Dado que la proteína se encuentra desplegada, nos propusimos determinar si la afinidad por el ARNdh es comparable a la de un dsRBD estructurado.
54 Para estudiar el equilibrio de unión con el ARNdh realizamos curvas de titulación en las que a una solución de ARN marcado con Fluoresceína en el extremo 5´ agregamos cantidades crecientes de proteína. La formación del complejo hace que aumente el tiempo de correlación rotacional de la sonda fluorescente dando como resultado un aumento en la anisotropía de la fluorescencia. El cambio en la anisotropía hace posible monitorear la titulación para finalmente calcular la constante de disociación del complejo.
Realizamos titulaciones de dos fragmentos de ARN diferentes, uno correspondiente a la región del dúplex miARN-miARN* y otro a la región del tallo inferior (pri-miR172a-ti), ambos del precursor de miR172a de A. thaliana (Figura 3.6).
Elegimos trabajar con el fragmento del tallo inferior debido a que su estructura secundaria es de gran importancia para el correcto procesamiento del precursor (Mateos et al. 2010). Este fragmento presenta varias imperfecciones en el apareamiento de bases. Este tipo de imperfecciones está presente en menor proporción en el fragmento que incluye al dúplex miR172-miR172*, lo cual los hace esencialmente diferentes en cuanto al reconocimiento de su estructura secundaria por parte de un dsRBD.
El resultado de estos ensayos se muestra en la Figura 3.6. El dominio DCL1-A, a pesar de estar desestructurado, une ARNdh con afinidades similares a las presentadas por otros dominios tipo dsRBD. Las Kd para los fragmentos estudiados fueron de 723 ± 250 nM para el dúplex miR172a/miR172a* y 300 ± 50 nM para el tallo inferior. La pequeña diferencia de afinidades sugiere que el dominio no estaría prefiriendo un tipo de estructura secundaria por sobre otro. Los valores obtenidos se resumen en la Tabla 3.1.
Como control negativo realizamos una titulación sobre un fragmento de ADNdh que se encontraba disponible en el laboratorio. Este fragmento consiste de dos oligonucleótidos simple hebra hibridados, un oligonucleótido marcado con Fluoresceína en el extremo 5´ y un oligonucleótido perfectamente complementario sin marca. Sorprendentemente, encontramos que la afinidad de DCL1-A por el ADNdh es similar a la que presenta por el ARNdh (Tabla 3.1), contrariamente a lo esperado para dominios de esta familia que son capaces de diferenciar entre ARNdh, ARNsh y ADN. Obtuvimos un resultado similar con el segundo dominio dsRBD de DCL1 (DCL1-B). En este caso atribuimos la versatilidad de DCL1-B a la alta flexibilidad de la cadena en la región correspondiente al extremo C-terminal de la hélice α1, donde se encuentra la región 1 de interacción con el sustrato en los dsRBDs canónicos (Burdisso et al. 2012). Por tratarse de una cadena altamente flexible, podemos aplicar este mismo razonamiento para DCL1-A.
Como control de nuestros ensayos determinamos paralelamente la afinidad del dsRBD1 de la proteína accesoria HYL1 (HYL1-A), un dsRBD canónico (Rasia et al. 2010), por los mismos ácidos nucleicos en las mismas condiciones. La constante de disociación para el complejo con ARN está dentro de los valores esperados, mientras que la del complejo con ADN no pudo ser determinada por ser mayor a 20 μM (Burdisso et al. 2012). Este resultado avala la metodología empleada para determinar las afinidades de los complejos con los dominios de DCL1.
Dado que se ha demostrado que los dsRBDs en tándem generalmente dan lugar a un aumento de la afinidad por el sustrato o especificidad en la unión respecto a los dominios aislados (Acevedo et al. 2015), repetimos estos mismos experimentos con la construcción DCL1-AB, que consiste en los dos dominios dsRBD de DCL1 unidos por el conector silvestre de la enzima. Las constantes de disociación obtenidas fueron de 67 ± 9 nM para el miR172a/miR172a*, 100 ± 11 nM para el pri-miR172a-ti y > 1 µM para el ADNdh.
55 Comparando los valores resumidos en al Tabla 3.1, concluimos que la afinidad por el ARNdh por parte del doble dominio es algo mayor que la de los dominios aislados, siendo esta diferencia más marcada para el dúplex miR172a/miR172a* que para el fragmento pri-miR172a-ti. Este aumento es esperable por ser que la construcción DCL1-AB presenta dos sitios de unión al sustrato que contribuyen a aumentar la afinidad. La diferencia en el aumento relativo de la afinidad por los diferentes sustratos (10 veces para el miR172a/miR172a* contra 3 veces para el tallo inferior) podría atribuirse a que el fragmento miR172a/miR172a* es tres pares de bases más largo que el pri-miR172a-ti, lo cual puede ser de menor importancia para la unión de los dominios aislados, pero puede influir en la unión del doble dominio por aumentar los impedimentos estéricos entre los dominios, resultando en un menor aumento en la afinidad relativa. Por otro lado es notoria la gran diferencia entre la afinidad por el ARNdh y el ADNdh por parte del doble dominio en comparación con los dominios aislados. Este resultado resulta interesante por ser el ARN, y no el ADN, el sustrato esperado para esta región de la enzima.
Figura 3.6 Determinación de la afinidad por el sustrato por anisotropía de la fluorescencia.
A. titulación con DCL1-A sobre miR172a/miR172a* (cuadrados), pri-miR172a-ti (círculos) y ADNdh (triángulos). B. titulación de DCL1-AB sobre los mismos sustratos.
Tabla 3.1 Constantes de disociación determinadas por anisotropía de la fluorescencia
miR172a/miR172a*
Pri-miR172a-ti
ADNdh
DCL1-A
723 ± 250 nM
300 ± 50 nM
860 ± 270 nM
DCL1-B
Ɨ810 ± 180 nM
350 ± 20 nM
600 ± 50 nM
DCL1-AB
67 ± 9 nM
100 ± 11 nM
> 1 µMHYL1-A
ƗND
Ca. 310 nM
> 20 μM
Ɨ(Burdisso, P., Suarez, I.P., Bologna, N.G., Palatnik, J.F., Bersch, B. & Rasia 2012)
Habiendo establecido que DCL1-A es capaz de formar un complejo con el ARNdh y que participa junto a DCL1-B en la selectividad por el sustrato, a pesar de encontrarse desplegada, continuamos nuestro estudio determinando la conformación adquirida por esta proteína en presencia del ligando.
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