Milano, Italy). Los

resultados fueron normalizados sustrayendo el valor obtenido de los estándares a todos los valores. La curva estándar pNPP fue confeccionada para identificar la concentración de pNPP en cada muestra. La actividad ALP de las muestras fue calculada de la siguiente manera: 𝐹𝐴𝐿_{𝑎𝑐𝑡𝑖𝑣𝑖𝑑𝑎𝑑}( 𝑈

𝑚𝐿) = 𝐴 𝑉⁄

𝑇

donde A es la cantidad de pNPP generado por las muestras (en μmol), V es la cantidad de muestra añadida en el pocillo (en mL), y T es el tiempo de reacción (en minutos).

3.4.6. Coloración con Rojo de Alizarina S

Los depósitos minerales intracelulares fueron detectados con la coloración Rojo de Alizarina S. Las hADSCs cultivadas en contacto con la cubierta de los diferentes nanorodillos por 7 y 21 días en ODM o cDMEM se fijaron en paraformaldehído 4% en PBS y temperatura ambiente durante 10 minutos. Las células fueron coloreadas con 40 mM de solución fresca de ARS (Sigma-Aldrich), pH 4,2, por diez minutos a temperatura ambiente con agitación suave. Finalmente, fueron lavadas con agua Milli-Qestéril y luego observadas con un microscopio óptico Leica DM4000 M anexado a una computadora.

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3.4.7. Microscopía Electrónica de Barrido - Estudio de la micro-morfología de las hADSCs

Para el análisis de la micromorfología de hADSCs luego de la interacción con los nanomateriales y la obtención de las imágenesSEM; las hADSCs cultivadas en contacto con la cubierta de los diferentes nanorodillos por 7 y 21 días en ODM o cDMEM fueron fijadas en glutaraldheído 2,5% en una solución reguladora cacodilato 0,1M por una hora, para luego ser deshidratadas progresivamente en etanol de acuerdo con el protocolo SEM para muestras biológicas [62]. Las muestras se inmovilizaron con cinta de carbón de doble cara, recubrieron con oro (Edwards S150A, sputter coating unit, Edwards, Crawley, UK) y observaron con SEM (JEOL JSM-6490LV, JEOL, Tokio, Japan). El microanálisis de fluorescencia de rayos X proveyó información cualitativa sobre la composición elemental de la superficie.

3.4.8. Aislamiento total de RNA y Real Time PCR

Con el objetivo de confirmar la inducción osteogénica, el RNA total fue aislado con un Kit de Purificación Total de RNA (Norgen Biotek Corp., Thorold, ON, Canada) a partir de hADSCs cultivadas con HA1 (PPG) y HA2 (PEG) por 7 y 21 días en ODM y cDMEM. Para evaluar calidad y concentración de las muestras de RNA fue utilizado un NanoDropTM ND- 1000 (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA).

El DNA complementario (cDNA) fue obtenido a partir de 500 ng del total de RNA usando el Kit de Síntesis SensiFASTTM (Bioline, Londres, RU) siguiendo el protocolo del fabricante. Las Real Time PCR se desarrollaron en un Rotor-Gene 3000 (Corbett Research, Sydney, Australia) utilizando 400 nM de los cebadores diseñados y el Kit SensiFASTTM SYBR No-ROX (Bioline). Los valores fueron normalizados respecto de la expresión del gen constitutivo del receptor de transferrina (TFRC) y las diferencias en la expresión evaluadas por el método 2ΔΔCt [63]. Las secuencias de los primers humanos están detalladas en la Tabla 3.1.

3.4.9 Análisis estadístico

Todos los test cuantitativos fueron desarrollados, por lo menos, en triplicado, calculados valores medios y desvío estándar. El análisis estadístico de los datos se llevó a cabo mediante análisis de varianza de un factor (ANOVA). Test-t de Student con probabilidad de error menores de 0,05 (p < 0,05) fueron considerados significativamente diferentes. Los datos cuantitativos se expresan como media ± desvío estándar (SD).

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Tabla 3.1. Secuencias primer humanas usadas en el estudio de PCR. ALPL, fosfatasa alcalina, hígado/hueso/riñón; BMP2, proteína morfogenética de hueso 2; COL1A1, colágeno, tipo I, alfa 1; OC, osteocalcina; ON, osteonectina; OPG, osteoprotegerina; OPN, osteopontina; OSX, osterix; RANKL, ligando del receptor activador para el factor nuclear κ β; RUNX2, factor de transcripción 2 relacionado con runt; SOST, esclerostina; TFRC, receptor de transferrina; FGF-2, factor de crecimiento de fibroblastos.

Gen Secuencia primer (5’- 3’)

Símbolo Forward Reverse

Desarrollo esquelético

ALPL GGCTTCTTCTTGCTGGTGGA CAAATGTGAAGACGTGGGAATGG

OC GCAGCGAGGTAGTGAAGAGAC AGCAGAGCGACACCCTA ON TGCATGTGTCTTAGTCTTAGTCACC GCTAACTTAGTGCTTACAGGAACCA OPG AAACGCAGAGAGTGTAGAGAGG TCGAAGGTGAGGTTAGCATGTC OPN TGGAAAGCGAGGAGTTGAATGG GCTCATTGCTCTCATCATTGGC

RUNX2 AGCCTTACCAAACAACACAACAG CCATATGTCCTCTCAGCTCAGC

COL1A1 TGAGCCAGCAGATCGAGA ACCAGTCTCCATGTTGCAGA

Diferenciación celular y crecimiento

BMP2 CCACTAATCATGCCATTGTTCAGAC CTGTACTAGCGACACCCACAA

OSX TCAGAATCTCAGTTGATAGGGTTTCTC GGGTACATTCCAGTCCTTCTCC

RANKL TCAGCATCGAGGTCTCCAAC CCATGCCTCTTAGTAGTCTCACA

SOST TGTGGTTTCTAGTCCTGGCTC TTCTCTCTCTCTCTCTCACCTCTG

FGF-2 5′-GGCTTCTTCCTGCGCATCCA-3’ 5′-GCTCTTAGCAGACATTGGAAGA-3′

Gen constitutivo

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