La unión entre la daptomicina y su blanco en la membrana celular (MC) en bacterias Gram positivas no ha sido bien entendido ni definido, pero se ha postulado que puede ser multifactorial. La permeabilización de la MC junto con la interferencia de la división celular ha sido demostrada en varios estudios (Pogliano, 2012; Humphries, 2013, Zhang, 2014), mientras que la inhibición de la síntesis de pared celular (PC) permanece en discusión (Laganas, 2003).
Figura 2. Estructura química de la daptomicina. Tomado de Humpries RM., CMR 2013;26:759-80
La evidencia de la interacción inicial de este agente es con los lípidos de la MC, principalmente con el fosfatidilglicerol (FG). Esta interacción se deriva de experimentos realizados con perileno-DAP, un compuesto en el cual la cadena decanoil de la DAP es reemplazada con el ácido perileno-butanoico, una sustitución que está asociada con un aumento mínimo de la CIM en Bacillus subtilis (Muraih, 2012). Es así que, el perileno-DAP se une al FG en liposomas lo que desencadena una oligomerización del perileno-DAP tanto en los liposomas como la MC de los Gram positivos. Además, también es claro que la actividad de la DAP es estrictamente dependiente de la presencia de niveles fisiológicos de Ca2+ que inducen cambios conformacionales en la DAP (Straus, 2006; Ho, 2008), donde estos facilitan que la DAP se oligomerize e inserte en la MC (Jung, 2004; Muraih, 2011), posiblemente por el aumento de la exposición de los dominios hidrófobos en la molécula (Ho, 2008).
Al ser la daptomicina una molécula aniónica, además del efecto de su propia estructura, se cree que los iones de calcio permiten que DAP supere la repulsión carga-carga entre DAP y las cabezas de los fosfolípidos aniónicos en la MC bacteriana (Jung, 2004). La MC de las bacterias Gram negativas contienen una proporción significativamente menor de fosfolípidos aniónicos que las bacterias Gram positivas, debido a un contenido mayor de fosfatidiletanolamina (FE) (Epand, 2007), encontrando excepciones en el contenido, como por ejemplo, en bacterias Gram positivas como B. cereus el contenido de FE es mas alto (Epand, 2007), sin embargo, DAP conserva la actividad contra este microorganismo (Citron, 2006). Una superficie menos aniónica puede ser la razón por lo que la daptomicina no demuestra actividad detectable contra las bacterias Gram negativas (Randall, 2013).
Previamente, se consideró que la inserción de los oligómeros de DAP en la MC de Gram positivos generaban una estructura de conducción de iones en un proceso similar al de las toxinas formadoras de poros, las cuales oligomerizan las membranas formando poros en forma de anillo (Zhang, 2013). Este canal conductor de iones interrumpe la integridad funcional de la MC Gram positiva, dando como resultado la liberación de iones de potasio intracelular, la despolarización de la MC y conllevando a la muerte celular, lo cual es observado en las células tratadas con DAP (Silverman, 2003; Alborn, 1991; Allen, 1991). Sin embargo, aún falta la evidencia directa de la participación de oligómeros en la permeabilización de la MC.
Pogliano y colaboradores, evaluaron la estructura de la MC del B. subtilis en presencia de dosis letales y sub-letales de DAP (fluoresceína) mediante microscopía de fluorescencia en lapsos de tiempo (Pogliano, 2012), usando DAP marcada con Bodipy (fluoresceína), donde su actividad antibacteriana no fue alterada. Estos autores, observaron que Bodipy- DAP se une de forma preferencial con las regiones de síntesis del peptidoglicano (PG) activas y en la curvatura de la MC, incluyendo los bordes de los septos de la pared celular naciente durante la división celular o esporulación (Pogliano, 2012; Hachmann, 2009). Asimismo, postularon que el estrés en la MC facilita la inserción de DAP, que la estructura de la MC se alteró en regiones co-localizadas con DAP y que la inserción de oligómeros de DAP en la capa externa de la MC puede producir una traslocación hacia la capa interna, en la cual se producen alteraciones igualmente en la curvatura a través de la relación en la estructura "cónica" de la DAP que en comparación con la de otros lípidos en la membrana (por ejemplo, un grupo de lípidos con cabeza grande y cola corta), en este caso con el requerimiento de la cardiolipina (Pogliano, 2012) (Figura 3).
Fue claro que la exposición a DAP indujo respuesta al estrés de la envoltura celular en S. aureus y B. subtilis (Hachmann, 2009; Muthaiyan, 2008) y el número de alteraciones de la MC observados por Pogliano y col fueron proporcionales a la concentración de DAP utilizada en este estudio (Pogliano, 2012) y a raíz de esto, se puede pensar que a concentraciones superiores de la CIM, la capacidad de la célula para responder a estas alteraciones se limita lo que daría lugar a fugas de iones y a la pérdida del potencial de membrana, sin la formación de poros.
Zhang y cols, demostraron que la cardiolipina (CL) inhibe la formación de poros dada por la daptomicina en un modelo de liposomas. Este estudio fue motivado por estudios genéticos sobre la resistencia a la daptomicina, que sugieren que las bacterias pueden volverse más resistentes a la daptomicina mediante el aumento del contenido de cardiolipina en su membrana celular. Encontraron que la inclusión del 10% de CL en el modelo de membrana fue suficiente para eliminar eficazmente la translocación en la MC y la formación de poros en los liposomas. Además, es posible que un aumento del contenido de CL inhiba la formación de poros in vivo; sin embargo, esto aún no se ha evaluado experimentalmente (Zhang, 2014).
Sin embargo, las investigaciones hasta el momento no han ofrecido la configuración molecular de como la daptomicina esta unida a la membrana. Recientemente, Chen y cols, reportaron que hay un cambio en el dicroísmo circular (DC) de daptomicina cuando se une al FG que se encuentra en la MC en presencia de Ca2+, lo cual indicó un posible cambio estructural en la unión a la MC. Ellos determinaron que el principal efecto de DAP en la MC era remover las moléculas de los lípidos, como resultado de la interacción. Normalmente, una molécula unida a una bicapa lipídica, se adsorbe en la interface entre
las cabezas y las colas o se incrusta dentro de las colas. Los agregados de la daptomicina se desenlazan de la bicapa lipídica, ya que, los autores refieren, que no son compatibles con un estado de unión a la MC. Acá, plantean que no está claro si los lípidos están intrínsecamente siendo parte de la agregación molecular o si estas moléculas de lípidos se adhieren a los agregados cuando se están separando de la MC. En cualquier caso, las acciones de la agregación molecular y luego la desunión de la MC tiene un efecto en la extracción de lípidos, es decir, en la eliminación de moléculas de lípidos de la MC. También encontraron que debido a esto, se puede inducir la conducción de iones de modo transmembranal, sin causar fugas moleculares.
Figura 3. Mecanismo de acción de daptomicina. Tomado de Pogliano J et al., JB 2012;194:4494. DAP: Tazas de azul claro con círculos amarillos; FG, fosfatidilglicerol: lípidos verdes; CL, cardiolipina: lípidos amarillos, iones de potasio: círculos verdes y proteínas de división celular como DivIVA: ovalos azules.