Los análisis de MG se realizaron con el programa Morphometrics in Medical Entomology– Collection of Landmark for Identification and Characterization (MoMeCLIC) de Dujardin (2016). Además, a los datos de MG se les hizo otros análisis para conocer qué tan heredable es la variación de la conformación y el tamaño y como se afectan los métodos de agrupamiento que complementan los análisis discriminantes. A las Al.Izq. y Al.Der. de cada espécimen se les tomó fotografías con una cámara digital Canon T3i, y con el software Helicon Focus 6.0 (HELICON SOFT, 2014) se realizó el procesamiento digital de las imágenes. Sobre las imágenes de las alas se seleccionaron 12 puntos LM (Figura 2) siguiendo los procedimientos de Calle et al. (2008).
La asignación de los LM sobre las fotos se llevó a cabo con el módulo COO (“Collection of coordinates”) siguiendo la orientación de las manecillas del reloj (1, 2….12). El punto 1 corresponde al inicio de la PHD y el punto 12, a la intersección entre el final del margen anal y el comienzo del área jugal del ala, alula (Figura 2). Para cada imagen, se realizaron dos mediciones por punto denominadas R1 y R2. Con las repeticiones R1 y R2 se realizaron las pruebas de repetibilidad descritas en el numeral 5.2 (Anexo A).
Figura 2. Puntos anatómicos. Localización de los puntos anatómicos tomados en el ala de los mosquitos hembra. (1) inicio de la mancha basal oscura (BD), (2) inicio de la mancha humeral clara (HP), (3) inicio de la mancha humeral oscura (HD), (4) inicio de la mancha subcostal oscura (SCD), (5) inicio de la mancha subcostal clara (SCP), (6) inicio de la mancha preapical oscura (PD), (7) inicio de la mancha preapical clara (PP), (8) finalización de la mancha apical clara (AP), (9) intersección de la vena R3 y el borde distal del ala, (10) intersección entre la vena Cu 1 y el borde distal del ala, (11) intersección entre la vena Cu 2 y el borde distal del ala y (12) intersección entre la vena plical y la vena cubital. La nomenclatura usada fue la propuesta por Faran en 1980.
Fuente: Calle et al. 2008. Discriminación por morfometría geométrica de once especies de Anopheles (Nyssorhynchus) presentes en Colombia.
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Para realizar las comparaciones entre poblaciones dentro de especie se siguen los mismos procedimientos usados para la estimación de R del tamaño del centroide y la conformación del ala (Anexo A, numeral 5.2). En este caso, las poblaciones se representaron por P1, P2,...; Pn. En el análisis discriminante cada población tuvo su propio centroide y su propio polígono de distribución de las conformaciones de las alas de los especímenes que las representa. También se calcularon las distancias de Mahalanobis promedio con su desviación estándar por pares de poblaciones. Se reducen los riesgos de error asociados a cada distancia llevando el cálculo sobre 10000 permutaciones. Como se realizaron comparaciones múltiples, se utilizó la corrección de Bonferroni, donde la primera distancia que se consideró significativa para P<0.05 debe tener: P ajustado <0,05/(número de comparaciones).
Con base en modelo discriminante se identificó a que población pertenecen las conformaciones del ala de los especímenes que hicieron parte del análisis (Re-clasificación simple). Se estimó el número de asignaciones correctas expresado en porcentaje. Luego se llevó a cabo una verificación cruzada de clasificación (=Cross Check Classification): donde cada individuo clasificado no hizo parte del análisis discriminante y se recalculó el número de asignaciones correctas expresada en porcentaje.
Se estimó la alometría con los componentes Procrustes o PW´s. Se examinó el efecto del tamaño centroide sobre las VC, usando los dos primeros componentes Procrustes, ya que ellos representan el mayor porcentaje de la varianza total. Se realizó una regresión lineal utilizando como variable dependiente el componente canónico 1, CPR1 (Y1) y como como variable predictora los tamaños centroide (X). Se calculó el coeficiente de correlación (r), se estimó su significancia usando una distribución t de Student con k1-2 G.L. y se llevó a cabo su representación gráfica.
Para la correlación "se introdujo la variable tamaño" en la primera columna y las funciones discriminantes (en las próximas columnas) de poblaciones P1, P2,…Pn con tamaños muestrales de n1, n2, … ni. Se examinó la contribución del parámetro seleccionado sobre cada función discriminante (DF) aunque algunos DF fueron factores que no contribuyeron. Generalmente, con los dos primeros se explica un alto porcentaje de la varianza total (>80%). También se estimó la
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disparidad métrica total y parcial (por población), la diferenciación fenotípica, usando los 14 PW. Se estimó la significancia estadística mediante métodos no paramétricos con 10000 permutaciones. En el análisis de asimetría se tomaron las alas del Al.Izq. y del Al.Der. de cada individuo. A cada una de ellas se le asignó las coordenadas crudas con dos repeticiones siguiendo los pasos descritos del análisis de R. Se creó un único archivo con las coordenadas de los LM de digitalizaciones sucesivas. Se realizó una superposición Procrustes antes de aplicar un ANOVA de dos vías para el tamaño centroide (Palmer y Strobeck 1986; Tabla 5) y un ANOVA Procrustes para las VC (Klingenberg y McIntyre, 1998; Tabla 6). Además, se calcularon los componentes simétricos y asimétricos, así como las puntuaciones de asimetría fluctuante (AF) de la conformación alar del individuo (Klingenberg y Monteiro, 2005). En el Anexo A, numeral 5.2.2 se muestran estos análisis.
Las diferencias significativas entre el tamaño o la conformación del Al.Izq. respecto al Al.Der. indicaría la existencia de asimetría direccional (AD). Las diferencias significativas de la interacción lado*individuo señalarian la existencia de asimetría fluctuante (AF). Las diferencias significativas entre individuos puede deberse a diferencias genéticas por hacer parte de familias de HC. y por efecto del ambiente común donde se desarrollaron.
Todos análisis estadísticos se realizaron utilizando los programas STATISTICA-Versión 8.0. (StatSoft Inc. 2004) y XLSTAT DE EXCEL. También se usó el software PAST (Hammer, 2001) versión 3.14 (http://folk.uio.no/ohammer/past/).
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Tabla 5. ANOVA de dos vías mixta para el tamaño centroide (Palmer y Strobecq, 1986). Donde: r = Número de individuos/población; c = Número de lados (alas izquierda y derecha; n = número de repeticiones.
Fuente G.L. SS MS F
Modelo (rc-1) SSModelo MSModelo MSModelo/SSResidual
Individuo (r-1) SSIndividuo MSIndividuo MSIndividuo/MSLado*Individuo
Lado (c-1) SSLado MSLado MSLado/MSLado*Individuo
Lado*Individuo (r-1)(c-1) SSLado*Individuo MSLado*Individuo MSLado*Individuo/SSResidual
Residual rc(n-1) SSResidual SSResidual
Total rcn-1 =N-1 SSTotal
Tabla 6. ANOVA Procrustes para las variables que definen la conformación del ala (Klingenberg McIntyre, 1998). L = Número de variables de conformación; r = Número de individuos/población; c = Número de lados (alas izquierda y derecha; n = número de repeticiones.
Fuente G.L. SS MS F
Modelo L(rc-1) SSModelo MSModelo MSModelo/SSResidual
Individuo L(r-1) SSIndividuo MSIndividuo MSIndividuo/MSLado*Individuo
Lado L(c-1) SSLado MSLado MSLado/MSLado*Individuo
Lado*Individuo L(r-1)(c-1) SSLado*Individuo MSLado*Individuo MSLado*Individuo/SSResidual
Residual Lrc(n-1) SSResidual SSResidual
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4. RESULTADOS
Se presentan para cinco especies de Anopheles (Nyssorhynchus)-Sección Albimanus (An. nuneztovari, An. benarrochi B, An. strodei, An. strodei y An.albimanus s.l.) y dos especies- Sección Argyritarsis (An. albitarsis F y An. darlingi) según la clasificación de Harbach (2004) y Motoki et al. (2009b). Se describieron las frecuencias de los patrones de las manchas costales alares considerando la variación intraindividual (Al.Der., Al.Izq.), el sexo, la procedencia de las progenitoras recolectadas (localidad), las especies y la sección. Posteriormente, se analizaron la Long.A. (mm) y los tamaños (mm) de las manchas costales alares considerando las variables categóricas anteriores. Por último, se presentaron los análisis de las variables tamaño y conformación alar mediante MG en An. benarrochi B.
4.1 FRECUENCIAS DE LOS PATRONES DE LAS MANCHAS COSTALES ALARES