El bioreactor de tanque agitado miniBio (Applikon®, Delft, Holanda) es un equipo diseñado y concebido para investigación y desarrollo de cultivos celulares a pequeña escala. Tal como se puede observar en la Figura 7–1, es un equipo compacto de mesada, compuesto básicamente por un bioreactor autoclavable provisto con sensores, sistema de agitación, aireación y control de la temperatura; y una unidad de control (my-
Control) mediante la cual es posible la adquisición de datos y el control de las variables
Figura 7–1 Bioreactores miniBio empleados para cultivos de expansión y diferenciación eritroide: En el centro de la imagen se observa los bazos de cultivo equipados y en funcionamiento; y a ambos extremos las unidades de control my-Control.
La unidad de control ofrece todas las funciones necesarias para la automatización y control de las principales variables de proceso: temperatura, agitación, pH y oxígeno disuelto (pO2). Estas funciones son la adquisición de datos, calibración de los sensores, gestión de los lazos de control (PID, PID adaptativo y on/off) y actuadures (bombas y válvulas). La interface con el usuario se genera a partir de una conexión en red con un ordenador personal (comunicación TCP/IP) lo que permite consignar y parametrizar los valores de las variables básicas de cultivo.
El software asociado al equipo, BioExpert Lite (versión 1.12, Applikon®) permite la adquisición y visualización de los datos de proceso de forma gráfica o como datos que pueden ser exportados para su posterior tratamiento.
También dispone de conexiones para gases de entrada (aire y CO2) regulados por válvulas solenoides, que permiten el suministro controlado de estos gases al sistema, ya sea por cabezal (overlay) o en forma de microburbujas a través del sparger . El recipiente de cultivo es de vidrio (borosilicato), el volumen máximo de trabajo es 200 mL y el mínimo 50 mL. La temperatura del cultivo es controlada entorno al valor de
consigna mediante una manta térmica eléctrica que envuelve al recipiente. En la tapa superior dispone de varios puertos de entrada que permiten instalar sensores, entrada y salida de gases, tomo de muestras y otras funciones. En la Figura 7–2 se observa una configuración típica para los cultivos desarrollados.
Figura 7–2 A) En la imagen de la izquierda se puede observar los distintos sensores y sistemas auxiliares empleados para la monitorización y control del proceso: 1) Sonda de pH; 2) sonda de pO2; 3) vaina para
sonda de temperatura (Pt-100); 4) sistema de agitación (hélice marina); 5) sistema de aireación (micro-
sparger) y 6) cánula para toma de muestra. B) En la imagen de la derecha se observa la disposición de
los distintos puertos de entrada en el cabezal del bioreactor.
7.2.3.1 Preparación y operación del bioreactor miniBio
De forma resumida se presentan a continuación las principales etapas y tareas a realizar par la preparación y operación del bioreactor, tanto para cultivos en discontinuo (batch), así como para cultivos discontinuos alimentados (fed-batch).
• Se montan los distintos componentes del bioreactor: sondas, tubuladuras, filtros y se clampan todas las conexiones.
• Se calibra la sonda de pH y las bombas incorporadas al bioreactor.
1) 2.) 3.) 4.) 5.) 6.) A B
• Corroborado la limpieza correcto estado de todas las piezas correspondientes al baso de cultivo, se llena con WFI o PBS.
• Se verifica el ajuste de las sondas y accesorios al bioreactor, se preparan los filtros de venteo y gases de entrada, se resguardan las conexiones y se verifica el sello mecánico del sistema de agitación. Es muy importante dejar sin clampar una salida para evitar una sobrepresión durante el autoclavado.
• El bioreactor junto al soporte se debe autoclavar para su esterilización, al menos 30 minutos a 121 ºC. Una vez finalizado el ciclo de autoclavado, se debe comprobar la integridad de las tubuladuras, conexiones y filtros.
• Se conectan los gases y los cables de los sensores a la unidad de control. Se monta la manta térmica y se activan los controles de temperatura y agitación con valores de consiga de operación (ej.: 37 ºC y 100 rpm) y se aguarda hasta que estas variables se estabilicen entorno a los valores fijados.
• Se calibra la sonda de pO2, la cual debe polarizarse previo a su calibración un mínimo de 2 horas. Por características intrínsecas de los cultivos celulares, el 0 pude ser calibrado indicando 0 de corriente. Luego se introduce un caudal de aire hasta obtener una lectura estable y máxima de corriente, lo que corresponderá al 100%.
• Luego se procede a la inoculación del bioreactor, para lo cual se deberá desconectar todas las conexiones y trasladar el bioreactor junto al soporte al interior de una cabina de flujo laminar para operar en esterilidad.
• En el interior de la cabina se retira la WFI o PBS del interior del bazo y se inocula el medio de cultivo. Se recomienda que este, se encuentre previamente atemperado para evitar choques térmicos. Se cierra correctamente el bioreactor,
se retira del flujo laminar y se reconectan todas las sondas y tubuladuras a la unidad de control. Se reinicia el control de temperatura y la agitación.
• Se inicializan todas las consignas de control del cultivo. Se deja que las variables se estabilicen y se inicia la adquisición de datos.
• La inoculación de la suspensión celular o medio de cultivo se realiza mediante empleando un kit de conexión constituido por una (o varias) jeringas precargadas y tubuladura que se conecta de forma estéril al bioreactore mediante conector de tubos. Para la toma de muestra en esterilidad y/o actuaciones referidas al medio de cultivo, se procede empleando la misma metodología. • Una vez finalizado los cultivos, se procede a la inactivación con hipoclorito de
sodio al 5% p/v y descarte del cultivo y posterior limpieza del bioreactor.
7.2.4. Cálculo del factor de expansión, factor de expansión total y número de