Customers’ complex purchase process

Enzygnost* Anti-HBc monoclonal es una prueba immunoenzimática para la determinación in vitro de anticuerpos contra el HBcAg en el suero o en el plasma según el principio competitivo. El anti-HBc de la muestra compite con el conjugado Anti-HBc/POD para fijarse al HBcAg depositado en la superficie de la placa de microtitulación. Después del lavado del pocillo se determina la actividad enzimática de la peroxidasa fijada. La transformación enzimática del peróxido de hidrógeno y del cromógeno se interrumpe por la adición de ácido sulfúrico diluido. En razón del principio competitivo de la prueba, la intensidad cromática es inversamente proporcional a la concentración de Anti-HBc presente en la muestra.

Reactivos

Contenido del envase comercial

Enzygnost* Anti-HBc monoclonal 2 x 96

Enzygnost* Anti-HBc 2 placas de prueba

Conjugado Anti-HBc/POD, monoclonal 2 x 1,2 ml Tampón para conjugado (Anti-HBc monoclonal) 4 x 12,5 ml Suero de control Anti-HBc, negativo 2 x 0,7 ml Suero de control Anti-HBc, positivo 2 x 0,5 ml Solución de lavado POD (concentrado)** 1 x 100 ml

Tampón/sustrato TMB** 1 x 30 ml

Cromógeno TMB** 1 x 3 ml

Solución de parada POD** 1 x 100 ml

Frasco vacío para preparar la solución de cromógeno 1 unidad

Láminas adhesivas 6 unidades

Bolsa de PE 1 unidad

Tabla de valores Barcode 1 unidad

Boletín informativo 1 unidad

Otros envases comerciales: 100 x 96

** Estos componentes también vienen includíos en el kit de Reactivos adicionales para Enzygnost* TMB (N° de pedido OUVP).

Composición

Enzygnost* Anti-HBc monoclonal (placa de prueba): Placa de microtitulación recubierta con antígenos de la hepatitis B-core obtenidos por tecnología genética.

Conjugado Anti-HBc/POD, monoclonal: Antí HBc monoclonal, conjugado con peroxidasa (POD). Agente de conservación: Fenol (máx. 1 g/l).

Tampón para conjugado (anti-HBc monoclonal) Tampón Tris con Boviserin® y Tween 20. Agente de conservación: Fenol (máx. 1 g/l)

Suero de control Anti-HBc, negativo: Suero humano, estabilizado; valor teórico de extinción ≥ 0,7. Agentes de conservación: Anfotericina (aprox. 5 mg/l), Gentamicina (aprox. 100 mg/l). Suero de control Anti-HBc, positivo: Suero humano, estabilizado; valor teórico de extinción

≥ 0,1. Agentes de conservación: Anfotericina (aprox. 5 mg/l), Gentamicina (aprox. 100 mg/l). Solución de lavado POD (concentrado): Solución de tampón de fosfato con adición de Tween. Agente de conservación: Fenol (máx. 1 g/l)

Tampón/sustrato TMB: Peróxido de hidrógeno (aprox. 0,1 g/l) en solución tampón de acetato. Agente de conservación: n-butanol (aprox. 1%)

Cromógeno TMB: diclorhidrato de tetrametilbenzidina Solución de parada POD: Acido sulfúrico 0,5 N Advertencias y medidas de precaución 1. Sólo para ser utilizado en diagnósticos in-vitro

2. Cada donación individual de sangre destinada a la preparación de sueros de control ha sido investigada para detectar la presencia del HBsAg, anti-HCV, anti-HIV1 y anti-HIV2. En la elaboración sólo se utilizan donaciones con resultados negativos.

Independientemente de esto, todos los materiales obtenidos a partir de sangre humana deben ser manipulados con las precauciones necesarias, siguiendo las medidas de seguridad recomendadas en caso de riesgo biológico, puesto que nunca se puede excluir completamente la existencia de agentes patógenos6.

3.Se aconseja utilizar guantes de seguridad durante el desarrollo del test.

4. Para la eliminación del material infeccioso sólido se recomienda colocarlo en el autoclave por lo menos 1 hora a + 121 °C. Todas las soluciones aspiradas se deben recoger en dos recipientes conectados uno con el otro. Estos recipientes deben contener un medio de desinfección apropiado para inactivar virus patógenos humanos. Deben observarse la concentración y el tiempo de acción dados por el fabricante.

Preparación de reactivos

Llevar todos los reactivos y las muestras a una temperatura entre +18 y +25 °C antes de iniciar la prueba, sin sacar del recipiente la placa de prueba.

Para cada placa de prueba diluir 20 ml de solución de lavado POD con agua destilada o desionizada hasta obtener 400 ml.

Solución de uso del cromógeno: Para cada placa de prueba diluir 1 ml de cromógeno TMB con 10 ml de tampón/sustrato TMB en el frasco plástico adjunto (solución de uso del cromógeno) y conservar el frasco cerrado al abrigo de la luz. Después de su uso, lavar cuidadosamente el frasco con agua destilada.

Para evitar la repleción no está permitido verter juntos el contenido de los frasco de cromógeno TMB y de tampón/sustrato TMB.

Solución de uso del conjugado: Para cada placa de prueba agregar 0,5 ml de conjugado Anti-HBc/POD a un frasco original (12,5 ml) de tampón de conjugado (Anti-HBc monoclonal) (dilución 1+25) y agitar suavemente para mezclar evitando la formación de espuma.

Estabilidad y almacenaje

Todos los componentes del envase combinado Enzygnost* anti-HBc monoclonal aún cerrados, conservados entre +2 y +8 °C, son utilizables hasta las fechas indicadas en las etiquetas. La estabilidad y las condiciones de almacenaje de los envases ya abiertos o de los reactivos ya diluidos, se pueden consultar en la Tabla 1 del apéndice.

Equipo necesario:

BEP® II: Para el desarrollo automático de la dosificación de reactivos y de las etapas de lavado BEP® III: Para la realización completamente automática del test después de la distribución

de las muestras, así como para la evaluación.

BEP® 2000: Para la realización y valoración completamente automática del test. Pipetas: Pipetas a émbolo 25, 100 y 1000 µl

Incubadora: Baño de agua cubierto (+37 ± 1 °C) u otros métodos de incubación similares Todos los instrumentos utilizados para el desarrollo del test deben estar validados.

Material a investigar

Para la investigación se pueden utilizar muestras aisladas (sueros humanos o plasma con EDTA/heparina/citrato), las cuales hayan sido tomadas según las técnicas estándar de laboratorio. Las muestras se pueden almacenar máximo 3 días entre +2 y +8 °C. Para tiempos más largos de almacenamiento las muestras se deben congelar.

Procedimiento

Realización del test usando el BEP® II

1. Plan de distribución: Comprobar la cantidad necesaria de pocillos (cantidad de muestras a investigar más 6 pocillos para los controles). Quitar del soporte los elementos que no han de ser utilizados y conservarlos para su empleo ulterior (ver Tabla 1).

2. Distribución de las muestras: Dosificar en cuatro pocillos 25 µl del control negativo por c/u, en un pocillo 25 µl del control positivo y en cada uno de los siguientes pocillos 25 µl de la muestra non diluir. Al final de la serie o de la placa de ensayo dosificar una vez más 25 µl del control positivo. Acto seguido distribuir el conjugado lo antes posible, como máximo 15 min después de la distribución de las muestras.

Coma una alternativa para el esquema de pipeteo descrito anteriormente se permite también colocar un control positivo dos veces al comienzo de cada serie del test.

Esquema de pipeteo: Colocar en 4 pocillos 25 µl de suero de control negativo en cada uno y en 2 pocillos 25 µl de control positivo en cada uno así como en cada uno de los siguientes pocillos 25 µl de la muestras sin diluir.

3. Distribución del conjugado: Colocar en cada pocillo 100 µl de la solución de uso del conjugado, cubrir con la lámina adhesiva y llevar de immediato al incubador.

4. Incubación: Incubar durante 60 min ± 5 min a +37 ± 1 °C. Lavar de inmediato.

5. Lavado: Retirar la lámina adhesiva, aspirar el contenido de todos los pocillos y lavar cada uno de ellos con aprox. 0,3 ml de solución de lavado 4 veces.

6. Distribución del sustrato: Colocar en cada pocillo 100 µl de la solución de cromógeno lista para el uso. Cubrir la placa con una nueva lámina adhesiva.

7. Incubación del sustrato: Incubar durante 30 ± 2 min entre +18 y +25 °C al abrigo de la luz. 8. Reacción de parada: Retirar la lámina adhesiva. Agregar 100 µl de solución de parada POD

en cada pocillo, manteniendo el mismo ritmo que en el punto 6.

9. Medición: Valorar fotométricamente a 450 nm en el término de una hora.

Es recomendable utilizar un fotómetro con dos longitudes de onda (rayo de medida y rayo de referencia).

La medida de la extinción de las muestras de control y de las muestras de pacientes debe realizarse con una longitud de onda de 450 nm; la longitud de onda de la medida de referencia debe ser de 650 nm (o entre 615 y 690).

Procedimiento en el BEP® III

Para el desarrollo del test en el BEP® III, las placas de prueba se deben preparar hasta la distribución de las muestras (punto 1 hasta punto 3 del «Procedimiento en el BEP® II»). Directamente después de esto, colocar las placas de prueba abiertas, esto es, sin lámina adhesiva en el BEP® III. Aquí es importante observar que las placas de prueba que no estén llenas se deben completar con «elementos con agua» hasta por lo menos la mitad de la placa de prueba (6 elementos). Todas las etapas subsiguientes van a ser realizadas de forma completamente automática por el aparato (ver manual de funcionamiento del BEP® III). Los tiempos de incubación ajustados en el software del BEP® III pueden desviarse de los del procedimiento en el BEP® II debido a condiciones técnicas básicas (ritmo del aparato), están sin embargo validados en la combinación BEP® III/Enzygnost*.

Procedimiento en el BEP® 2000

La distribución de las muestras y la realización subsiguiente del test se efectúa de forma com-pletamente automática por el aparato (ver manual de funcionamiento del BEP® 2000).

Validez de la prueba

Los valores de extinciones de los sueros de control se pueden utilizar para calcular el valor medio cuando:

E neg. ≥ 0,700 -0,010 ≤ E pos. ≤ 0,100

Si uno de los valores de extinción del suero de control negativo Anti-HBc se halla fuera del límite especificado, se puede no tenerlo en cuenta para el cálculo.

Los valores de extinción de los controles positivos, en cambio, deben estar ambos dentro del límite especificado. Si no se cumplen estos requisitos, hay que repetir la prueba.

Valoración de la prueba

La evaluación con el BEP® 2000 o con el BEP® III, se realiza automáticamente. Para esto consultar los manuales de operaciones. Los siguientes capítulos son para tener en cuenta en el caso de evaluaciones sin la ayuda del software.

Obtener el valor medio de las extinciones de los controles negativos.

Para calcular el valor límite, multiplicar el valor medio de extinción de los controles negativos por el factor 0,4.

–

E neg. x 0,4 = valor límite (cut off) Como zona límite se establece:

valor límite ± 10%

Según los criterios de la prueba, las muestras se clasifican de la siguiente manera: Resultado del test:

1. E_muestra > cut-off + 10% ^= negativo 2. E_muestra < cut-off + 10% ^= positivo

3. cut-off - 10% ≤ E_muestra≤ cut-off + 10% ^= valor límite

En casos de resultados con valor límite la prueba se repetirá esta vez en una doble determinación. Si en la repetición de la prueba ambas extinciones se hallan por encima o por debajo de la zona límite, no se tomará en cuente el valor límite inicial y la muestra se prodrá considerar como negativa o positiva respectivamente. Si, en cambio, en una o en ambas determinaciones de la repetición las muestras dan valores límites de extinción, se recomienda, para aclarar el resultado, una nueva determinación con una muestra extraída 2 a 4 semanas después de la primera.